Name: Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri l'analisi di flusso laminare per studiare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari e piastrine aderenti. Questo metodo economico e versatile aiuta a comprendere i meccanismi dell'adesione cellulare in condizioni di flusso.

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Ringraziamo la d. ssa Martin M. Schmitt e linea Fraemohs. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Paesi Bassi per la ricerca scientifica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fondazione per la ricerca di trasfusione di sangue (LSBR Nr. 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) assegnato a r.r.k.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dai medici etici e animale etico tavole dell'Università di Maastricht.
1. flow-Based Assay con le cellule umane
<ol><li>
Isolamento delle piastrine da sangue umano
	<ol>
<li>Prelievo di sangue venoso in anticoagulante citrato (3,2%).</li>
		<li>Aggiungere 15/1 volume di acido citrato destrosio (ACD: citrato trisodico 80 mM, 52 mM acido citrico e 183 mM glucosio) nel sangue.</li>
		<li>Centrifugare a 350 x g senza freno per 15 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 mL e aggiungere volume 1/20 di ACD.</li>
		<li>Centrifugare a 1.110 g senza freno per 15 min ottenere plasma povero di piastrine (PPP).</li>
		<li>Scartare il surnatante. Tagliare l'estremità della punta della pipetta (P 1000), rendendolo grande alesaggio, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e attentamente sospendere il pellet della piastrina nello stesso volume come PRP in tampone a pH della piastrina 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% di glucosio). Aggiungere volume 1/20 del ACD e mescolare delicatamente.</li>
		<li>A pellet le piastrine a 1.110 g senza freno per 15 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e attentamente sospendere le piastrine come sopra in 1 mL di tampone di piastrine (pH 7.5).</li>
		<li>Misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 con un analizzatore automatizzato di ematologia.</li>
		<li>Regolare il volume con tampone della piastrina (pH 7.5) per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento di cellule polimorfonucleari da sangue umano (adattato da Brinkmann et al. 11 )
	<ol>
<li>Disegnare 24 mL di sangue in eparina (10 U/mL) come anticoagulante.</li>
		<li>Aggiungere 6 mL di 1,077 g/mL liquido di densità polysucrose-sodium diatrizoate (Vedi Tabella materiali) a una provetta conica da 15 mL e attentamente livello 5-6 mL di sangue intero in cima.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno.</li>
		<li>Aspirare e scartare lo strato superiore giallastro limpida e trasferire la fase inferiore rossastra contenente granulociti in fresche provette coniche da 15 mL. Lavare le cellule con l'aggiunta di PBS contenente 2 mM EDTA ad un volume finale di 14 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare un mezzo del gradiente di densità (ad es., percoll, Vedi Tabella materiali) soluzione di lavoro mescolando 18 mL liquido gradienti di densità con 2 mL 10 x soluzione PBS. Diluire la soluzione di lavoro con PBS (1x) ottenere 4,25 mL ciascuna di 85%, 80%, 75%, 70% e 65% soluzioni di media pendenza.</li>
		<li>Preparare 2 provette coniche con il gradiente di densità di stratificazione 2 mL di ogni percentuale medio in cima a vicenda. Iniziare con la più alta concentrazione e continuare in ordine decrescente. Contrassegnare gli strati sul tubo con un pennarello resistente all'acqua.</li>
		<li>Strato attentamente 2 mL di sospensioni di cellule su ciascuno dei due gradienti preparati.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno in una centrifuga accuratamente equilibrata.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere lo strato superiore e la maggior parte del 65% (primo anello) di strato con PBMCs e raccogliere in nuovi tubi il bianco restanti le interfasi fino al livello 85% (secondo anello, PMN).</li>
		<li>Lavare le cellule da riempire i tubi con PBS 2 mM EDTA e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e sospendere le cellule sedimentate (≥ 95% sono in genere PMN) in 1 mL di tampone di Hank (pH 7,45), contenente 10 mM Hepes e 0,2% di albumina umana (tampone del saggio).</li>
		<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro e sospendere le cellule a 1 x 106/ml.</li>
		<li>Continuare con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di aderente della piastrina e monostrati di cellule vascolari
	<ol>
<li>
Preparazione del piatto cultura delle cellule (cellule coltivate)
		<ol>
<li>Pre-cappotto i piatti di cultura cellulare 35 mm con 1 mL diluito collagene coda di ratto (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).</li>
			<li>Incubare a 37 ° C per 30 minuti, eliminare la soluzione di collagene e lavare il piatto una volta con PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cultura delle cellule vascolari in piastre di coltura
		<ol>
<li>Staccare il primario (ad es., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) o cellule immortalizzate vascolare (ad es., EA. Hy926, SVEC) cresciuta alla confluenza in una boccetta di T75 con 1,5 mL soluzione di distacco delle cellule (per esempio, accutase). Aggiungere 4,5 mL di terreno di coltura appropriato per neutralizzare la soluzione di distacco delle cellule e determinare la concentrazione di cellule con una cella camera di conteggio. Sospendere le cellule a 0,5 x 105 cellule/mL nel terreno di coltura appropriato (ad es., mezzo di sviluppo completo delle cellule endoteliali).</li>
			<li>Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare ad ogni piatto di 35 mm. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 fino alla confluenza (assunzione di 24 – 48 h, a seconda del tipo di cellula).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparazione di vetro vetrino coprioggetti (aderente piastrine)
		<ol>
<li>Immergere il vetrino coprioggetti una volta in HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).</li>
			<li>Sciacquare il vetrino coprioggetto 2 volte in acqua ultrapura.</li>
			<li>Asciugare il vetrino coprioggetto N.2.</li>
			<li>Pre-cappotto il vetrino coprioggetti con 100 µ l, in conformità della posizione del canale della camera aspersione collagene coda di ratto diluito di tipo I (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).</li>
			<li>Incubare per 30 min a RT, scartare la soluzione di collagene e lavare il vetrino coprioggetto 3 x con PBS.</li>
			<li>Bloccare il coprioggetto di collagene rivestito con 1% BSA in HEPES per 0,5 h a TA.</li>
			<li>Lavare e asciugare il vetrino coprioggetto e montarlo nella camera di aspersione. Isolare le piastrine da umano o sangue del topo come illustrato nel passaggio 1.1 o 2.1, rispettivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immobilizzazione delle piastrine
		<ol>
<li>Aggiungere 70 µ l di una sospensione di piastrine/ml72 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
			<li>Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Stimolazione del monostrato cellulare vascolare
		<ol>
<li>Stimolare le cellule vascolari sostituendo i media freschi fluidi contenenti 10 ng/mL fattore di necrosi tumorale α (TNFα) per 4 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. flow-based test con cellule Murine
<ol><li>
Isolamento delle piastrine da sangue del topo
	<ol>
<li>Disegnare sangue dalla puntura cardiaca utilizzando un ago 21 G (~ 1 mL) da anestetizzati (ketamina 80 mg/kg e medetomidina 0,3 mg/kg) 6 – 8 settimana-vecchi topi (C57Bl/6) in citrato (3,2%) come anticoagulante.</li>
		<li>Aggiungere volume 1/6 di ACD.</li>
		<li>Centrifuga a 220 x g, freno medio per 5 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).</li>
		<li>Trasferire il surnatante (~ 600 µ l) più 1/3 dei globuli rossi ad un nuovo tubo</li>
		<li>Centrifugare a 95 x g senza freno per 6 min.</li>
		<li>Trasferire il surnatante (PRP) e misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 nel buffer di Tyrode (buffer di TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% glucosio) con un analizzatore automatizzato di ematologia.</li>
		<li>Lavare le piastrine aggiungendo volume 1/25 di ACD + 0,1 apyrase U/mL e centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e aggiungere 600 µ l di tampone di TH, 1/10 di volume di ACD e 0.1 apyrase U/mL. Tagliare la punta di dispensare (P 1000), rendendolo ampio foro, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e delicatamente sospendere il pellet.</li>
		<li>Centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min</li>
		<li>Scartare il surnatante e delicatamente sospendere le piastrine nel buffer di TH.</li>
		<li>Regolare il volume con buffer di TH per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di monostrati aderente della piastrina
	<ol>
<li>Preparare il vetrino coprioggetti (aderente piastrine) secondo 1.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilizzazione delle piastrine
	<ol>
<li>Aggiungere 100 µ l di una sospensione di piastrine/ml72 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		<li>Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimolazione di monostrato di piastrine del mouse
	<ol>
<li>Prima di aspersione dei leucociti (punto 3.3), stimolare le piastrine di aspersione della trombina (0,5 nM) nel buffer di HHHSA per 3 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (PMN o THP-1 per umani e RAW 264.7 o monociti del Mouse primario per l'analisi di flusso-base murino)
<ol><li>
Contrassegno fluorescente
	<ol>
<li>Etichettare i leucociti (1 x 106/mL) con la macchia di acido nucleico cellulare-permeante fluorescente verde (1 µM). Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS per centrifugazione a 300 x g per 5 min e sospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL (5 mL ogni condizione di test, a seconda della portata) nel tampone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di analisi di flusso camera
	<ol>
<li>Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa. Pre-riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.</li>
		<li>Prendere una siringa di aspersione (50 mL), installare siringa sul titolare di siringa, set ritirare la pompa su e modalità. Impostare il volume di pompa a 0 mL e impostare il diametro a 26,70 mm per la siringa da 50 mL.</li>
		<li>Collegare un connettore luer a gomito a un'estremità del tubo. Posizionare un accoppiatore di blocco luer della siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito per l'accoppiatore di luer lock. Collegare l'estremità libera della tubazione alla camera di flusso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adesione e l'aspersione del leucocita
	<ol>
<li>Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa.</li>
		<li>Per aspersione del leucocita e adesione sopra un vascolare- o monostrato di piastrine, posizionare il secondo tubo in una provetta conica 50 mL contenente tampone di dosaggio e riempimento della tubazione con pipetta da 1 mL, poi spremere il tubo e collegarlo a una camera di flusso.</li>
		<li>Prima dell'aspersione del leucocita, aggiungere 3 mM CaCl2 e 2 mM MgCl2 alla sospensione cellulare e incubare per 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Irrorare il tampone prima dell'aspersione delle cellule per rimuovere l'aria possibile dall'aula e tubazione.</li>
		<li>Chiudere le estremità del tubo stringendo loro stretto e passare tubi da tampone del saggio di sospensione cellulare, impedendo che le bolle d'aria intrappolata. Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/sollecitazione di taglio fino a quando arrivano le prime cellule.</li>
		<li>Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/shear stress per 2 min e catturare almeno 6 immagini tra 2 – 6 min di rotolamento e aderente cellule con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es., EVOS-FL) con 100 ingrandimenti collegato fotocamera digitale CCD o CMOS. Nota: Flusso tasso/sollecitazione di taglio dipende da dimensioni camera di flusso e viscosità di perfusato. Per aspersione camera utilizzata qui (Vedi Tabella materiali): Τ =η* 97.1*Φ Τ: sollecitazione di taglio (1 dine/cm2) Η: viscosità (0,015 dyn * s/cm2) Φ: portata (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-adesione del leucocita
	<ol>
<li>Per de-adhesion, passare la tubazione dalla sospensione cellulare a tampone schiacciando il tubo, impedendo la diventando intrappolate bolle d'aria.</li>
		<li>Staccare le cellule mediante perfusione con tampone del saggio con un'appropriato flusso tasso/sollecitazione di taglio (Vedi 3.3.7 Nota).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasmigrazione leucocitaria
	<ol>
<li>Per trasmigrazione leucocitaria, irrorare leucociti (passaggio 3) fino a una quantità adeguata di leucociti aderiscono (~ 50 cellule/vista campo).</li>
		<li>Sostituire sospensione del leucocita con tampone del saggio.</li>
		<li>Registrare le cellule trasmigra da lasso di tempo ogni 10 – 15 s per 30 – 60 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
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<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo test in vitro è un semplice metodo per indagare i meccanismi di reclutamento leucocitario durante l'infiammazione vascolare, ma ci sono alcuni punti critici deve essere notato. Il primo requisito per eseguire correttamente questo dosaggio è la perfusione dei leucociti sopra un intatto e confluenti vascolari o monostrato di piastrine. Questo può essere ottenuto previo rivestimento delle superfici con collagene di tipo I. In generale, quando si lavora con cellule primarie vascolari, è importante staccare de...

Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all'agente patogeno o danni associata - molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l'ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l'adesione del leucocita carenza1. L'adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 19902,3. L'adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all'endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l'attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l'associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto4. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.
Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l'aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all'occlusione del vaso5. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un'arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all'interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l'ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (αMβ2) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi8.
Data l'ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l'ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri9. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica10. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell'aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l'aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l'indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita, ad es. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump ad es. modello: 210-CE</td><td>&nbsp; world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Trattato TC Stile Easy-Grip Piastra</td> per colture cellulari <td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Gomito Luer Connettore maschio</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>femmina Luer Lock Accoppiatore</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Camera di flusso</td><td>Ospedale universitario RWTH Aachen</td><td></td><td>Brevetto DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Chen. 2005.</td></tr><tr><td>Ibidi vetrino adesivo VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti per vetrini adesivi&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Umano TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Attivatore del recettore della trombina per il peptide 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 colorante fluorescente verde dell'acido nucleico</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES soluzione tampone 1M, liquido</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATO Albumina, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per preparazioni iniettabili</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apirasi</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali endoteliali (pronto all'uso)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali aortiche umane primarie (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Terreno basale a cellule vascolari&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la crescita delle cellule endoteliali-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Cellule muscolari lisce dell'aorta umana primaria (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la crescita delle cellule muscolari lisce vascolari ATCC</td><td></td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare endoteliale umana, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Terreno di Eagle modificato (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare endoteliale di topo, SV 40 trasformata (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare monocitica umana, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con Ultra-Glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Monocita/macrofago di topo RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto glucosio</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Provette per la raccolta del sangue in plastica Vacutainer con eparina di sodio</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>TUBO VACUETTE 9 ml 9NC Citrato di sodio della coagulazione 3,2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>miscela HCl/EtOH (1,2 mol/L HCl e 50% di etanolo) in acqua</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Preparare miscelando 0,3 L di HCl (4 mol/L) con 0,7 L di etanolo al 70% v/v in una cappa</td><td></td></tr></tbody></table> aspirante

analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Il reclutamento dei leucociti su lesioni o infiammazione ai siti di lesione o danno tissutale è stato studiato durante gli ultimi decenni ed ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita. Tuttavia, l'esatti meccanismi molecolari coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati ancora completamente identificati. Dal momento che il reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) ricerca immune, presentiamo un semplice test a flusso laminare per studiare meccanismi di fondo dell'aderenza, de-adesione, e trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. L'analisi in vitro può essere usata per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulare in diversi modelli di infiammazione vascolare. Questo protocollo descrive un'analisi basata su flusso laminare usando una camera di flusso parallelo ed un microscopio invertito di contrasto di fase collegato ad una macchina fotografica per studiare le interazioni dei leucociti e cellule endoteliali o piastrine, che possono essere visualizzate e registrate poi analizzati non in linea. Le cellule endoteliali, piastrine o dei leucociti possono essere pretrattati con inibitori o anticorpi per determinare il ruolo di specifiche molecole durante questo processo. Condizioni di taglio, cioè arteriosi o venosi shear stress, possono essere facilmente adattate dalla viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale.

Per studiare l'adesione del leucocita endoteliale, cellule THP-1 fluorescente identificate sono state irrorate sopra un monostrato endoteliale TNFα o non stimolato per 2 min a 3 dyne/cm2. Il numero totale delle cellule monocytic aderenti era risoluto dopo 2 min di aspersione catturando 6 campi indipendenti per un periodo di 2-6 min. Le celle aderenti sono state quantificate in almeno 6 immagini catturate con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es.</em...

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare i meccanismi alla base delle interazioni dei leucociti con le cellule vascolari aderenti o le piastrine in condizioni di flusso. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio il modo in cui i leucociti vengono reclutati nei siti di infiammazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica, facile da usare e consente lo studio di una grande varietà di condizioni sperimentali.Questo metodo può fornire informazioni sull'adesione dei leucociti. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'adesione di cellule tumorali a cellule immobilizzate o substrati in condizioni di flusso. A dimostrare la procedura sarà Annemiek Dickhout, ingegnere e dottoranda che lavora nel mio laboratorio.Dopo aver ottenuto i campioni di sangue, aggiungere 1/15 del volume di destrosio citrato acido al sangue. Quindi, centrifugare il campione di sangue impostando i freni a 350 volte g per 15 minuti per ottenere plasma ricco di piastrine. Quindi trasferire il surnatante ottenuto in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere 1/10 del volume di destrosio citrato acido.A

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

La cascata l'adesione delle piastrine avviene in presenza di flusso di taglio, non un fattore contabilizzati nel convenzionali (statici) ben piastra saggi. Questo articolo riporta una aggregazione delle piastrine-test utilizzando un microfluidica ben piastra formato di emulare fisiologiche condizioni di flusso di taglio.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L'adesione delle cellule ', morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l'analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l'esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Questo video mostra un test basato sul flusso laminare per caratterizzare l'interazione tra leucociti e partner cellulari come le cellule endoteliali. Questo metodo fornisce informazioni dinamiche sull'adesione, la deadesione e la trasmigrazione dei leucociti quando perfusi su uno strato intatto e confluente di cellule vascolari.

Un test basato sul flusso laminare per studiare le interazioni tra leucociti e cellule endoteliali

Il video dimostra un metodo per studiare l'impatto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti. In un modello di camera a flusso a piastre parallele, le citochine pro-infiammatorie inducono l'espressione di recettori di adesione da parte delle cellule endoteliali, facilitando il reclutamento e la migrazione dei neutrofili. Il cross-talk tra le cellule stromali e le cellule endoteliali diminuisce il reclutamento dei neutrofili nelle cellule endoteliali.

Un'indagine sul flusso in vitro dell'effetto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti

Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow Camera

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Scopri l'analisi di flusso laminare per studiare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari e piastrine aderenti. Questo metodo economico e versatile aiuta a comprendere i meccanismi dell'adesione cellulare in condizioni di flusso.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

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