Name: Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule tumorali iniziatrici da xenotrapianti di sarcoma umano mediante FACS utilizzando HLA-I come marcatore negativo. Questo metodo consente di identificare cellule con proprietà staminali e potenziale terapeutico.

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Questa ricerca è stata supportata da NCI-P01-CA087497 (a C.C.-C. e D.H.) e NIH-U 54-0OD020353 (a C.C.-C., D.H. e J.D.-D.), il Agilent Thought Leader Award (a C.C.-C.) e la Martel Foundation (a C.C.-C. e J.D.-D.).

Tutti i protocolli per gli esperimenti sui topi discussi qui sono stati conformi alle linee guida istituzionali e approvati dal Mount Sinai Medical Center Institutional Human Research Ethics Committee e dal Animal Care and Use Committee.
1. Elaborazione del campione di tessuto Sarcoma e formazione PDX
<ol><li>In base a un protocollo approvato dal Consiglio di Revisione Istituzionale, il personale del servizio di patologia prepari campioni di sarcoma da campioni di chirurgia e mette immediatamente ogni campione sul ghiaccio in una parabola Petri da 100 mm.</li>
	<li>Collocare il campione in un tubo conico in polistirolo da 15 mL con 6 mL di freddo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 coltura medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina. Elaborare immediatamente il campione di tessuto.</li>
	<li>
(Facoltativo) Solo per l'osteosarcoma, seguire i seguenti passaggi, che possono essere saltati per il sarcoma dei tessuti molli.
	<ol>
<li>Tagliare il tessuto in 20 mm3 pezzi con un bisturi. Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo da 15 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenana (RPMI 1640 con 1 collagenae mg/mL).</li>
		<li>Mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
		<li>Vorticare accuratamente il tubo e, quindi, aggiungere 3 mL di RPMI 1640 integrato con 10% FBS per neutralizzare l'attività collagenase.</li>
		<li>Centrifuga per 5 min a 350 x g a temperatura ambiente. Togliete il super-acletterante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavorando in un armadio sterile di biosicurezza, posizionare il campione di tessuto in una parabola Petri da 100 mm. Aggiungere al tessuto 500 - L di salina sterile 1x con buffer fosfato (PBS). Con un bisturi sterile, triturare meccanicamente il tessuto in piccoli pezzi fino a quando nessun pezzo di tessuto visibile è più grande di 0,1 mm.</li>
	<li>Trasferire la sospensione a celle da 500 litri in un colino da 35 m e raccogliere la sospensione filtrata con un tubo di polistirolo da 50 mL. Metti questo tubo di polistirolo da 50 ml con la sospensione cellulare sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere altri 500 l di PBS al tessuto. Triturare per la seconda volta, trasferire la sospensione attraverso il colino cellulare, e raccoglierlo nello stesso tubo da 50 mL.</li>
	<li>Ripetere questi passaggi (passaggi da 1,5 a 1,6) fino a completa dissociazione della sezione tissutale, di solito da 6x a 8x.</li>
	<li>Pellet la sospensione cellulare per centrifugazione a 350 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il supernatante, risospendere il pellet utilizzando 5 mL di tampone di emolisi (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA), e incubare la soluzione per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere i globuli rossi.</li>
	<li>Centrifuga per 5 min a 350 x g a temperatura ambiente e rimuovere il tampone di emolisi. Lavare il pellet con 5 mL di PBS. Centrifuga di nuovo per 5 min a 350 x g e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet con 1 mL di PBS e contare il numero di cellulare vitale utilizzando un emocitometro o qualsiasi altro metodo alternativo. Diluire le cellule a una concentrazione finale di 1 x 107 cellule in 200 - L di PBS. Lasciare la sospensione cellulare sul ghiaccio.</li>
	<li>Lasciare la matrice della membrana del seminterrato sul ghiaccio per lasciarla sciogliere. Aggiungere 200 l di matrice di membrana del seminterrato alla sospensione cellulare 200. Mescolare delicatamente e tenere sul ghiaccio.</li>
	<li>Inietta sottocutaneamente la miscela di sospensione cellulare: matrice di membrana del seminterrato (1:1) in due topi NOD scid gamma (NSG) nei loro fianchi. Utilizzare 200 gradi L per ogni iniezione.</li>
	<li>Monitorare la formazione PDX controllando il sito di iniezione dei topi 2x a settimana. Rimuovere lo xenotrapianto tumorale quando raggiunge 1 cm di diametro.</li>
</ol>2. Isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore da PARTE del FACS dal PDX
<ol><li>Rimuovere chirurgicamente il PDX dai topi come descritto in precedenza12.</li>
	<li>Taglia il tumore a metà. Fissare metà della xenotrapianto con il 4% di paraformaldeide durante la notte. Questo è per l'analisi istologica. Elaborare l'altra metà del tessuto come descritto sopra (passaggi 1.3–1.8) per ottenere una sospensione delle cellule tumorali.</li>
	<li>Risospendere il pellet con PBS e contare il numero di cellulare vitale.</li>
	<li>Diluire la sospensione cellulare in PBS integrata con 5% FBS ad una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL. Lasciare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 30 min. Contrassegnare i tubi rispettivamente con il controllo degli isotopi e l'anticorpo. Si noti il numero di celle in ogni tubo.</li>
	<li>Preparare 2x anticorpo HLA-1-PE diluindo l'anticorpo con PBS integrato con 5% FBS (1:250). Diluire l'anticorpo di controllo dell'isotipo negativo con la stessa condizione. Mescolare la sospensione cellulare dal tubo "anticorpo" con anticorpo diluito (1:1) per rendere la diluizione dell'anticorpo finale 1:500. Mescolare la sospensione cellulare dal tubo "controllo isotopo" con il controllo isotopo (1:1). Mettere le sospensioni cellulari sul ghiaccio per 90 min.</li>
	<li>Centrifuga per 5 min a 350 x g a 4 gradi centigradi e rimuovere il super-natante. Aggiungere 10 mL di PBS per lavare il pellet 2x.</li>
	<li>Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilitinal (DAPI) alla PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Aggiungere questa soluzione DAPI al pellet cellulare per creare una sospensione cellulare di 107 celle / mL (utilizzando i numeri di cella del passaggio 2.4).</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso tappi di 35 m in tubi in polistirolo da 12 mm x 75 mm.</li>
	<li>Utilizzare un citometro di flusso per ordinare la sottopopolazione TIC HLA-1-negative6. Gate cellule vitali (DAPI-negativo) e raccogliere sia HLA-1-negativo e -positivo sottopopolazioni in due tubi di raccolta 15 mL, ciascuno contenente 4 mL di RPMI 1640 mezzo di coltura.</li>
</ol>3. Caratterizzazione delle cellule che hanno invitato il tumore
<ol><li>Formazione di sarcosfera
	<ol>
<li>Rendere la sarcosfera di crescita media, utilizzando il mezzo di coltura cellulare alfa-MEM. Aggiungere integratori per fare una concentrazione finale di B-27 integratori (1x), N2 integratori (1x), fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF) (20 ng/mL), e fattore di crescita epidermico (EGF) (20 ng/mL) e penicillina /streptomycin (100 IU/mL). Filtrare il mezzo con un filtro di coltura cellulare di 0,2 m prima dell'uso.</li>
		<li>Pellet il sottopopolamento HLA-1-negativo e -positivo ordinato dal punto 2.9 e conta i numeri di cella di ogni sottopopolazione.</li>
		<li>Diluire 1,5 x 106 cellule in 15 mL del mezzo di crescita della sarcosfera per rendere la diluizione cellulare di 1 x 105 cellule /mL.</li>
		<li>Diluire in modo seriale le cellule con un nuovo mezzo di crescita di sarcosfera per fare 15 mL di ogni diluizione cellulare di 104, 103e 102 celle / mL. Quindi, preparare quattro piastre di coltura cellulare allegato ultra-basso 96-pozzo, ciascuna per una diluizione cellulare.</li>
		<li>Trasferire 100 l di sospensione cellulare da 105 celle/mL di diluizione a ciascun pozzo della prima piastra di coltura cellulare a fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti. Questa piastra ha 104 cellule in ogni pozzo.</li>
		<li>Utilizzare le altre tre piastre di coltura cellulare ad attacco ultra-basso del 96-well per le altre tre diluizioni cellulari: 104, 103e 102 celle / mL. Trasferire 100 l di sospensione cellulare in ogni pozzo delle piastre di coltura cellulare a fissaggio ultra-basso di 96 pozzetto. Queste tre piastre di coltura hanno 1.000 cellule / bene, 100 cellule / bene, e 10 cellule / bene, rispettivamente.</li>
		<li>Mettere le piastre in un incubatore di coltura cellulare 37 gradi centigradi, 5% CO2.</li>
		<li>Aggiungere nuovi bFGF ed EGF direttamente al mezzo di coltura cellulare (concentrazione finale di 20 ng/mL) ogni tre giorni senza modificare il mezzo per evitare la perdita di cellule nella coltura delle sospensioni.</li>
		<li>Utilizzando un microscopio luminoso, monitorare la formazione di sarcosfera ogni giorno per tre settimane, come mostrato nella Figura 2A.</li>
		<li>Dopo tre settimane, contare il numero di pozzi positivi alla sarcosfera e pozzi negativi della sarcosfera di ogni diluizione cellulare sia per le cellule HLA-1-negative che per quelle HLA-1-positive.</li>
		<li>Calcolare la frequenza cellulare che forma la sfera in base a una distribuzione di probabilità di Poisson13. Confrontare i TC HLA-1-negativi con le cellule sfuse HLA-1-positive.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio di formazione del tumore di diluizione seriale
	<ol>
<li>Contare le sottopopolazioni HLA-1-negativo e -positivo dal punto 2.9.</li>
		<li>Effettuare diluizioni seriali delle celle con PBS a concentrazioni di 106, 105, 104e 103 celle /mL. Utilizzare 1 mL di ogni diluizione per la formazione del tumore in 10 topi.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di matrice di membrana interrata alla sospensione cellulare da 1 mL di ciascuna diluizione (1:1). Mantenere i 2 mL di ogni miscela sul ghiaccio.</li>
		<li>Iniettare sottocutaneamente 200 - L della miscela di matrice della membrana cellulare-basement nei fianchi dei topi NGS, utilizzando cellule HLA-1-negativo per un fianco e cellule HLA-1-positive per l'altro fianco dello stesso topo. Per ogni diluizione, utilizzare 10 topi. Utilizzare siringhe 25G con ago per le iniezioni.</li>
		<li>Monitorare la formazione del tumore nei topi per quattro-otto settimane, a seconda del tasso di crescita del tumore.</li>
		<li>Calcolare la frequenza cellulare che ha intuito il tumore in base alla percentuale di formazione del tumore a diversi numeri di cellule di input. Confrontare i TC HLA-1-negativi con le cellule sfuse HLA-1-positive.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione indotta lungo percorsi mesenchymi
	<ol>
<li>Utilizzare le sarcosfere formate durante i passaggi precedenti (passaggio 3.1.9). Trasferire le sarcosfere in una nuova piastra di 6 pozze. Coltura la sarcosfera con 2,5 mL di alfa-MEM integrato con 10% FBS per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie della piastra di coltura.</li>
		<li>Dopo un attaccamento per due giorni, cambia il mezzo di coltura da alfa-MEM integrato con il 10% di FBS alla miscela 1:1 di alfa-MEM integrata con il 10% Di FBS e il mezzo di crescita delle cellule staminali umane mesenchiche (hMSC).</li>
		<li>Dopo due giorni, passare al mezzo di crescita hMSC completo.</li>
		<li>Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, aspirate il mezzo hMSC e aggiungete il mezzo di differenziazione. Per la differenziazione osteogenica, aggiungere il mezzo di differenziazione osteogenica (mezzo di crescita hMSC integrato con 10 nM di dexamethasone, 5 mM-glicerofosfato, 50 g di acido l-ascorbico e 10 mM di cloruro di litio). Per la differenziazione lipogenica, aggiungere il mezzo di differenziazione degli adipociti (mezzo di crescita hMSC integrato con 0,5 m dexamethasone, 0,5 isobutylmetilxanthine e 50 M indomethacin).</li>
		<li>Cambiare il supporto di differenziazione ogni tre giorni.</li>
		<li>Dopo tre o quattro settimane, interrompere la differenziazione e lavare le cellule con PBS. Quindi, aspirare il PBS e aggiungere 2 mL di 10% formalina alle cellule per la fissazione. Lasciate che le cellule si siedano per 45 min a temperatura ambiente. Lavarli con acqua deionizzata. Le celle sono ora pronte per la colorazione Alizarin Red S (passaggio 3.3.6.1) o la colorazione O Rossa dell'olio (passaggio 3.3.6.2).<ol>
<li>Per rilevare la differenziazione osteogenica, eseguire la colorazione Alizarin Red S. Aspirare acqua e aggiungere 2 mL di soluzione di lavoro Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) alle cellule, e lasciarli a sedersi per 5 min per la colorazione. Lavare le cellule con acqua deionizzata e osservare la reazione al microscopio.</li>
			<li>Per rilevare la differenziazione adipogenica, eseguire la colorazione Oil Red O.<ol>
<li>Crea una soluzione OO Rosso Olio. Preparare una soluzione di magazzino aggiungendo 300 mg di polvere O rosso olio a 100 mL di isopropanolo.</li>
				<li>Entro 2 h prima dell'uso, mescolare tre parti (30 mL) di olio Red O soluzione di stock con due parti (20 mL) di acqua deionizzata. Lasciare riposare la miscela per 10 min a temperatura ambiente.</li>
				<li>Filtrare la soluzione di lavoro utilizzando prima dell'uso.</li>
				<li>Rimuovere l'acqua dalle cellule preparate secondo il passaggio 3.3.6. Aggiungere 2 mL di 60% isopropanolo per coprire il monostrato cellulare e le cellule siedano per 2 min.</li>
				<li>Rimuovere l'isopropanol e aggiungere 2 mL di olio Red O soluzione di lavoro. Lasciare che le cellule si siedano per 5 min a temperatura ambiente.</li>
				<li>Sciacquare le cellule con acqua deionizzata e osservare la reazione al microscopio leggero.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici che limitano il successo di questo protocollo per isolare e caratterizzare le cellule che invitano a tumore dal sarcoma umano PDX. Abbiamo osservato che la formazione di PDX dipende fortemente dai sottotipi di sarcoma. Sarcomi clinici aggressivi con un fenotipo istologicamente indifferenziato (ad es., sarcoma pleomorfica indifferenziata [tasso di successo 100%, n - 2], liposarcomas disdifferenziati [tasso di successo 100%, n - 2] e sarcomi sinoviali [ tasso di successo 100%, n - 3]) hanno un alto tasso di successo della formazione PDX. Nel frattempo, i sarcomi con fenotipi differenziati (ad es. liposarcomi ben differenziati [tasso di successo 0%, n - 3]) mostrano tassi di formazione PDX più bassi. È possibile che le cellule che provocano tumori siano presenti in sottotipi più maligni a una percentuale più alta rispetto a sottotipi meno maligni e differenziati. Inoltre, si consiglia di completare la procedura di isolamento cellulare di avviamento del tumore entro un giorno senza alcun arresto per ridurre al minimo qualsiasi perdita di vitalità cellulare.
Abbiamo identificato che le cellule HLA-1-negativo esistono ampiamente nei sarcomi umani. Ma la percentuale di cellule HLA-1-negativo può variare tra i campioni di diversi pazienti. Con questo metodo, abbiamo isolato con successo le cellule che hanno avuto come intuimento del tumore da campioni che hanno cellule HLA-1-negative che vanno da meno dello 0,5% a più del 30%12. È importante caratterizzare le cellule HLA-1-negative funzionalmente dalla formazione della sfera e dai saggi di formazione del tumore per confermare l'identità cellulare che ha invitato il tumore delle cellule isolate HLA-1-negativo.
Tuttavia, il protocollo qui presentato presenta anche delle limitazioni. I dati precedenti hanno mostrato che l'espressione di HLA-1 è regolata epigeneticamente, il che è coerente con l'osservazione dell'eterogeneità cellulare dell'espressione HLA-1 all'interno dello stesso tumore12. Sono state rilevate mutazioni genomiche dell'HLA-1 nei sarcomi e in altri tipi di cancro. Le mutazioni nei geni HLA-1 possono portare alla completa perdita di HLA-1 sulla superficie cellulare nell'intero tumore o all'espressione di HLA-1 mutato non funzionante. In entrambi i casi, la negatività HLA-1 non può essere utilizzata per identificare i TIC all'interno del tumore.
Utilizzando HLA-1 come marcatore negativo, abbiamo isolato con successo i TIC da una varietà di sottotipi di sarcoma umano e convalidato i nostri risultati mediante analisi funzionale. Così, siamo stati in grado di eseguire studi molecolari tra cui l'analisi dell'espressione genica sui CPC, al fine di sviluppare un trattamento specifico mirato a questi CC.

L'eterogeneità cellulare intratumorale dei tumori umani è stata supportata da prove crescenti durante l'ultimo decennio1. Simile al tessuto normale, il tessuto tumorale è costituito da una piccola sottopopolazione di TIC (chiamati anche cellule staminali tumorali), che mostrano capacità di formazione del tumore; nel frattempo, la maggior parte delle cellule tumorali presentano fenotipi differenziati2. Questi TIC mostrano proprietà simili a cellule staminali, tra cui l'espressione di un marcatore di cellule staminali e la capacità di auto-rinnovamento e divisione cellulare asimmetrica, e quindi, può avviare la formazione di un tumore eterogeneo cellulare3. Recenti studi hanno rivelato che i TIC non sono solo responsabili dell'avvio tumorale, ma sono anche associati all'aggressività tumorale4, metastasi5e resistenza ai farmaci6. Pertanto, è importante comprendere la biologia dei CC e, quindi, sviluppare una strategia di trattamento specifica mirata a questi CPC.
I metodi basati su FACS sono stati utilizzati per identificare i TIC utilizzando i marker TIC, tra cui CD133, CD24 e CD441. La maggior parte di questi marcatori sono espressi anche nelle normali cellule staminali7. Tuttavia, nessuno di questi marcatori segna esclusivamente i TIC. I ruoli che queste molecole svolgono nella malignità dei CCI non sono ancora chiari. Ad esempio, IL CD133 può essere spesso inattivato dalla metilazione del DNA, e quindi questa eterogeneità intertumorale può rendere l'accuratezza di questi marcatori8. ALDH1 è un marcatore che funziona anche per mantenere lo stelo dei TIC9. Sembra essere più efficace nell'identificare i TIC del cancro al seno, ma è ancora discutibile in altri tipi di tumore9. Alcuni percorsi di segnalazione svolgono un ruolo importante nella biologia delle cellule staminali, tra cui Wnt (sito di integrazione senza ali), TGF-z (trasformare il fattore di crescita beta) e Hedgehog1. Ma è difficile dimostrare che questi percorsi sono specifici del TIC e utilizzare l'attività di questi percorsi per isolare i TIC dai tumori primari. Pertanto, è urgentemente necessario un nuovo marcatore TIC affidabile.
L'MHC umano di classe I, chiamato anche HLA-1, è una proteina della superficie cellulare espressa in quasi tutte le cellule nucleate10. HLA-1 funziona come un antigene che presenta una molecola che è specificamente riconosciuta dalle cellule T CD810. L'effetto citotossico delle cellule T CD8 può essere attivato quando le cellule tumorali presentano un antigene tumorale da HLA-1. Pertanto, la mancanza di HLA-1 sulla superficie cellulare delle cellule tumorali può portare a una fuga immunitaria dalle cellule T CD8 citotossiche. La downregolazione di HLA-1 è stata descritta in diversi tipi di cancro umano ed è correlata con prognosi, metastasi e resistenza ai farmaci11. Abbiamo dimostrato che la perdita di espressione HLA-1 sulla superficie cellulare può essere utilizzata per identificare i TIC nei sarcomi, così come nel cancro alla prostata6,12.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare i TIC dal sarcoma umano PDX da FACS, utilizzando HLA-1 come marcatore negativo, e per convalidare ulteriormente e caratterizzare questi TC HLA-1-negativi.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; filtro per coltura cellulare m</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri da 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>provetta conica da 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; filtro cellulare m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>provetta in polistirene da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti con attacco ultrabasso</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo HLA-1-PE</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>mezzo di crescita hMSC</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>isobutilmetilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich W292907</td> Anticorpo per il <td>controllo dell'isotipo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NSG topi</td><td>The Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Siringa con ago</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da sarcoma xenotrapianto derivato dal paziente

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

L'esistenza e l'importanza delle cellule che provocano tumori (TCI) sono state supportate da prove crescenti nel corso dell'ultimo decennio. Questi TIC hanno dimostrato di essere responsabile per l'avvio del tumore, metastasi, e la resistenza ai farmaci. Pertanto, è importante sviluppare una terapia specifica di targeting TIC oltre alle attuali strategie di chemioterapia, che si concentrano principalmente sulla maggior parte dei non-TIC. Al fine di comprendere ulteriormente il meccanismo alla base della malignità dei CC, descriviamo un metodo per isolare e caratterizzare i TIC nei sarcomi umani. Qui, mostriamo un protocollo dettagliato per generare xenopitrali derivati dal paziente (PDX) di sarcomi umani e per isolare i TIC mediante lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando la classe di antigene leucocito umano I (HLA-1) come marcatore negativo. Inoltre, descriviamo come caratterizzare funzionalmente questi TIC, tra cui un saggio di formazione della sfera e un test di formazione del tumore, e per indurre la differenziazione lungo le vie mesenchymic. L'isolamento e la caratterizzazione dei TIC PDX forniscono indizi per la scoperta di potenziali reagenti terapeutici mirati. Inoltre, sempre più prove suggeriscono che questo protocollo può essere ulteriormente esteso per isolare e caratterizzare i CCI da altri tipi di tumori umani.

Un sarcoma umano PDX è stato generato e macchiato. L'eterogeneità intratutale è stata dimostrata dall'immunostochimica usando anticorpi HLA-1. Lo xenotrapianto consisteva in due distinte sottopopolazioni, vale a dire HLA-1 positivo e negativo (Figura 1A)12. Il sarcoma PDX ha mostrato somiglianze istologiche con il tumore primario della genitoriale (Figura 1A). Sarcoma PDX TIC sono stati isolati dalla FACS. Utilizzando un metodo di ordinamento doppio, le cellule HLA-1-negativo sono state altamente arricchite dalla popolazione di cellule parentali (Figura 1B)12.
I geni espressi nelle cellule staminali (ad esempio, Oct4, Nanog e Myc) sono stati trovati altamente espressi in cellule isolate HLA-1-negativo rispetto alla loro controparte HLA-1-positiva (Figura 1C). Sox-9, un gene dello sviluppo segnalato per svolgere un ruolo importante in altre cellule staminali tumorali, come nel carcinoma mammario, sono stati specificamente espressi in cellule HLA-1-negativo (Figura 1D).
Per convalidare la sottopopolazione isolata HLA-1-negativo, è stato eseguito un saggio di formazione di sarcosfera per esaminare la capacità di auto-rinnovamento delle cellule. Le cellule HLA-1-negativo sono state in grado di formare sfere con un input iniziale di appena 10 celle (Figura 1E)12. Al fine di esaminare la capacità di formazione del tumore, è stato eseguito un saggio di formazione del tumore di diluizione seriale. Gli stessi numeri di cellule HLA-1-negativo e -positivo sono stati iniettati sottocutaneamente in ogni fianco dello stesso topo. Le cellule HLA-1-negativo hanno mostrato una capacità di formazione del tumore significativamente più elevata (Figura 1F)12, mentre gli xenografi formati da sottopopolazioni HLA-1-negativi e -positivi erano tumori eterogenei cellulari (Figura 1H).
Abbiamo eseguito un'analisi genica dei TIC isolati HLA-1-negativi12. I geni associati alla normale differenziazione cellulare mesenchimale sono stati elevati nei TIC12. Così, abbiamo anche testato se HLA-1 TICs può essere indotto alla differenziazione terminale e provocare una diminuzione della capacità di formazione del tumore. I risultati hanno mostrato che le cellule HLA-1-negativo possono essere indotte a differenziarsi lungo vie lipogeniche e osteogeniche e mostrano forti macchie di O rosso olio e Alizarin Red S (Figura 1G). Al contrario, le cellule HLA-1-positive non si differenziano nelle stesse condizioni. Pertanto, questi risultati indicano una promettente strategia di terapia differenziata che può essere utilizzata per indirizzare i TIC di sarcoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> Figura 1: Isolamento delle cellule HLA-1-negativo dai PDX del sarcoma eterogeneo intratutale. (A) Le cellule HLA-1-negative (frecce) sono state trovate in diversi sottotipi di sarcomi umani per immunohistochimica (IHC). (a e b) Sarcoma cellulare chiaro. (c e d) Liposarcoma pleomorfico. (e e f) Leiomyosarcoma. (g e h) Tumore maligno di intasia del nervo periferico. (i e j) Liposarcoma, non specificato diversamente. (k e l) Liposarcoma didifferenziato. Barra di scala (B) I Sarcoma PDX erano istologicamente simili al tumore dei genitori (ematossialina e eosina [stain H&amp;E]) e mostravano l'eterogeneità cellulare nell'espressione HLA-1 di IHC. Qui sono mostrate immagini rappresentative di sarcoma PDX, tra cui un sarcoma a cellule chiare (CCS), un condrosarcoma disdifferenziato (DCS), e un liposarcoma disdifferenziato (DDL). Barra di scala - 100 m. (C) La sottopopolazione di cellule HLA-1-negativo è stata isolata dalla citometria di flusso con un metodo a doppio ordinamento. Dall'alto verso il basso: primo ordinamento, secondo ordinamento e controllo di purezza. Le cellule isolate HLA-1-negativo e HLA-1-positive sono state sottoposte a una successiva analisi funzionale, incluso un test di formazione del tumore. I risultati di questa cifra provengono da una precedente pubblicazione12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione dei TIC HLA-1-negativi mediante saggi funzionali. (A) Un saggio di formazione di sfere ha mostrato che solo 10 cellule HLA-1-negativo erano in grado di formare sfere di sarcoma. Sinistra: immagini rappresentative delle sfere di sarcoma. A destra: frequenza di formazione della sfera; media : barra della scala SD . Qui mostrate sono immagini rappresentative del tumore formato da hLA-1-negativo e -positivo cellule da DDL. Un migliaio di cellule di cellule DDL HLA-1-negativo e HLA-1-positivo sono state iniettate in fianchi separati dello stesso topo. (C) I livelli di mRNA dei geni delle cellule staminali Oct4, Nanoge Myc sono stati espressi a livelli più elevati nelle cellule HLA-1-negative rispetto alle cellule HLA-1-positive. I dati rappresentano la media : SD (n - 5). (D) Una forte colorazione positiva di OIl Red O e Alizarin Red S mostra una differenziazione terminale lungo percorsi lipogenici e osteogenici che sono indotti dal sarcoma TIC. (E) Immunostaining HLA-1 delle PDX formate da sottopopolazioni HLA-1 positive (sinistra) e -negative (destra). Barra della scala: 100 m. I risultati di questa cifra provengono da una precedente pubblicazione12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Abbiamo scoperto che l'HLA-I è epigeneticamente regolato in una sottopopolazione di cellule tumorali che mostrano proprietà delle cellule staminali e capacità di inizio del tumore. L'downregulation HLA-I è direttamente correlata alla fuga immunitaria, fornendo vantaggi di sopravvivenza per le cellule staminali tumorali, rendendo quindi la negatività HLA-I un marcatore funzionale accurato per queste cellule. A dimostrare la procedura sarà Sudeh Izadmehr, un postdoc del nostro laboratorio.Al momento dell'acquisizione del campione, mettere il tessuto in una piastra di Petri da 100 millimetri in un armadietto di biosicurezza sterilizzato e aggiungere 500 microlitri di PBS sterile alla piastra. Utilizzare un bisturi sterile per triturare meccanicamente il tessuto in piccoli pezzi fino a quando nessun frammento è più grande di 0,1 millimetri. Trasferire l'intero volume di PBS da 500 microlitri attraverso un filtro a celle a poro da 35 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.Aggiungere altri 500 microlitri di PBS ai frammenti di tessuto e tritare di nuovo i tessuti. Quindi filtrare il supernatante attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo di raccolta e continuare a tritare i pezzi di tessuto fino a quando il campione non è completamente dissociato. Quando l'ultimo volume di cellule è stato raccolto, spingi giù le cellule tumorali per centrifugazione e riasspensi il pellet in cinque millilitri di tampone di emolisi.Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e lavare il pellet con altri cinque millilitri di PBS. Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS e contare le cellule vitali. Diluire le cellule a una per 10 alla settima cellule per 200 microlitri di concentrazione di PBS sul ghiaccio e aggiungere 200 microlitri di matrice di membrana basale alle cellule con miscelazione delicata.Quindi iniettare la matrice della membrana cellulare sospensione-basamento sottocutaneamente nel fianco di un topo gamma scid NOD e controllare la crescita del tumore nel sito di iniezione due volte a settimana. Quando il tumore raggiunge un centimetro di diametro, tagliare il tumore a metà e fissare metà dello xenoinnesto con il 4% di paraformaldeide durante la notte per l'analisi istologica. Elaborare la seconda metà del tumore come appena dimostrato per ottenere una sospensione a singola cellula e diluire le cellule a due volte 10 alle sei cellule per millilitro di PBS integrato con una concentrazione FBS del 5%.Mantenere le cellule sul ghiaccio per 30 minuti prima di dividere la sospensione cellulare tra un controllo dell'isotipo e un tubo anticorpale. Si noti il numero di cellule in ogni tubo e mescolare le cellule nel tubo anticorpale con anticorpi anti-HLA e le cellule nel tubo di controllo dell'isotipo con un anticorpo di controllo anti-isotipo appropriato per un'incubazione di 90 minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, raccogliere entrambe le popolazioni cellulari per centrifugazione, seguite da due lavaggi PBS da 10 millilitri per centrifugazione.Dopo il secondo lavaggio, sospendere di nuovo i pellet in 10 microgrammi per millilitro di DAPI a una concentrazione di uno per 10 fino alle sette cellule per millilitro. Quindi filtrare ogni sospensione cellulare attraverso un filtro poro da 35 micrometri in singoli tubi di polistirolo da 12 per 75 millimetri. Dopo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, diluire le popolazioni di cellule HLA-I-negative e positive a singole concentrazioni di una volta 10-quinta cella in 15 millilitri del mezzo di crescita della sarcosfera per sottoinsieme.Diluire serialmente le cellule a una per 10 alla quarta, 10 alla terza e 10 alla seconda concentrazione in 15 millilitri di mezzo di crescita della sarcosfera fresca per diluizione, e aggiungere 100 microlitri di cellule da ogni diluizione ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra-bassa da 96 po 'per diluizione. Posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, monitorando quotidianamente la formazione della sarcosfera mediante microscopia leggera e aggiungendo un nuovo fattore di crescita dei fibroblasti di base e un fattore di crescita epidermico a ciascun pozzo senza cambiare il mezzo ogni tre giorni. Dopo tre settimane, conta il numero di pozzi positivi alla sarcosfera e sarcosfera-negativi per ogni diluizione cellulare delle cellule HLA-I-negative e HLA-I-positive per consentire il calcolo della frequenza cellulare che forma la sfera basata su una distribuzione di probabilità di Poisson.Tipicamente, gli xenografti di sarcoma derivati dal paziente umano consistono in due distinte popolazioni HLA-I-positive e negative, con un'istologia simile a quella dimostrata dal tumore primario parentale. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza delle cellule che iniziano il tumore dello xenografto derivato dal paziente sarcoma, come dimostrato, facilita l'arricchimento di un elevato numero di cellule HLA-I-negative dalla popolazione delle cellule parentali. Le cellule HLA-I-negative sono in grado di formare sfere con un input iniziale di appena 10 cellule e mostrano una maggiore capacità di formazione tumorale rispetto al paziente con sarcoma positivo HLA-I arrivate cellule che iniziano il tumore allo xenografto.L'iniezione dello stesso numero di cellule negative e positive HLA-I per via sottocutanea nei fianchi opposti dello stesso topo dimostra che le cellule HLA-I-negative possiedono una capacità di formazione tumorale significativamente più elevata. Mentre gli xenoinnesti formati da sottopopolazioni sia negative che positive HLA-I sono tumori eterogeni cellulari. Inoltre, l'analisi dell'espressione genica delle cellule che iniziano il tumore rivela che le cellule HLA-I-negative esprimono marcatori di differenziazione delle cellule staminali e possono essere indotte a differenziarsi lungo le vie lipogeniche e osteogeniche, dimostrando una forte colorazione e coltura oil-red-o e alizarin-rosso-s.Questo metodo può essere utilizzato per isolare le cellule staminali tumorali in vari tumori umani. La carbonizzazione molecolare, ad esempio, entro il sequenziamento di nuova generazione può rivelare marcatori comuni per indirizzare le cellule terapeuticamente. La nostra scoperta dimostra che il ripristino dell'HLA-I è un passo fondamentale per il successo delle strategie di potenziamento delle cellule immunitarie dell'unità funzionale.

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