Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura
19 gennaio 2018
L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare cervelli larvali di Drosophila per la microscopia a fluorescenza time-lapse di più giorni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenetica della Drosophila, come i cambiamenti dell'espressione genica che si verificano in specifiche popolazioni neuronali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging di sonde fluorescenti con risoluzione di una singola cellula nel cervello vivo nel corso di ore o giorni.
Quando si preparano i reagenti per questa procedura, lavorare sotto una cappa di coltura. Per iniziare, sia un'aliquota di terreno SAM che di trombina devono essere scongelate. Mettere da parte la trombina.
Prendi un'aliquota di 2,5 millilitri di SAM, metti il SAM rimanente sul ghiaccio e mettilo da parte. Quindi mettere la penicillina streptomicina nel SAM aliquotato e tenerlo a temperatura ambiente. Per esperimenti di imaging a lungo termine, preparare una camera di immaginazione, applicare grasso sottovuoto autoclavato sulle regioni di plastica intorno al pozzetto di un piatto con fondo di vetro.
Quindi sterilizzare il piatto unto con luce UV sotto il cofano. Ora, mescola un'aliquota di SAM nel fibrinogeno e trasferisci la miscela a 37 gradi Celsius, dove non polimerizzerà per due ore. Per la dissezione, pulire la pinza in due piastre di dissezione in vetro a tre pozzetti con etanolo al 70%.
Quindi caricare quattro pozzetti con 400 microlitri di DSS e un pozzetto con 400 microlitri di SAM. Conservare i piatti di dissezione su un piatto freddo. Da una fiala di mosche che si propagano, estrai un po' di terreno contenente larve di terzo stadio non vaganti e trasferiscine fino a sette con una pinza in un pozzo di DSS freddo.
Quindi, fai passare le larve attraverso tre dei quattro pozzetti caricati con DSS per pulirle. Lasciale nel pozzetto finale fino a quando non vengono sezionate. Usa il quarto pozzetto di DSS per sezionare il cervello larvale con un paio di pinze fini pulite.
Usa il metodo ben consolidato dall'interno verso l'esterno. Con competenza ogni larva può essere elaborata in circa 30 secondi. Dopo ogni dissezione, utilizzare un puntale di pipetta da 20 microlitri pre-risciacquato con DSS per trasferire il cervello in circa tre microlitri di DSS nel pozzetto riempito di SAM.
Prepara fino a sette cervelli per la procedura di inclusione. Dopo aver trasferito il cervello in una soluzione funzionante, erogare il cervello e il terreno sul coperchio di una capsula di Petri sterile. Quindi, aggiungere altri 3,5 microlitri di SAM con antibiotici e aggiungere 3,5 microlitri di SAM caldo con fibrinogeno.
È importante mantenere il terreno SAM con fibrinogeno a 37 gradi durante tutta la procedura. Successivamente, mescolare la soluzione intorno al cervello pipettando delicatamente con la stessa punta della pipetta e aspirare due microlitri di soluzione da depositare su un vetrino coprioggetti per un piatto con fondo di vetro. Quindi aggiungere 0,8 microlitri di trombina alla gocciolina e mescolare molto rapidamente per inizializzare la polimerizzazione che apparirà bianca.
Quindi, usa una pinza per prelevare delicatamente il cervello e posizionarlo sulla matrice di fibrina polimerizzante. Penso che la trombina, dopo che il cervello è stato trasferito alla gocciolina, non sia raccomandata, in quanto complica molto la procedura. Orienta il cervello secondo necessità e spingi molto delicatamente il cervello il più vicino possibile al vetrino coprioggetti.
Quindi raccogli uno strato di fibrina polimerizzata e piegalo sopra il cervello usando movimenti piccoli e delicati che non staccano la matrice. Continua a piegare strati di fibrina polimerizzata sul cervello da diverse parti del coagulo per stabilizzare il cervello. Quindi depositare 20 microlitri di SAM con antibiotici sul cervello incorporato per arrestare l'attività della trombina.
Utilizzando questa procedura, procedere con l'incorporazione di cinque o sei cervelli su un piatto con fondo di vetro. Per l'imaging a lungo termine, immergere il cervello incorporato in 600 microlitri di SAM con antibiotici. Quindi stendere un pezzo di membrana in PTFE sul mezzo e incollare i bordi della membrana alle parti unte del piatto.
Per saggi brevi, riempire la capsula con due millilitri di SAM con antibiotici, immergendo il cervello e omettere l'uso della membrana in PTFE. Utilizzando le procedure descritte, i cervelli che esprimono un reporter di orologio molecolare guidato da un driver di neuroni orologio, sono stati addestrati in luce-buio e poi preparati come colture di espianto. Le colture a lungo termine sono state allestite durante la fase di luce, appena prima del buio.
È stato creato uno stack SUM contenente il neurone di interesse nell'intensità media di fluorescenza dell'area corrispondente al neurone misurata dopo la sottrazione di fondo. Per determinare la ritmicità dell'espressione reporter, sono state utilizzate sia l'analisi spettrale della massima entropia che l'ispezione manuale. Successivamente, le larve dello stesso genotipo sono state sezionate un'ora dopo l'alba soggettiva o un'ora dopo il tramonto soggettivo.
I cervelli sono stati sottoposti a imaging due volte nel giro di un'ora per ottenere una linea di base. Quindi, il PDF o il veicolo sono stati aggiunti al mezzo di coltura e i cervelli sono stati ripresi ogni ora per sei ore. Nei cervelli prelevati poco dopo il tramonto, il profilo di espressione di PER-TDT nei LNvs ha mostrato un aumento dell'intensità della fluorescenza dipendente dall'ora del giorno dopo l'aggiunta di PDF.
Ciò si è verificato anche nei DN1 e, in misura minore, nei DN2. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una coltura cerebrale ex vivo da larve di Drosophila utilizzando una matrice 3D di fibrina. Una volta padroneggiata, l'intera procedura dura circa 30 minuti, dalla dissezione all'inclusione.
Prima di iniziare le dissezioni, preparare la configurazione di imaging in modo che il cervello possa essere ripreso immediatamente dopo l'inclusione. Seguendo questa procedura, i cervelli adulti di Drosophila possono anche essere coltivati per l'imaging time-lapse a fluorescenza al fine di rispondere a ulteriori domande.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per stabilire colture ex vivo di cervelli larvali di Drosophila finalizzato al monitoraggio dei ritmi circadiani molecolari utilizzando l'imaging a time-lapse con fluorescenza a lungo termine. Affronta questioni chiave nella neurogenetica di Drosophila, come i cambiamenti nell'espressione genica in specifiche popolazioni neuronali, e discute l'applicazione del metodo agli saggi farmacologici.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neurogenetica
- Tecniche di coltura cellulare
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- Le larve di Drosophila sono utilizzate come modello per studiare i meccanismi neuronali.
- La tecnica consente l'osservazione della fluorescenza con risoluzione a singola cellula.
- Focus sui ritmi circadiani e sull'espressione genica nelle popolazioni neuronali.
- Integrazione di saggi farmacologici per indagare le risposte molecolari.
Obiettivo dello studio
- Facilitare l'imaging a lungo termine dei cervelli larvali di Drosophila.
- Investigare l'espressione del reporter dell'orologio molecolare guidata dai driver neuronali dell'orologio.
- Consentire la valutazione della ritmicità nell'espressione genica in diverse condizioni di luce.
Metodi utilizzati
- Tecnica di coltura ex vivo per cervelli larvali di Drosophila in una matrice di fibrina.
- Comporta la dissezione e l'incorporazione dei cervelli larvali per la microscopia a fluorescenza.
- Non è menzionato un workflow multiomics specifico.
- La procedura richiede circa 30 minuti dalla dissezione all'incorporazione.
- Il setup include la preparazione di una camera di imaging e il controllo della temperatura del mezzo.
Risultati principali
- È stata dimostrata la riuscita osservazione a lungo termine dei profili di espressione ritmica in specifiche popolazioni neuronali.
- L'aggiunta di PDF al mezzo di coltura ha comportato un aumento dell'intensità della fluorescenza dipendente dall'ora del giorno.
- I risultati evidenziano la variabilità nei modelli di espressione tra diversi tipi di neuroni, come LNvs e DN1s.
- Presenta una comprensione completa dell'efficacia del protocollo e della dinamica dei ritmi circadiani.
Conclusioni
- Questo studio consente un monitoraggio dettagliato dei ritmi di espressione genica neuronale in modo minimamente invasivo.
- La metodologia potenzialmente migliora la comprensione della biologia circadiana e degli studi neurogenetici in Drosophila.
- Le implicazioni si estendono a ulteriori studi sui meccanismi neuronali e gli interventi farmacologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables longitudinal, single-cell resolution imaging of molecular oscillators in live neuronal tissue, supporting target validation in neurogenetic discovery. By capturing real-time dynamics of circadian reporters in defined cell types, it provides quantitative, reproducible readouts for mechanistic de-risking of neuronal targets. The approach bridges genetic manipulation with pharmacological response, enhancing predictive confidence in early-stage target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional rhythms in genetically defined pacemaker neurons to validate circadian targets.
- Operational Value: Provides single-cell, longitudinal fluorescence readouts for assessing target engagement over multiple days.
- Scientific Value: Supports functional validation of neuronal signaling pathways via real-time response to pharmacological agents like PDF.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, background-subtracted fluorescence intensity measurements for rhythmicity assessment.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible embedding of larval brains in fibrin matrix for consistent imaging conditions.
- Scientific Value: Facilitates dose- and time-dependent analysis of compound effects on molecular clock dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links circadian gene expression rhythms to neuronal subtypes (LNvs, DN1s, DN2s) for biomarker-aligned target validation.
- Operational Value: Supports cross-condition comparison (e.g., subjective dawn vs. dusk) to assess rhythm robustness and compound sensitivity.
- Scientific Value: Enables entrainment and explant culture workflows that model light-regulated neuronal physiology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal targets before lead identification.
- Discovery Biology: Supports real-time monitoring of gene expression rhythms to clarify circadian pathway function in specific neuron classes.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs for assessing compound effects on molecular clocks over time.
- Analytics: Enables maximum entropy spectral analysis and manual inspection to determine rhythmicity and phase shifts in reporter expression.
- Translational Research: Connects live imaging data to neuronal subtype-specific responses, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal imaging of neuronal processes in genetically tractable models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into neuronal clock regulation, reducing ambiguity in target function.
- Operational Value: Enables multi-day, time-lapse imaging with environmental control for consistent, reproducible data collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing time-of-day-dependent target modulation and pathway dynamics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of circadian and neurogenetic targets based on dynamic response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila larval dissection and fluorescent microscopy setup.
- Dependent on controlled incubation (37°C) for fibrin polymerization and medium stability.
- Necessitates standardized embedding and imaging protocols to minimize variability across preparations.
- Requires adaptation for different genetic drivers or reporter constructs to target specific neuronal populations.
- Limited by tissue viability over extended culture periods, necessitating timely imaging post-embedding.
