Name: Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Impara a coltivare cervelli larvali di Drosophila per imaging a fluorescenza time-lapse a risoluzione di cella singola. Questo metodo consente di studiare i ritmi circadiani molecolari e l'espressione genica in specifiche popolazioni neuronali in vivo.

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Ringraziamo Michael Rosbash per suo tutoraggio e supporto durante la fase iniziale dello sviluppo di questo metodo. Questo lavoro è stato finanziato dal programma JST PRESTO, la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 e 31003A_169548), il Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-Biomedical Research (13A39) e l'Università di Ginevra .

1. preparazione delle soluzioni madri sotto una cappa di cultura
<ol><li>Preparare 400 mL di 1x Schneider mezzo attivo (SAM), ottimizzato per ex vivo cultura dei cervelli larvali (modificato da riferimento24,25) (tabella 1). Aliquota di 5 mL e flash congelamento in azoto liquido (LN2), conservare a - 80 ° C.</li>
	<li>Preparare soluzione salina dissecante (DSS): 1x diluendo 10 x soluzione madre (modificato dal riferimento26) (tabella 2).</li>
	<li>Aliquota fibrinogeno a 10 mg e conservare a 4 ° C per un uso singolo. Attenzione: Pesare fibrinogeno sotto flusso laminare, indossando guanti, come è dannoso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva della trombina a SAM (1500 NIH unità/mg) e aliquota a 10 µ l, flash congelare in LN2 e mantenere a-80 ° C. Attenzione: Indossare guanti durante la manipolazione della trombina come è dannoso.</li>
	<li>Soluzione di riserva aliquota di 100 x penicillina-streptomicina. Conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Tagliare cerchi della membrana di politetrafluoroetilene (PTFE) (Vedi materiali tavolo) per le dimensioni che si inserisce all'interno di un piatto fondo di vetro. Sciacquarli in 70% EtOH e quindi in dH2O. sterilizzare in autoclave e a secco sotto flusso laminare con UV. Tenere in una capsula di Petri sterile. Uso singola. Nota: PTFE è una membrana flessibile porosa che permette lo scambio di gas e impedisce l'evaporazione durante la registrazione a lungo termine di mezzo.</li>
</ol>2. Time-lapse microscopia Setup
Nota: Il seguente setup è per un microscopio confocale di tandem scanner invertito (Vedi materiali tavolo) dotato di uno scanner di risonanza (8.000 Hz). Il sistema comprende un rivelatore di foto-moltiplicatore altamente sensibile, che insieme con lo scanner risonante previene fototossicità e photobleaching. Temperatura e l'umidità sono controllate all'interno di una camera ambientale microscopio (Vedi Materiali tavolo) che copre la maggior parte del microscopio.
<ol><li>Posto un palcoscenico-top umidostatica.</li>
	<li>Accendere i regolatori di temperatura e umidità per equilibrare la camera microscopio a 25 ° C e 80% di umidità.</li>
	<li>Per eseguire esperimenti in costante oscurità (DD), coprire la camera ambientale microscopio con un panno opaco (a meno che l'alloggiamento del microscopio è fatto di un materiale opaco).</li>
	<li>Se si utilizza un obiettivo a immersione in acqua, posizionare un distributore di Micro di immersione acqua sopra l'obiettivo e programmare un protocollo con il software Autoimmersion obiettivo Controller per erogare acqua a una velocità costante durante la formazione immagine di time-lapse. Nota: Obiettivi di immersione in acqua insieme a un distributore di acqua o asciutto dell'obiettivo sono raccomandati per l'imaging dal vivo a lungo termine, come altro tipo di mezzo immersione sarebbe asciugare.</li>
	<li>Collocare un supporto per piastra di Petri sul palco, all'interno della camera di umidità.</li>
	<li>Avviare il software di microscopio e selezionare la modalità scanner risonante dalla prima finestra di dialogo. Selezionare OK per inizializzare la fase quando richiesto. Vai alla scheda configurazione e alla configurazione di Hardware per accendere le linee laser pertinente.</li>
	<li>Vai alla scheda di acquisizione e al pannello di XY per selezionare la modalità bidirezionale e impostare immagine acquisizione parametri. Nota: L'installazione imaging descritto qui presentato (Figura 2, Figura 3 e Movie 1) è ottimizzato per osservare espressione circadiana di reporter fluorescenti specifici. I seguenti parametri sono stati scelti per soddisfare al meglio le nostre specifiche: 40 X acqua obiettivo a immersione, media di linea X 8 con 512 × 512 risoluzione dell'immagine. Per l'imaging multicolor, acquisizione di immagini sequenziali è necessaria quando la lunghezza d'onda di emissione di un fluoroforo e la lunghezza d'onda di eccitazione di sovrapposizione di un altro (qui, lunghezze d'onda di emissione di proteina fluorescente gialla (YFP) e sovrapposizione di eccitazione di pomodoro). Scegliere la modalità sequenza "in between"stack come è il più veloce e il movimento dei neuroni di orologio è trascurabile durante l'acquisizione di uno Z-stack. La microscopia impostazioni dovrebbero essere adattate per soddisfare l'obiettivo di ogni esperimento.</li>
</ol>3. installazione della cultura Explant larvale cervello
Nota: L'intera procedura da dissezione all'incorporamento degli espianti di cervello richiede circa 30 min.
<ol><li>
Preparazione dei reagenti sotto una cappa di cultura.
	<ol>
<li>Scongelare una parte aliquota di trombina e conservare a temperatura ambiente fino alla fase di incorporamento (punto 3.3). Uso singola.</li>
		<li>Scongelare rapidamente un'aliquota di SAM a 37 ° C e tenere il ghiaccio per un singolo utilizzo.</li>
		<li>Aggiungere SAM ad un'aliquota di 10 mg di fibrinogeno a 10 mg/mL, flick delicatamente e incubare a 37 ° C per almeno 30 min e durante il passaggio di incorporamento (punto 3.3). Uso singola. Nota: Non Incubare la soluzione di fibrinogeno più di 2 h in quanto inizia a polimerizzare.</li>
		<li>Scongelare un'aliquota di 100 stock x penicillina-streptomicina. Preparare 2,5 mL di SAM che contiene 1 x penicillina-streptomicina (SAM/antibiotici). Conservare a temperatura ambiente. Nota: La Stock in archivio i rimanenti x 100 penicillina-streptomicina a 4 ° C fino a 1 mese.</li>
		<li>Preparare un'aliquota di 500 µ l da SAM rimanenti. Tenere il ghiaccio.</li>
		<li>Per l'imaging a lungo termine, applicare il grasso per vuoto in autoclave per la parte in plastica della parte inferiore del vetro piatto fondo (Figura 1A) e sterilizzare sotto flusso laminare con UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissezione del cavo del nervo del sistema nervoso centrale e ventrali.
	<ol>
<li>Pulire il forcipe e 2 x tre-pozzo vetro piatti di dissezione con 70% EtOH. Versare 400 µ l di DSS in 4 pozzi e 400 µ l di SAM in un pozzetto. Tenere il ghiaccio.</li>
		<li>Scoop di Vola mezzo contenente larve e pick non vagare 3rd instar larve (L3) con il forcipe. Successivamente sciacquare 2 pozzi DSS-riempito. Tenerli nel pozzo pieno di DSS 3 ° sul ghiaccio che anestetizza le larve. Nota: L3 dura circa 2 giorni a 25 ° C. Per osservare il cervello in fisiologicamente rilevante lasso di tempo che abbiamo scelto di utilizzare non vagare larve L3. Altri sottogruppi dei neuroni di orologio, come l-LNvs e DN3s, iniziano a formarsi a vagare fase L3 ma non sono necessariamente in bicicletta ancora (dati non mostrati). Pertanto, anche se è possibile immagine Ciclismo orologio neuroni in questa fase (dati non mostrati), è importante distinguere attentamente i neuroni già funzionale orologio larvale in via di sviluppo a quelli per l'analisi dei dati. Non vagare L3 compaiono circa 4-4,5 giorni dopo uova a 25 ° C. Per utilizzare questo protocollo per studiare i ritmi circadiani, sincronizzare (trascinare) lo sviluppo larve in 12 h/12 h LD cicli a 25 ° C per 3 giorni prima di raccogliere le larve L3.</li>
		<li>Sezionare larvali cervelli con una pinzetta nel 4 ° DSS-riempito bene, che non è stato utilizzato per il risciacquo larve, utilizzando il metodo di dentro-fuori27.<ol>
<li>Brevemente, tagliare la larva in due, delicatamente pizzicare i ganci di bocca con un paio di pinze e arrotolare dentro-fuori la parete del corpo usando l'altra coppia di pinze, esponendo così il cervello. Gratis il cervello tagliando fuori tutti la trachea e i nervi che collegarlo al resto del corpo.</li>
			<li>Aspirare il cervello in circa 3 µ l di DSS con una pipetta di 20 µ l (pre-risciacquata con DSS) ed erogare nel pozzo pieno di SAM. Ripetere la procedura per fino a 7 cervelli. Nota: Dissezione dovrebbe essere eseguita su una superficie fredda per mantenere le larve anestetizzate e cervello refrigerati. Ad esempio, posizionare il piatto di dissezione su un blocco di raffreddamento collegato ad una pompa per far circolare acqua ghiaccio-refrigerati. La dissezione procedura prende ~ 30 s al cervello. È importante tenere i dischi immaginali occhio/antennali attaccati per il cervello e il midollo ventrale del nervo intatto. Strappare queste parti danneggia il cervello e ridurre la qualità della cultura. Inoltre, evitare di esporre i cervelli all'aria. Prima di aspirare il primo cervello, pipetta su e giù per il DSS contenenti parti delle larve dissecate, come esso previene i cervelli di attaccarsi alla parete della punta.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incorporamento di espianti di cervello in una matrice 3D e montaggio (~ 20 min).
	<ol>
<li>Immergere un cervello sezionato in soluzione di lavoro del fibrinogeno (concentrazione finale del fibrinogeno ~3.3 mg/mL, 10,5 µ l al cervello) come segue:</li>
		<li>Aspirare 3,5 µ l di SAM/antibiotici (con la stessa punta utilizzata nella sezione 3.2.3). Aspirare un cervello dissecato dalla dissezione fino la punta della pipetta stessa senza il mezzo di SAM/antibiotici nella punta di erogazione.</li>
		<li>Dispensare il cervello ed il mezzo sul coperchio di una scatola di Petri sterile. Aggiungere un altro 3,5 µ l di SAM/antibiotici e 3,5 µ l di soluzione di 10 mg/mL di caldo fibrinogeno/SAM sul menu contenente il cervello. Mescolare delicatamente la soluzione intorno al cervello di pipettaggio con una punta di pipetta 20 µ l. Nota: L'utilizzo di una pipetta, piuttosto che il forcipe in questo passaggio evita sottolineando il cervello.</li>
		<li>Prendere 2 µ l della soluzione di lavoro di fibrinogeno dal menu e applicare sul coprioggetto del vetro piatto fondo come un piccolo cerchio. Aggiungere 0,8 µ l della trombina e mescolare molto velocemente con un puntale. Il fibrinogeno viene convertito in fibrina e inizia a polimerizzare.</li>
		<li>Prendere il cervello che si siede del fibrinogeno soluzione (punto 3.3.1) tra un paio di pinze da lavoro e posizionarlo sulla matrice una volta una bianca matrice di fibrina è visibile. Orientare il lato anteriore del cervello verso il basso (per l'imaging orologio neuroni). Spingere verso il basso più vicino possibile al vetro di copertura. Coagulo di fibrina è composta di strati di fibrina. Selezionate un livello e piegarlo in cima il cervello con movimenti piccoli e delicati senza staccare la matrice.<ol>
<li>Ripetere 2-3 volte da diverse parti del coagulo per stabilizzare il cervello. Nota: Quando si maneggia il cervello con il forcipe, essere attenti a non asciugare o imporre uno stress fisico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di SAM/antibiotici in cima il cervello incorporato per fermare l'azione della trombina.</li>
		<li>Ripetere la procedura per montare i cervelli rimanenti. È possibile incorporare fino a 5 a 6 cervelli su un piatto fondo di vetro.</li>
		<li>Per l'imaging dal vivo a lungo termine, è necessario aggiungere 600 µ l di SAM/antibiotici nel pozzo interno (la parte di vetro). Posizionare una membrana in PTFE pre-tagliata in cima il mezzo e bastone per il grasso per vuoto applicato sulla parte in plastica della parte inferiore (3.1.5) (Figura 1A).</li>
		<li>Per i dosaggi farmacologici, riempire il piatto con 2 mL di SAM/antibiotici (Figura 1B). Nota: È molto importante evitare l'evaporazione del fluido, come il osmolality del mezzo è fondamentale per la vitalità dei neuroni. Pertanto, per esperimenti a lungo termine di imaging, è necessario sigillare la piastra di coltura con membrana in PTFE. Mentre per gli esperimenti a breve termine, membrana di tenuta non è necessaria fino a quando il piatto è riempito con 2 mL di terreno e monitorato in una camera umidificata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Time-lapse immagine acquisizione
<ol><li>Mettete il piatto inferiore di vetro sul supporto di Petri all'interno della camera di umidità di palcoscenico-top.</li>
	<li>Vai al pannello di z-stack nella scheda Acquire e impostare i passaggi di z-sezione dal software microscopio (2 µm × ~ 40 negli esperimenti mostrato in Figura 2 e Figura 3 Movie 1). Impostare l'inizio di uno z-stack all'aereo più lontana il vetrino coprioggetto e alla fine sulla superficie del explant cervello, vicino il vetrino coprioggetti. Anche se i movimenti del cervello sono trascurabili, aggiungere z-sezioni extra all'inizio e alla fine dello z-stack.</li>
	<li>Vai a contrassegnare e trovare l'acquisizione di immagini multi-posizione di pannello e set-up. Con un obiettivo 40x, 1 emisfero del cervello può essere catturato all'interno di un campo di vista</li>
	<li>Vai a pannello di modalità di acquisizione e selezionare xyzt (z-stack di time-lapse). Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare i parametri di frequenza e intervallo di tempo preferito. Nota: Acquisire immagini time-lapse con la frequenza desiderata. Nota che a lungo termine dal vivo imaging (24-72 h) con intervallo di lasso di tempo inferiore a 2h tende a risultati in meno neuroni in bicicletta, probabilmente perché riduce la vitalità dei neuroni. Il volume di dati si espande come il tasso degli aumenti di acquisizione immagine, che rende la memorizzazione e l'analisi di dati più impegnativo.</li>
</ol>5. pharmacological Treatment of espianti di cervello con Live Imaging a breve termine
Nota: La seguente procedura è essenzialmente la stessa di quella per l'imaging a lungo termine ma non necessita di una membrana in PTFE. Per evitare di esporre i cervelli luce blu quando la sostanza è aggiunta alla cultura, il microscopio deve essere posizionato in camera oscura con luce rossa.
<ol><li>Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare l'intervallo di tempo desiderato e il numero di scansione per ottenere i dati della linea di base prima dell'applicazione del farmaco. Avviare la scansione.</li>
	<li>Dopo la linea di base la scansione è completata, sollevare la testa di scansione del sistema microscopio. Rimuovere il coperchio della centralina del palcoscenico-top umidità e con molta attenzione togliere il coperchio del vetro piatto fondo senza spostarlo.</li>
	<li>Se necessario, rimuovere la giusta quantità di terreno di coltura. Aggiungere la soluzione sperimentale nel mezzo e, con cura e molto delicatamente, mescolare con una pipetta Pasteur sterile senza toccare i cervello espianti. Nota: Per applicazione di vasca di PDF, utilizzare 2 µM PDF soluzione stock (nel 10% DMSO).</li>
	<li>Sostituire i coperchi di vetro piatto fondo camera umida e la testa di scansione. Se si utilizza, è possibile riposizionare il drappo nero opaco intorno alla camera di microscopio.</li>
	<li>Verifica se i cervelli sono alle loro posizioni originali in modalità scan in tempo reale. Regolare se necessario.</li>
	<li>Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare l'intervallo di tempo desiderato e il numero di scansione. Avviare la scansione. Nota: Qui abbiamo testato Time-lapse immagini acquisite ogni ora fino a 10 ore.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo descritto il metodo per lungo termine microscopia di fluorescenza time-lapse di cervelli larvale coltivate. Il successo di questo tipo di esperimenti dipende da molteplici fattori, come la salute della cultura, metodo per immobilizzazione del espianto del cervello, l'intensità di fluorescenza e rapporto segnale-rumore del reporter, temporale e risoluzione spaziale, e accessibilità per l'espianto. Questi fattori possono essere mutuamente esclusivi. Ad esempio, aumentando la frequenza time-lapse colpisce la sal...

Orologi circadiani aiutano gli organismi ad adattarsi ai cambiamenti ambientali periodici generati dalla rotazione della terra 24 h. I cicli di feedback trascrizionale traslazionale interbloccata comunemente sono alla base di macchine molecolari della orologi circadiani attraverso specie1. Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano composto contenente orologio neuroni integra time-of-day informazioni veicolate dagli stimoli ambientali, come luce/buio (LD) e cicli di temperatura, di orchestrare i ritmi di una pletora di quotidiano fisiologico e processi comportamentali2,3. Il coordinamento dei ritmi molecolari con un neurone ingressi e uscite è di fondamentale importanza per il funzionamento del circuito circadiano ma resti solo parzialmente capiti.
In Drosophila, il nucleo dell'orologio molecolare, l'eterodimero/ciclo di CLOCK (CLK/CYC) attiva la trascrizione di periodo (a) e senza tempo (tim). TIM e PER formare un complesso ed entrare nel nucleo, dove inibiscono l'attività trascrizionale di CLK/CYC e di conseguenza la propria trascrizione. Post-trascrizionali e post-traduzionali regolamenti causano ritardi tra CLK/CYC-mediata trascrizione e repressione di PER / TIM, garantendo la generazione di circa 24-h oscillazioni molecolari1,3,4 . Circa 150 neuroni contenenti questi orologi molecolari forma un circuito per controllare il comportamento circadiano di adulto Vola5. Un molto più semplice ma completamente funzionale circadiano circuito composto da 3 gruppi di neuroni orologio - 5 neuroni laterale ventrale (LNvs; 4 PDF-positivi LNvs e un PDF-negativi LNv, vedi sotto), 2 dorsali del neurone 1s (DN1s) e 2 dorsale del neurone 2s (DN2s) - è presente nel larvale cervello6,7.
Il semplice circuito circadiano larvale offre un eccellente modello per studiare le interazioni tra la comunicazione inter-neuronale e l'orologio molecolare. Utilizzando il nostro reporter fluorescente recente sviluppato PER-TDT, che imita i livelli di PER proteina e la sua posizione subcellulare, abbiamo cercato di caratterizzare la dinamica del movimento a orologeria molecolare nei sottogruppi di neurone differenti dell'orologio nel circuito circadiano larvale 8. Inoltre, conoscendo il ruolo chiave del fattore di dispersione del pigmento di neuropeptide (PDF) prodotto da 4 LNvs nel regolare i ritmi circadiani a livello neuronale9,10,11, abbiamo voluto esaminare il diretto effetto di PDF sugli orologi molecolari. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo per monitorare l'espressione genica circadiana ritmi nel cervello larvale explant di più giorni mediante microscopia confocale a time-lapse. Il protocollo è stato anche adattato per i dosaggi farmacologici testare l'effetto di PDF o altri composti sul livello di PER-TDT. Così, l'adattamento è costituito da rendendo accessibile all'applicazione di droga la cultura di espianto del cervello, aumentando la risoluzione temporale e imaging per una durata più breve.
Ex vivo cultura del cervello di Drosophila di diversi stadi di sviluppo sono stati stabiliti in precedenza12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando che questi protocolli sono stati utilizzati per l'imaging di vari fenomeni biologici, alcuni di loro non sono compatibili con formazione immagine a risoluzione di singole cellule o non supportano la cultura per più di alcune ore. Metodi alternativi per eseguire imaging dal vivo a lungo termine dei neuroni circadiani in Drosophila includono bioluminescenza imaging molecolare ritmi19,20,21 e imaging di fluorescenza indicatore di calcio con foglio leggero microscopia22,23. Anche se imaging bioluminescenza può raggiungere la più alta risoluzione temporale e microscopia foglio leggero può essere adattabile per l'imaging in vivo , essi hanno limitati la risoluzione spaziale e richiedono sistemi di microscopia specializzati.
Il metodo qui descritto è su misura per visualizzare segnali fluorescenti nella cultura intero cervello a cella singola risoluzione di più giorni. Questo metodo facile e versatile può essere adattato ai cervelli volare adulto immagine coltivata e per gli esperimenti farmacologici studiare diversi problemi in neurobiologia della drosofila .

<table><tbody><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Non sono sicuro che siano esattamente gli stessi che abbiamo in laboratorio. Ho scelto "adatto per la coltura di cellule di insetti" quando disponibile</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Acido malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trealosio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Acido succinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Acido fumarico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Acido chetoglutarico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS) non inattivato a caldo Screening di micoplasmi e virus</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno da plasma bovino</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>ATTENZIONE: Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Manipolare sotto flusso laminare</td></tr><tr><td>Trombina da plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>ATTENZIONE: Pericolo per la salute, utilizzare guanti</td></tr><tr><td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td> grasso sottovuoto <td>su misura</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da 35 mm, n. 1.5 Vetrino coprioggetti, diametro vetro 20 mm, non rivestito</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Piastre per colture tissutali</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP Filtro filettato per bottiglia da 33 mm, 0,22 &; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Film in politetrafluoroetilene (PTFE)</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP</td><td></td></tr><tr><td>Film Millex-HV Unità filtro siringa, 0,45&nbsp; &micro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, sterilizzato a raggi gamma</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro per siringa Millex-GV, 0,22&nbsp; &micro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, sterilizzato a raggi gamma</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di dissezione in vetro a tre pozzetti</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine, misura 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Scanner tandem Microscopio confocale TCS SP5 invertito, con scanner risonante e rivelatori fotomoltiplicatori HyD Microsystem</td><td>Leica CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di controllo della temperatura</td><td>Servizi di imaging Life</td><td>Il CUBE & Sistema di controllo della temperatura BOX, progettato</td><td></td>su misura</tr><tr><td>Regolatore di umidità da palco</td><td>Life Imaging Services</td><td></td> Micro dispenser ad immersione in <td></td></tr><tr><td>acqua: erogatore, micropompa estesa serie MP6 e software di controllo dell'obiettivo a immersione automatica</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Creazione di stack SUM e plug-in per la deriva della correzione 3D</td><td>Software</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJDeconvoluzione iterativa 10x</td> Software <td></td><td></td><td>AutoQuant e Imaris</td></tr></tbody></table>

cella singola risoluzione fluorescenza live imaging di drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano Orchestra ritmiche uscite comportamentali e fisiologiche, coordinate con segnali ambientali, ad esempio cicli giorno/notte. L'orologio molecolare all'interno di ogni neurone di pacemaker genera i ritmi circadiani nell'espressione genica, che sottendono le funzioni neuronali ritmiche essenziali per il funzionamento del circuito. Indagine delle proprietà di singoli oscillatori molecolare in diverse sottoclassi di neuroni pacemaker e la loro interazione con la segnalazione di un neurone produce una migliore comprensione del circuito stimolatore cardiaco circadiano. Qui, presentiamo un approccio di time-lapse microscopia fluorescente sviluppato per monitorare l'orologio molecolare in neuroni di orologio di coltura della drosofila larvale cervello. Questo metodo permette la registrazione di multi-giorno dei ritmi di reporter circadiano fluorescenti geneticamente codificato a cella singola risoluzione. Questa configurazione può essere abbinata a manipolazioni farmacologiche per analizzare da vicino risposta in tempo reale dell'orologio molecolare di vari composti. Oltre i ritmi circadiani, questo metodo multiuso in combinazione con potenti tecniche genetiche di Drosophila offre la possibilità di studiare diversi processi neuronali o molecolari in tessuto cerebrale dal vivo.

Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi della registrazione a lungo termine di un reporter fluorescente circadiano in ex vivo larvale cervello cultura e i risultati di imaging dal vivo di applicazione bagno PDF sull'espressione di reporter.
Non vagare le larve L3 esprimendo l'orologio molecolare reporter PER-TDT e UAS-mCD8::YFP guidato da un conducente di neurone orologio Clk 856-gal4 (<strong class="xfig...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare cervelli larvali di Drosophila per la microscopia a fluorescenza time-lapse di più giorni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenetica della Drosophila, come i cambiamenti dell'espressione genica che si verificano in specifiche popolazioni neuronali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging di sonde fluorescenti con risoluzione di una singola cellula nel cervello vivo nel corso di ore o giorni.Quando si preparano i reagenti per questa procedura, lavorare sotto una cappa di coltura. Per iniziare, sia un'aliquota di terreno SAM che di trombina devono essere scongelate. Mettere da parte la trombina.Prendi un'aliquota di 2,5 millilitri di SAM, metti il SAM rimanente sul ghiaccio e mettilo da parte. Quindi mettere la penicillina streptomicina nel SAM aliquotato e tenerlo a temperatura ambiente. Per esperimenti di imaging a lungo termine, preparare una camera di immaginazione, applicare grasso sottovuoto autoclavato sulle regioni di plastica intorno al pozzetto di un piatto con fondo di vetro.Quindi sterilizzare il piatto unto con luce UV sotto il cofano. Ora

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Qui descriviamo un protocollo per esaminare la migrazione delle cellule gliali in un occhio lo sviluppo di Drosophila mediante l'analisi microscopica vivono in coppia con tag GFP cellule gliali.

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Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.

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Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l'installazione costosa.

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Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

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Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

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