Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare l'arricchimento dei segni istonici in una specifica posizione genomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, come ad esempio il modo in cui le mutazioni nei regolatori epigenetici che alterano le modificazioni degli istoni influiscono sul trascrittoma delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule non sono reticolate, quindi sono in uno stato più naturale, il che può aiutare la specificità degli anticorpi.

Inizia sezionando il tumore indotto sperimentalmente dal cervello di un topo in una capsula di Petri di 10 centimetri. Se il tumore esprime una proteina fluorescente, visualizzare il tumore attraverso un microscopio da dissezione fluorescente impostato sul canale fluorescente appropriato con un ingrandimento di 0,3 volte. Usa un bisturi e una pinza per separare il tessuto tumorale dal cervello normale e trita il tumore in piccoli pezzi nella capsula di Petri.

Trasferire il tumore sezionato in una provetta da 1,5 millilitri con 300 microlitri di terreno NSC e utilizzare una siringa monouso per omogeneizzare delicatamente il tumore. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di distacco cellulare e incubare il campione per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Quindi, lavare il colino con 25 millilitri di terreno NSC e centrifugare la sospensione a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere il pellet in sei millilitri di terreno NSC e trasferire la sospensione di cellule tumorali in un pallone di coltura T25. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture tissutali con un'atmosfera del 95% di aria e del 5% di anidride carbonica fino a formare neurosfere.

Una volta raccolte le neurosfere, centrifugare una volta da 10 a sei cellule della neurosfera per precipitazione amminica a 300 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, decantare il surnatante e risospendere il pellet di neurosfera in un millilitro di soluzione salina bilanciata. Trasferire la sospensione in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame proteico, quindi centrifugare come prima.

Successivamente, decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 95 microlitri di tampone digestivo, integrato da uno a 100 con un cocktail di inibitori della proteasi per una volta 10 le sei cellule. Pipettare immediatamente le cellule su e giù per evitare la formazione di grumi ed evitare la formazione di bolle. Quindi, mescolare cinque microlitri di nucleasi micrococcica 0,1X in 145 microlitri di tampone di digestione e aggiungere cinque microlitri di nucleasi micrococcica diluita per una volta 10 alle sei cellule.

Muovi il tubo per mescolare e posiziona il tubo in un blocco termico a 37 gradi Celsius per esattamente 12 minuti. La digestione della nucleasi micrococcica per frammentare la cromatina è il passaggio più critico. Una corretta frammentazione della cromatina è importante per ottenere un'alta risoluzione per ChIP.

Per garantire il successo della fase, incubare più campioni uno alla volta per assicurarsi che non si verifichi una digestione eccessiva. Dopo 12 minuti, aggiungere 10 microlitri di tampone di arresto della nucleasi micrococcica 10X per una volta 10 alle sei cellule. I campioni devono essere conservati in ghiaccio da questo punto in poi.

L'analisi del bioanalizzatore del campione digerito di nucleasi micrococcica dimostra che la maggior parte del DNA è stata frammentata in mono, di e trinucleosomi. Successivamente, aggiungere 110 microlitri di tampone ripa 2X integrato da uno a 100 con un cocktail di inibitori della proteasi per una volta 10 alle sei cellule. Agitare la provetta per mescolare, quindi centrifugare per 15 minuti a quattro gradi Celsius in 1700 volte G.Trasferire il surnatante che contiene la cromatina in una normale provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e metterlo sul ghiaccio.

Utilizzare un tampone ripa integrato con inibitori della proteasi da uno a 1000 per diluire la cromatina, in modo che ogni IP abbia un volume da 100 a 200 microlitri. Quindi, rimuovere un'aliquota equivalente al 10% del volume ChIP come campione di input. Preparare l'input aggiungendo 100 microlitri di tampone TE integrato con proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora.

Dopo aver purificato l'input con un kit di purificazione PCR, misurare la concentrazione dell'input utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Registra i risultati in un taccuino. Aggiungere 10 microlitri di microsfere magnetiche di proteina A e G lavate per IP che verranno eseguite su ciascun campione e incubare per un'ora a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 giri/min.

Posizionare il campione su un supporto magnetico e lasciare che le perle si separino, quindi trasferire il volume richiesto in nuove provette da 1,5 millilitri. Aggiungere l'anticorpo desiderato a ciascuna provetta e quindi avvolgere i tappi con un film di paraffina di plastica per evitare l'evaporazione. Incubare i campioni per una notte a 4 gradi Celsius con rotazione come prima.

Il giorno successivo, centrifugare le provette a 2000 volte G per 10 secondi, quindi aggiungere 10 microlitri di perle a ciascun IP e incubare per 3 ore a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 giri/min. Quindi, posizionare i campioni su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante, quindi aggiungere 150 microlitri di tampone ripa con inibitori della proteasi a ciascun IP e incubare a 4 gradi Celsius a 20 giri/min per cinque minuti.

Trascorso il periodo di incubazione, posizionare i campioni su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante, quindi aggiungere 150 microlitri di tampone di cloruro di litio integrato con inibitori della proteasi a bassa concentrazione a ciascun IP e incubare a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 giri/min per cinque minuti. Trascorso il periodo di incubazione, posizionare i campioni su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino, quindi utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.

Quindi, aggiungere 150 microlitri di TE freddo senza inibitori della proteasi alle perle e incubare a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 giri/min per cinque minuti. Dopo l'ultima fase di lavaggio, risospendere il campione in 100 microlitri di tampone TE integrato con la concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora. Infine, purificare il DNA precipitato con l'ammino utilizzando un kit di purificazione PCR.

Quindi, per verificare se l'IP ha successo, eseguire una qPCR con primer mirati alle regioni di controllo positive e negative. La qPCR è stata eseguita con DNA ChIP IGG, DNA ChIP istone-3-licene-4-trimetilato e DNA ChIP istone-3-licene-27-trimetilato, utilizzando primer per gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi. Risultati rappresentativi dimostrano che Gapdh, un gene housekeeping, è arricchito solo con la modificazione H3K4me3 associata alla trascrizione attiva, e non con la modifica H3K27me3 associata alla cromatina repressa.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ChIP-C per identificare i cambiamenti nei segni istonici, a livello di genoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la ChIP nativa nelle neurosfere per identificare il segno istonico in siti genici specifici.