Name: Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri l'immunoprecipitazione della cromatina nativa per studiare modificazioni istoniche nel glioma utilizzando neurosfere di tumore cerebrale murino. Questo metodo preserva l'integrità cellulare per una maggiore specificità anticorpale.

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Questo lavoro è stato supportato da istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) sovvenzioni R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 a m.g.c.; NIH/NINDS concede R01-NS076991, R01-NS082311 e R01-NS096756 al Domaine; NIH/NINDS R01-EB022563; il reparto di neurochirurgia; Di Leah Happy Hearts e Chad Fondazione ma a m.g.c. e Domaine RNA biomedicina Grant F046166 a m.g.c. f.m.m. è supportato da un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. è supportata dal NIH / NIGMS grant 5T34GM007821-37.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. generazione di tumore cerebrale NS e condizioni di coltura.
<ol><li>Preparare mezzo di cellule staminali neurali (NSC) con supplemento per volta Eagle Medium/F12B27 (1x) di Dulbecco, supplemento N2 (1x) e un reagente di antimicrobici. Supplemento media NSC il giorno di utilizzo con fattore di crescita endoteliale ricombinante umano (EGF) e basic-fibroblast growth factor (FGF) ad una concentrazione finale di 20 ng/mL.</li>
	<li>Indurre il tumore di cervello in mouse utilizzando il sistema di trasposone Sleeping Beauty in cui codifica oncogeni o soppressori tumorali di targeting shRNA plasmidi viene iniettati nei ventricoli laterali dei neonati per generare i tumori di cervello spontanea9. Selezionare un mouse con un grande tumore, che è confermato con formazione immagine di bioluminescenza. Nota: Informazioni più dettagliate sui costrutti dello Sleeping Beauty trasposone System e plasmide usato reperibile in Calinescu et al. 9.<ol>
<li>Per realizzare l'immagine i topi, iniettare 100 µ l di soluzione di luciferina 30mg/mL intraperitonealmente utilizzando un ago di 26 calibro.</li>
		<li>5 min dopo l'iniezione di luciferina, anestetizzare l'animale utilizzando una camera di anestesia con flusso di ossigeno/isoflurano impostata su 2% isoflurane.</li>
		<li>Quando gli animali sono anestetizzati (solitamente 2-3 min), sistemare gli animali nella camera di bioluminescenza con isoflurano ossigeno impostata su 2% isoflurane. Se gli animali saranno sotto anestesia per più di 5 min, è possibile utilizzare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia.</li>
		<li>I topi utilizzando un in vivo sistema con i seguenti parametri di imaging ottico di immagine: esposizione automatica, grande binning e diaframma f = 1. Il parametro a considerarlo un grande tumore è un bioluminescenza > 106 fotoni/s/cm2/sr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanasia il mouse con un overdose di inalazione isoflurane anestetico in una camera chiusa, di pizzico di punta che l'animale è anestetizzato e decapitare il mouse.</li>
	<li>Estrarre il cervello e sezionarla come descritto in precedenza in Calinescu et al. 9.</li>
	<li>Mettere il cervello in un 10cm di Petri. Se il tumore indotto esprime una proteina fluorescente, uso un fluorescenti microscopio per dissezione impostato il canale fluorescente appropriato e ingrandimento 0,3 X, altrimenti identificare massa tumorale delle differenze in tessuto colore e texture. Utilizzare bisturi e pinze per separare il tessuto del tumore dal cervello normale.</li>
	<li>Tritare il tumore a pezzetti nel piatto Petri. Posto il tumore sezionato in una provetta da 1,5 mL con 300 µ l del mezzo NSC.</li>
	<li>Utilizzare un pestello di pallina di plastica usa e getta che si adatta alle pareti di un tubo del microcentrifuge conico per omogeneizzare delicatamente il tumore. Aggiungere 1 mL di medium di distacco cellulare e incubare il campione per 5 min a 37 ° C. Nota: L'uso di un pestello può uccidere alcune cellule. Se il lettore vuole massimizzare l'attuabilità delle cellule, può essere omesso l'uso di un pestello.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare passaggio 1.7 attraverso un colino di cella 70 µm e lavare il filtro con 25 mL di terreno di NSC.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente, decantare il supernatante e risospendere il pellet in 6 mL di terreno di NSC.</li>
	<li>Piastra di sospensione delle cellule del tumore dal passaggio 1,9 in un matraccio di cultura T-25 e cultura e a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO2. Di solito dopo 3 giorni, ci sarà una miscela di alcune cellule morti, rispettati e alcune cellule che formano NS che galleggiano nel mezzo.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL, raccogliere solo le celle che si depositano sul fondo utilizzando una micropipetta e ri-impiattatelo su un pallone di coltura del tessuto T-75.</li>
	<li>Mantenere le cellule relativamente ad alta densità (1-3 X 106 cellule in un T-25). Passaggio delle cellule quando sono confluenti. Nota: Confluency è determinata dalla dimensione sfere. Nero centri di grandi sfere significa che ci sono cellule morte nel centro e indicano che le cellule devono essere attraversate immediatamente.</li>
	<li>Aggiungere i fattori di crescita (EGF e basic-FGF; 20 ng/mL) ogni tre giorni. Modificare il mezzo quando le celle non sono confluenti e i giri medi luce arancione.</li>
	<li>Per modificare il mezzo, raccogliere il vecchio mezzo ed e centrifugare a 300 x g e a temperatura ambiente per 5 min e risospendere il pellet cellulare in NSC supplementato con EGF e FGF alla concentrazione specificata nel passaggio 1.1. Nota: Se le sfere sono a metà-alto confluency, ma non è pronto per essere attraversate (sfera dimensione è piccola, con un diametro < 100 µm), poi il pellet può essere suddiviso in due boccette.</li>
	<li>Per le cellule del passaggio, centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente, decantare il supernatante e incubare le cellule in medium distacco cellulare per 5 min a 37 ° C.<ol>
<li>Aggiungere 5 mL di soluzione salina bilanciata per mezzo di distacco diluito ed e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Decantare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in 18 mL di terreno di NSC e divide la sospensione ugualmente in tre boccette di T-25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per bloccare le aliquote delle cellule, dissociare le cellule come descritto al punto 1.15 e congelare le cellule in aliquote di 1 mL di siero bovino fetale di 90% con 10% di dimetilsolfossido. Raffreddare lentamente le cellule di immissione le cellule sul ghiaccio per 10 min, quindi mantenendo le cellule da-20 ° C per 30 min e -80 ° C per 1 giorni. Il giorno successivo, trasferire le cellule a un contenitore di stoccaggio di azoto liquido.</li>
</ol>2. nativo ChIP
<ol><li>Preparazione della cromatina<ol>
<li>Dopo aver fatto scorta di NS derivata, cultura NS in un T-75 in 15 mL di terreno di NSC a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di aria 95% e 5% CO2 fino a NS diventano confluenti. Una piastra di T-75 confluente resa di 3-5 X 106 celle.</li>
		<li>Quando le cellule diventano confluenti, centrifugare NS a 300 x g per 5 min, decantare il supernatante e aggiungere 1 mL di medium di dissociazione del cellulare. Incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. aggiungere 5 mL di terreno e contare le celle utilizzando un emocitometro10. Nota: 1 x 106 cellule sono necessarie per reazione di immunoprecipitazione (IP). Si noti che un siero pre-immune o IgG controllo deve inoltre essere incluso11.</li>
		<li>Centrifugare il NS in una microcentrifuga da 1,5 mL a 300 x g per 5 min, decantare il supernatante e risospendere il pellet di NS con 1 mL di soluzione salina bilanciata e trasferire la sospensione per provette per microcentrifuga da 1,5 mL associazione povera in proteine.</li>
		<li>NS di centrifugare a 300 x g per 5 min, decantare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 95 µ l di tampone di digestione (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, 0,2% polietilene glicole octylphenyl etere) per 1 x 106 cellule completate con proteasi inibitore cocktail ad un'alta concentrazione (1: 100). Immediatamente dispensare le celle su e giù per evitare l'agglutinamento ed evitare di creare tutte le bolle.</li>
		<li>Risospendere MNase in 50% glicerolo per rendere la soluzione di 1 mg/mL (1.15 unità / µ l, conservato a-20 ° C) che deve essere indicato come stock "1x". Fare un "0,1 x" stock effettuando una seconda diluizione di 1:9 con glicerolo al 50% (ad es., 900 µ l di "1x" MNase e 100 µ l di glicerolo al 50%) e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Mix 5 µ l di "0.1 x" MNase e 145 µ l di tampone di digestione. Mantenere l'enzima sul ghiaccio tutti i tempi. Aggiungere 5 µ l di MNase diluito in tampone di digestione per 1 x 106 cellule. Scorri il tubo di mescolare e collocare la provetta nel blocco di 37 ° C per esattamente 12 min processo i campioni uno alla volta per garantire un tempo di incubazione accurata di 12 min.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di 10 x MNase smettere di Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM EDTA) per 1 x 106 cellule. I campioni devono essere tenuti al ghiaccio da questo punto in poi.</li>
		<li>Aggiungere 110 µ l "2 x RIPA buffer" (280 mM NaCl, 1,8% polietilene glicole octylphenyl etere, 0,2% sodio dodecil solfato (SDS), 0,2% Na-desossicolato, 5mm glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA); conservato a 4 ° C) completati con inibitore della proteasi cocktail ad alta concentrazione (1: 100) per 1 x 106 cellule. Scorri il tubo per mescolare.</li>
		<li>Centrifugare le provette per 15 min in un microfuge a 4 ° C e 1700 x g. trasferire il surnatante di un nuovo microcentrifuga regolari 1,5 mL (microcentrifuga povera in proteine associazione non è più necessari) e memorizzarli sul ghiaccio. Scartare il pellet.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitazione (IP)<ol>
<li>Mix di proteina A e proteina G sfere magnetiche in un rapporto 1:1. Per ogni IP, preparare 25 µ l di perline.</li>
		<li>Lavare le perle aggiungendo 1 mL di tampone RIPA (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polietilene glicole octylphenyl etere, SDS 0,1%, 0,1% Na-desossicolato; conservato a 4 ° C) completati con gli inibitori di proteasi a bassa concentrazione (1: 1000).</li>
		<li>Utilizzare un magnete per consentire perline separare dalla soluzione di lavaggio e decantare la soluzione di lavaggio (circa 1 min). Eseguire la fase di lavaggio due volte.</li>
		<li>Risospendere le perle al volume originale utilizzando RIPA buffer completati con inibitori della proteasi (1: 1000).</li>
		<li>Se necessario, diluite la cromatina utilizzando RIPA buffer completati con inibitori della proteasi (1: 1000) in modo che ogni IP ha un volume di 100-200 µ l. riserva 10% del volume utilizzato per IP della cromatina per l'input. Nota: ad esempio, se 200 µ l sono usati per IP, 20 µ l di cromatina diluita dovrebbe essere riservata per l'input. Per un totale di quattro IPs, il volume totale della cromatina deve essere diluito a 820 µ l.</li>
		<li>Preparare l'input. Aggiungere 100 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) completati con proteinasi K (0,5 mg/mL) all'ingresso e incubare l'input a 55 ° C per 1 h. Nota: 2.2.6-2.2.7 procedura può essere eseguita insieme a punti 2.3.4 e 2.4.1.</li>
		<li>Purificare l'input utilizzando un kit di purificazione di PCR seguendo le istruzioni del produttore ed eluire in 50 µ l di tampone di eluizione fornite nel kit.</li>
		<li>Misurare la concentrazione dell'ingresso tramite uno spettrofotometro di microvolume e registrare i risultati in un notebook. Vuoto con tampone di eluizione da kit. Nota: In mouse neurosfere, abbiamo usato circa 6 µ g di DNA per ogni IP.</li>
		<li>Eseguire input su un gel di 1% o caricare 1 µ l su un DNA Bioanalyzer utilizzando le impostazioni standard. Conservare il resto per l'utilizzo come input nelle applicazioni a valle.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di proteina lavata A & G perle magnetiche per ogni IP e IP di incubare per 1 h a 4 ° C. Nota: ad esempio, aggiungere 30 µ l di proteina A & G magnetici perline per tre IPs.</li>
		<li>Posizionare i campioni su un magnete e consentire perline separare. Dividere della cromatina trasferendo l'importo precedentemente determinato in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo e avvolgere i tappi con pellicola di plastica paraffina per evitare l'evaporazione. Incubare i campioni durante la notte a 4 ° C con rotazione a 20 giri/min. Nota: La concentrazione deve essere determinata empiricamente seguendo i consigli del produttore.</li>
		<li>Il giorno successivo, girare i tubi usando una mini centrifuga a temperatura ambiente, 2000 x g per 10 s. Aggiungere 10 µ l di perline per ogni IP, quindi incubare IP per 3 h a 4 ° C con rotazione a 20 giri/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavaggi IP e digestione delle proteine<ol>
<li>Aggiungere 150 µ l di tampone RIPA completati con gli inibitori di proteasi a bassa concentrazione (1: 1000) per ogni IP e IP di incubare a 4 ° C con rotazione a 20 rpm per 5 min posto il campione su un supporto magnetico e consentire i branelli magnetici separare. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Ripetere questa tep cinque lavaggi.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di tampone di LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% Na-desossicolato; conservare a 4 ° C) completati con gli inibitori di proteasi a bassa concentrazione (1: 1000) per ogni IP e incubare IP a 4 ° C con rotazione a 20 rpm per 5 min posto il campione su un supporto magnetico sostare e permettere a biglie magnetiche separare. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di TE freddo (senza inibitori di proteasi) e incubare il campione a 4 ° C con rotazione a 20 rpm per 5 min posto il campione su un supporto magnetico e biglie magnetiche separare. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, risospendere il campione in 100 µ l di buffer di TE completati con proteinasi K (0,5 mg/mL) e incubare il campione a 55 ° C per 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificazione del DNA e PCR Real-Time quantitativa (qPCR) di ChIP<ol>
<li>Purificare il DNA immunoprecipitati utilizzando un kit di purificazione di PCR. Dopo aggiunta di DNA binding buffer dal kit per ciascun campione, posizionare il tubo su un magnete e attendere che biglie magnetiche aggregazione, quindi trasferire il surnatante per la colonna di pulitura. Seguire le istruzioni del produttore ed eluire in 50 µ l di tampone di eluizione fornite nel kit.</li>
		<li>Per verificare se l'IP è riuscito, eseguire un qPCR. Idealmente, dovrebbero essere progettati gli iniettori per le regioni di controllo positivo e negativo. Nota: ad esempio, per un indirizzo IP eseguite con H3K4me3 e H3K27me3, i seguenti campioni devono essere eseguiti su qPCR: input H3K4me3, H3K27me3 e IgG ChIP DNA, DNA e un controllo privo di templato (NTC) utilizzando primers per regioni di essere arricchiti con H3K4me3 (controllo positivo) e regioni di essere arricchiti con H3K4me3 (controllo negativo); allo stesso modo, per H3K27me3.</li>
		<li>Seguire i protocolli standard per eseguire qPCR12. Brevemente, eseguire un qPCR mediante SYBR green mix master, 0,5 µ l di concentrazione di lavoro 10 µM di ogni primer forward e reverse e 2 µ l di DNA input o ChIP. Leggere piastre utilizzando un sistema di Real Time PCR. Sequenze dell'iniettore sono forniti nella tabella 2. Le sequenze dell'iniettore di Gapdh da Hwang et al. erano usate13.</li>
		<li>Analizzare i dati del ChIP rispetto all'input, cioè, per cento ingresso metodo (% IP)14. Calcolare la percentuale di input mediante le seguenti formule: Regolata l'input = media ct (ingresso)-log2(DF) dove DF è il fattore di diluizione dell'input iniziale e DF = volume totale di IP / volume dell'input % IP = 100 × 2 ^ (regolato ingresso - Ct (IP)) dove Ct è il fattore di soglia.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+B+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22">Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking</a>. , (2001).</li>
<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediumted+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+separable+roles+for+EZH2+in+neurogenic+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia.</a> Elife. 3, e02439(2014).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato qui consentirà all'utente di eseguire ChIP nativo su NS derivate da tumori cerebrali geneticamente. A differenza di cross-linking ChIP, questo protocollo è limitato per lo studio delle proteine che associano strettamente con DNA6. Il numero di celle utilizzate possa essere modificato come necessario e il protocollo può essere scalato. Abbiamo usato 1 X 106 cellule per IP, tuttavia, ChIP nativo può essere effettuata anche con appena 4 x 104 cellule<sup...

Eventi epigenetici sono frequenti nei gliomi e probabilmente svolgono un ruolo importante nella patogenesi del tumore. Infatti, in pediatric glioma di alto grado, mutazioni in geni codificanti varianti istone H3.3 e H3.1 si verificano frequentemente1. Le mutazioni riguardano modifiche istoniche e presentano importanti conseguenze epigenetici2,3. Nell'adolescente adulto dello spettro, ricorrenti mutazioni nel gene della Isocitrato deidrogenasi 1/2 (IDH1/2), una mutazione che inibisce la α-KG dipendente degli istoni e DNA de-methylasaes e le alterazioni genetiche in altri regolatori della cromatina come ATRX e DAXX verificano 4. Pertanto, è di importanza critica per studiare come le mutazioni che colpiscono i regolatori epigenetici alterano la struttura della cromatina e modificazioni istoniche normativo, che, a loro volta, hanno un impatto drammatico del trascrittoma delle cellule del tumore.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente strumento usato per valutare l'impatto delle modificazioni epigenetiche nel genoma5,6,7. Nel ChIP nativo, cromatina è digerita con nucleasi di micrococcal (MNase), immunoprecipitati utilizzando un anticorpo contro la proteina di interesse, e quindi il DNA è purificato dal immunoprecipitati cromatina complesso6. Le cellule non sono fissi durante la procedura, quindi questa tecnica è applicabile solo per lo studio delle proteine che interagiscono strettamente con DNA6. L'assenza di cross-linking aiuta la specificità dell'anticorpo poiché gli anticorpi solitamente vengono sollevati contro peptidi o proteine unfixed7. Inoltre, poiché non vi è alcun passaggio di cross-linking, ciò riduce le possibilità di fissaggio interazioni proteina-DNA transitoria che sono aspecifici e non normativo7,8. Circuito integrato può essere utilizzato per identificare l'arricchimento delle modificazioni istoniche in una specifica regione genomica. Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per l'esecuzione di ChIP nativo in neurosfere (NS) generato da geneticamente ingegnerizzati modelli murini di glioma.

<table><tbody><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R, refrigerato</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 topo</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sale di potassio</td><td>Goldbio</td><td>LuckK-1g</td><td></td></tr><tr><td>Cremagliera magnetica DiaMag1.5</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>per lavaggi di biglie magnetiche</td></tr><tr><td>DiaMag Rotator EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td></td></tr><tr><td>rotator DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC component</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>protein A biglie magnetiche</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>proteina G perline magnetiche</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>preparare 20 &mu; g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota.</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Reagente tampone Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(&beta;-etere amminoetilico)-Acido N,N,N',N'-tetraacetico) (EGTA)</td><td>Reagente tampone Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612 Reagente</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>per il congelamento delle cellule</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>Preparare 20 &mu; g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota.</td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>per la dissezione del tumore</td></tr><tr><td>Glicerolo, grado MB</td><td>EMD- Millipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>soluzione salina bilanciata</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>anestetico per inalazione</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>sistema di imaging ottico in vivo</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>terreno di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Cloruro di litio</td><td>Sigma</td><td>L8895</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>a basso legame Microprovette</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>a basso legame proteico Provetta per microcentrifuga</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>provetta per microcentrifuga normale</td></tr><tr><td>Nucleasi micrococcica</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>ogni lotto può differire; acquistare una quantità sufficiente per esperimenti e aliquota.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Componente NSC</td></tr><tr><td>Normale Coniglio IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>agente antimicrobico, utilizzare a 0,1 mg/mL.</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td><td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>Kimble Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>aliquotare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>La protinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>produce 10 mg/mL di stock in acqua; aliquotare e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR Kit di purificazione</td> del <td>DNA</td><td>Qiagen</td><td>28104</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-16</td><td>per la dissezione del tumore</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td>Reagente tampone</td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>reagente tampone</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>polietilenglicole ottilfeniletere</td></tr> Mini <tr><td>centrifuga standard</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>mini centrifuga standard</td></tr><tr><td>Microscopio da</td><td>dissezione fluorescente</td> <td>Olympus</td><td>SZX16</td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale ViiA 7 con blocco rapido a 96 pozzetti</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Modificazioni epigenetiche possono essere coinvolti nello sviluppo e nella progressione del glioma. Cambiamenti nella metilazione e acetilazione dei promotori e regioni regolatorie di oncogeni e soppressori tumorali possono condurre ai cambiamenti nell'espressione genica e svolgono un ruolo importante nella patogenesi dei tumori cerebrali. Immunoprecipitazione della cromatina nativo (ChIP) è una tecnica popolare che permette la rilevazione di modifiche o altre proteine strettamente legate al DNA. Contrariamente a reticolato ChIP, chip nativo, le cellule non sono trattate con formaldeide per collegare covalentemente proteina al DNA. Questo è vantaggioso perché a volte reticolazione può fissare le proteine che solo transitoriamente interagiscono con il DNA e non hanno significato funzionale nella regolazione genica. Inoltre, gli anticorpi vengono generalmente sollevati contro peptidi non fissati. Di conseguenza, specificità dell'anticorpo è aumentata di ChIP nativo. Tuttavia, è importante tenere a mente che è applicabile per studiare gli istoni o altre proteine che legano strettamente al DNA solo ChIP nativo. Questo protocollo descrive l'immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Una rappresentazione schematica del tumore NS generata da un tumore al cervello dove le cellule del tumore di cervello sono Katushka positivo è presentata nella Figura 1. Figura 2 è una rappresentazione schematica della tecnica ChIP intera. Figura 3 Mostra i risultati rappresentativi della cromatina da tumore cerebrale NS digerito con MNase per 12 min, ottenendo una maggioranza di mono, di- e tri-nuc...

Meccanismi epigenetici sono frequentemente alterati nei gliomi. Immunoprecipitazione della cromatina poteva essere utilizzati per studiare le conseguenze delle alterazioni genetiche in glioma risultanti dalle modifiche in modificazioni istoniche che regolano la trascrizione di gene e la struttura della cromatina. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare l'arricchimento dei segni istonici in una specifica posizione genomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, come ad esempio il modo in cui le mutazioni nei regolatori epigenetici che alterano le modificazioni degli istoni influiscono sul trascrittoma delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule non sono reticolate, quindi sono in uno stato più naturale, il che può aiutare la specificità degli anticorpi.Inizia sezionando il tumore indotto sperimentalmente dal cervello di un topo in una capsula di Petri di 10 centimetri. Se il tumore esprime una proteina fluorescente, visualizzare il tumore attraverso un microscopio da dissezione fluorescente impostato sul canale fluorescente appropriato con un ingrandimento di 0,3 volte. Usa un bisturi e una pinza per separare il tessuto tumorale dal cervello normale e trita il tumore in piccoli pezzi nella capsula di Petri.Trasferire il tumore sezionato in una provetta da 1,5 millilitri con 300 microlitri di terreno NSC e utilizzare una siringa monouso per omogeneizzare delicatamente il tumore. Quindi, aggiun

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L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

Fonte: Mendez, F. M. et al., Immunoprecipitazione della cromatina nativa utilizzando neurosfere tumorali cerebrali mure. J. Vis. Exp. (2018). Questo video dimostra l'isolamento di complessi proteina-DNA da cellule della neurosfera derivate da un tumore cerebrale di topo utilizzando l'immunoprecipitazione nativa della cromatina. Descrive in dettaglio le fasi per la preparazione della cromatina, l'immunoprecipitazione, il lavaggio e la digestione delle proteine per rilasciare il DNA per l'analisi...

Immunoprecipitazione nativa della cromatina delle cellule della neurosfera

Fonte: Núñez, F. J., et al. Valutazione dei biomarcatori nel glioma mediante immunoistochimica su colture di neurosfere di glioma 3D incluse in paraffina. J. Vis. Exp. (2019). Questo video mostra una tecnica immunoistochimica per l'etichettatura di biomarcatori tumorali nelle neurosfere tumorali cerebrali incluse in paraffina. Le sezioni della neurosfera subiscono la rimozione e la reidratazione della paraffina, seguite da un trattamento per esporre i siti dei biomarcatori. Gli anticorpi...

Colorazione immunoistochimica di biomarcatori in sezioni di neurosfera tumorale cerebrale

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Qui descriviamo un protocollo efficiente e versatile per indurre, monitorare e analizzare nuovi glioblastomi (GBM) utilizzando DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonatali. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche isto-patologiche del GBM umano.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Lo sviluppo di modelli ortotopici di tumore cerebrale pediatrico richiede una precisione meticolosa, utilizzando un dispositivo stereotassico per impiantare con precisione le cellule tumorali. La metodologia qui presentata delinea le fasi coinvolte nella preparazione delle cellule tumorali cerebrali, nell'esecuzione di iniezioni intracraniche e nell'implementazione di un sistema di monitoraggio post-operatorio per valutare l'attecchimento del tumore cerebrale.

Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

Scopri l'immunoprecipitazione della cromatina nativa per studiare modificazioni istoniche nel glioma utilizzando neurosfere di tumore cerebrale murino. Questo metodo preserva l'integrità cellulare per una maggiore specificità anticorpale.

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

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