Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

L'obiettivo generale di questa tecnica di fotoconversione è quello di distinguere le singole cellule di un singolo animale da altre popolazioni di cellule fluorescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sullo sviluppo nel campo e permetterci di visualizzare la migrazione di singole cellule nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è minimamente invasiva e può essere utilizzata per marcare singole cellule o popolazioni più grandi.

Inoltre, l'utente può selezionare la regione specifica di interesse e convertire le foto dell'obiettivo desiderato. Dopo l'accoppiamento di pesce zebra transgenico maschio e femmina che esprimono una proteina fotoconvertibile e la raccolta delle uova secondo il protocollo di testo, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente di luce a 488 nanometri e set di filtri GFP per esaminare 24 embrioni hpf. Usando un ago o una pinzetta, decoionare manualmente gli embrioni.

Preparare nel microonde, cinque millilitri di soluzione di agarosio a basso punto di fusione allo 0,8%. Una volta che l'agarosio si è raffreddato al tatto, posizionare tre o quattro pesci transgenici anestetizzati sox10 eos positivi 48 hpf al centro di una capsula di Petri con fondo coprioggetto in vetro da dieci millimetri. Aggiungere circa un millimetro, o abbastanza agarosio per coprire la superficie del vetrino coprioggetto.

Quindi, utilizzare un ago sonda per disporre i pesci sui lati, regolandoli secondo necessità, mentre l'agarosio si solidifica, il che richiederà circa due minuti. Dopo che l'agarosio si è solidificato per due minuti, aggiungere lentamente il terreno embrionale contenente lo 0,02% di estere tricaina dell'acido aminobenzoico al piatto, fino a quando la superficie inferiore dell'agar e del piatto è sommersa. Per eseguire la microscopia confocale, aprire il software confocale e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco.

Per eseguire l'imaging pre-conversione, nella finestra di acquisizione e nella scheda a discesa delle impostazioni di acquisizione, selezionare i parametri di imaging. Ecco l'impostazione dello stack specifica del laboratorio è chiamata, imaging dei pesci. Posizionare il campione sul microscopio confocale e utilizzare le manopole di regolazione grossolana e fine per portarlo a fuoco.

Quindi apri la finestra di messa a fuoco e individua la regione di interesse desiderata, come il ganglio della radice dorsale. Nel menu di impostazione del filtro, selezionare il laser c488, impostare l'esposizione su 300 millisecondi, la potenza del laser su cinque e l'intensificazione su 75. Successivamente, nella sezione del tipo di acquisizione, seleziona la casella 3D.

Nella sezione Acquisizione 3D, selezionare Usa posizione corrente e controllare l'intervallo intorno alla corrente. Nella stessa sezione impostare l'intervallo su 35, il numero di piani su 36 e la dimensione del passo su uno. Seleziona la posizione corrente, quindi fai clic su Avvia nella parte inferiore della finestra di acquisizione per acquisire un'immagine.

Prima del processo di fotoconversione, assicurati di controllare due e tre volte i parametri del laser. A volte è necessario regolare nuovamente le impostazioni di conversione, quando la finestra di conversione è aperta. Nella finestra di acquisizione, nella scheda a discesa delle impostazioni della finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di conversione specifica del lab.

Qui l'impostazione specifica del laboratorio è chiamata, pesce ablare chip completo. Nel menu del filtro impostato, selezionare i laser c488 e c541. Imposta le esposizioni a 300 millisecondi, la potenza del laser a cinque e l'intensificazione a 75, che produrrà un segnale fluorescente sufficiente senza causare fotosbiancamento o tossicità.

Nella finestra di messa a fuoco, fare clic sulla scheda di fotomanipolazione e modificare la potenza del laserstack su due, quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco raster in uno e fare clic su imposta. Quindi modificare la dimensione del doppio clic su quattro e la linea laser su v405.

Successivamente, nella finestra di acquisizione apri le impostazioni di acquisizione avanzate. Seleziona la scheda di fotomanipolazione e modifica le ripetizioni del doppio clic su due, quindi fai clic su OK. Selezionare la scheda xy nella finestra di messa a fuoco.

Nella scheda fotomanipolazione, ricontrolla i parametri del laser. Quindi, imposta le impostazioni del laser per fotoconvertire la cella di interesse, senza fotoconversione delle celle circostanti. In Tipo di acquisizione, seleziona la casella timelapse, quindi fai clic su Avvia.

Una volta aperta la finestra del timelapse in tempo reale, seleziona lo strumento cerchio sulla barra degli strumenti in alto. Disegna un cerchio nella regione più centrale della cella, quindi fai clic con il pulsante destro del mouse sul cerchio disegnato, seleziona Regione FRAP e attendi tre secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare più scura, quando fa clic su Interrompi acquisizione.

Se si esegue l'imaging di più di un animale, tornare alla scheda xy nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione due. Quindi, ripeti la fotoconversione. Per convertire una popolazione di cellule, seguire il protocollo e i perametri laser aprendo la finestra timelapse.

Ora, invece di disegnare un cerchio per FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea sulla regione di interesse. Quindi, FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri appena dimostrati. Una volta fotoconvertiti tutti i punti, nella scheda a discesa delle impostazioni di acquisizione nella finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione dello stack standard specifica del lab descritta in precedenza in questo video.

Seleziona il laser c488 e imposta l'esposizione su 300 millisecondi, la potenza del laser su cinque e l'intensificazione su 75. Seleziona il laser c541 e imposta l'esposizione a 500 millisecondi, la potenza del laser a dieci e l'intensificazione a 75. Nella sezione del tipo di acquisizione, seleziona la casella 3D.

Nella sezione Acquisizione 3D, selezionare Usa posizione corrente e controllare l'intervallo intorno alla corrente. Nella stessa sezione, impostare l'intervallo su 35, il numero di piani su 36 e la dimensione del passo su uno. Il numero dell'intervallo può aumentare o diminuire, per adattarsi alla profondità di imaging desiderata.

Se sono presenti punti multipli nella scheda di messa a fuoco xy, nella finestra di acquisizione, selezionare l'opzione dell'elenco multipunti. In caso contrario, selezionare la posizione corrente. Infine, nella parte inferiore della finestra di acquisizione, fare clic su Avvia per acquisire un'immagine.

Questi pannelli mostrano una singola cellula di pre-fotoconversione, all'interno di un ganglio di un pesce zebra transgenico, che esprime la proteina eos fotoconvertibile, sotto il controllo della sequenza regolatoria sox10. Dopo la fotoconversione, eos era distintamente presente all'interno della regione di interesse, mentre nessuna cella vicina era marcata. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica di fotoconversione, una popolazione di cellule nel lato ventrale del midollo spinale è stata esposta alla luce UV, utilizzando una linea.

Successivamente, sono state scattate immagini che mostrano la proteina eos fotoconvertita nella regione della linea. La proteina eos non fotoconvertita era visibile in tutte le altre aree. Diverse ore dopo la fotoconversione, sono state scattate immagini identiche che mostravano cellule eos positive fotoconvertite sparse in tutta la regione del midollo spinale, sia in posizione dorsale che ventrale.

Questa scoperta è coerente con l'ipotesi che le cellule spinali ventrali si siano trasferite in posizioni dorsali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-45 minuti, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di scattare un'immagine post-conversione, per confermare che la tua regione di interesse ha sperimentato la fotoconversione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging timelapse per osservare la migrazione cellulare e la dinamica nel tempo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come distinguere le singole cellule all'interno di una popolazione di cellule fluorescenti. Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre le precauzioni necessarie durante l'esecuzione di questa procedura.

Ad esempio, non fissare mai direttamente la luce.