Name: Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara la tecnica di fotoconversione cellulare in Danio rerio intatto per distinguere singole cellule fluorescenti. Questo metodo minimamente invasivo consente di visualizzare la migrazione cellulare nel tempo.

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Grazie a Bernard Kulemaka e membri del lab Smith per loro utili commenti e guida di reagente, Sam Connell e Brent Redford di 3i per mettere in campo imaging domande e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart per la cura di zebrafish. Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Notre Dame, l'Elizabeth e Michael Gallagher Family, la Fondazione Alfred P. Sloan, Centro Zebrafish ricerca presso l'Università di Notre e centro di cellule staminali e medicina rigenerativa presso l'Università di Notre Dame. Tutti gli studi sugli animali sono stati fatti in conformità con la University of Notre Dame IACUC al Dr. Cody Smith.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione del campione di Zebrafish
<ol><li>Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard13. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce9 a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della proteina può essere ugualmente usato. Impostare più di una camera nel caso in cui il pesce non posare. Consentire il pesce a rimanere nella camera durante la notte.</li>
	<li>La mattina successiva, raccogliere le uova in piastre Petri da 100 mm. Consentire uova di maturare alla post-fecondazione 24h (hpf) prima proiezione.</li>
	<li>Se gli animali di cui sopra erano eterozigoti per il transgene, schermo 24 hpf piatti per Tg(sox10:eos) + embrioni con un 488 nm sorgente e GFP filtrare i set su un microscopio per dissezione. Isolare Tg(sox10:eos) + embrioni e permettono di maturare a 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embrioni manualmente con un ago o una pinzetta.</li>
	<li>Preparare e microonde 5 mL di soluzione di agarosio di punto basso punto di fusione dello 0,8%.<ol>
<li>Una volta fredde al tatto dell'agarosi, posto 3-4 anestetizzati Tg (sox10:eos) + 48 pesce hpf al centro di un coprioggetto in vetro-10 mm inferiore di Petri.</li>
		<li>Aggiungere sufficiente dell'agarosi per coprire la superficie del vetrino coprioggetti, circa 1 mL. Utilizzare un ago sonda per disporre il pesce sui loro lati. Consentire l'agarosio a solidificare per garantire il montaggio degli animali. Può essere necessario continuamente ri-organizzare il danio zebrato, fino a quando l'agar solidifica14. Solidificazione dura circa 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'agarosio è solidificato per 2 min, aggiungere lentamente il mezzo di embrione contenente 0,02% acido aminobenzoic estere (tricaina) a piatto fino a quando la superficie inferiore dell'agar e il piatto è sommerso. Questo dovrebbe essere circa 3mL.</li>
</ol>2. microscopio montaggio e pre-conversione Imaging
<ol><li>Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "pesce di Imaging".</li>
	<li>Inserire esemplare nell'ambito confocale e mettere a fuoco usando il corso e le manopole di regolazione fine.</li>
	<li>Aprire la finestra di messa a fuoco e individuare l'area desiderata di interesse (cioè gangli delle radici dorsali).</li>
	<li>Selezionare il laser c488 sotto il menu filtro impostato. Impostare l'esposizione a 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].</li>
	<li>La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. La gamma può essere aumentata o diminuita per ospitare per la profondità dell'area di imaging. Per il midollo spinale un valore compreso tra 35-40 stack è in genere sufficiente [Figura 5].</li>
	<li>Selezionare la posizione corrente [Figura 5].</li>
	<li>Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.</li>
</ol>3. single-cell fotoconversione
<ol><li>Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "Pesce l'ablazione chip completo."</li>
	<li>Selezionare il laser c488 e c541 sotto il menu filtro impostato. Se non si utilizza lo stesso software di microscopio, trovare il menu per selezionare diversi laser e selezionare la 488 nm e 541 nm laser. Impostare le esposizioni ai 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2]. Queste impostazioni di laser vengono selezionate in base a produrre abbastanza segnale fluorescente senza causare tossicità o photobleaching. Se è visualizzata la tossicità o photobleaching, ridurre potenza laser o esposizione.</li>
	<li>Aprire la finestra di messa a fuoco e fare clic sulla scheda photomanipulation nella finestra di messa a fuoco. Regolare di conseguenza i parametri laser. Modificare la potenza del laser dello stack a 2 e quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco Raster 1 e fare clic su imposta. Modificare le dimensioni di doppio clic a 4. Modificare la linea laser a v405 [Figura 3].</li>
	<li>Aprire le impostazioni di acquisizione avanzate nella finestra di acquisizione. Selezionare la scheda photomanipulation e modificare le ripetizioni fare doppio clic su 2. Fare clic su OK [Figura 4].</li>
	<li>Selezionare la scheda XY nella finestra di messa a fuoco. Ricontrollare i parametri laser dal passaggio 2 nella scheda photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Impostare impostazioni laser fotoconvertita la cella di interesse senza fotoconversione delle cellule circostanti.<ol>
<li>Se fotoconversione delle celle adiacenti è presente, ridurre la potenza del laser. Se fotoconversione delle cellule non si verifica, poteri del laser possono essere aumentate. Impostare in modo ottimale, potenza laser fotoconvertita solo la regione di interesse e non le zone circostanti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare la casella di timelapse sotto tipo di cattura. Quindi, fare clic su Start [Figura 6A].</li>
	<li>Una volta aperta la finestra di live della webcam, selezionare lo strumento cerchio sulla barra superiore [Figura 7]</li>
	<li>Disegnare un cerchio nella regione più centrale della cellula. Fare clic destro il cerchio disegnato, selezionare regione FRAPe attendere 3 secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare dimmer [Figura 8]. Scegliere Interrompi acquisizione.</li>
	<li>Se più di un animale di imaging, tornare alla scheda XY nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione 2. Quindi, ripetere i passaggi 4.1-4.6.</li>
	<li>Per convertire una popolazione di cellule, seguire i parametri di protocollo e laser per la procedura 4.1-4.4 tranne invece di disegnare un cerchio di FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea. Tracciare una linea sulla regione di interesse e FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri sopra elencati.</li>
</ol>4. post-fotoconversione Imaging
<ol><li>Una volta che tutti i punti sono photoconverted. Selezionare lo stack di immagine standard di laboratorio specifiche impostazione descritta in precoversion passo 3 di imaging. Questo si trova sotto all'opzione cattura impostazione scheda a discesa nella finestra di cattura [Figura 5].</li>
	<li>Selezionare il laser c488 e impostare l'esposizione a 300ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].</li>
	<li>Selezionare il laser c541 trovato sotto lo stesso menu come il laser c488. Impostare l'esposizione a 500 ms, laser di potenza a 10 e intensificare a 75 [Figura 9].</li>
	<li>La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. Il numero di serie può aumentare o diminuire per accomodare la profondità imaging desiderata [Figura 5].</li>
	<li>Se esistono più punti nella scheda di messa a fuoco XY, è possibile selezionare l'opzione multipunto elenco nella finestra di acquisizione. In caso contrario, selezionare la posizione corrente.</li>
	<li>Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In tessuti complessi, distinti tipi di cellule si organizzano in domini specifici. Recentemente sono state utilizzate tecniche a singole celle etichetta all'interno di queste strutture di grande tessuto1,2,3. Qui dimostriamo due tecniche che possono essere utilizzate allo stesso modo per visualizzare interazioni cellula singola e interazioni di popolazione delle cellule all'interno di tessuti complessi. Il vantaggio della tecnic...

Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno sviluppato numerose tecniche per realizzare questo compito1,2,3,4.
L'individuazione e l'attuazione della proteina fluorescente Medusa verde (GFP) è stato un approccio emozionante che ha permesso per l'etichettatura di cellule distinte in un tessuto ambiente1. Utilizzando promotori di cellula-specifico, è possibile selezionare geneticamente un sottoinsieme delle cellule che sono classificati come1. In alternativa, l'espressione virale indotta di GFP può essere utilizzato per utente-selezionato espressione della GFP3,4. Anche se molto utile, espressione genetica mediata di GFP non consente l'espressione selezionata dall'utente all'interno di un sottoinsieme delle cellule nel tessuto; e l'espressione virale di GFP, sebbene vantaggioso, può essere invasivo. Con l'avvento di GFP derivati e tecniche intelligente come Brainbow di esprimere distinte proteine fluorescenti più scarsamente all'interno dei tessuti, è diventato possibile visualizzare singole cellule e le interazioni tra loro nel complesso tessuto2, 5. Tuttavia, questi approcci marcare le cellule in modo casuale. Se l'esperimento desiderata richiede la visualizzazione di una singola cella o popolazione di cellule che è definita dallo sperimentatore, pertanto sono limitati. Con tali esperimenti, sarebbe vantaggioso avere una proteina fluorescente geneticamente espressa che può essere manipolata per distinguere, in maniera singola cella, e da altre cellule fluorescenti e non fluorescenti.
Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare la biologia cellulare di cellule singole all'interno di un tessuto vivente complesso, la comunità scientifica utilizza fotoconversione unicellulare di distinte proteine fluorescenti6,7,8. Espressione di una proteina di fotoconvertibile (cioè, eos, kaede, ecc.) che passa dal verde al rosso fluorescente stato quando esposto ai raggi UV con geneticamente controllata (488 nm) luce, possiamo distinguere una singola cella da sua fluorescente contrassegnati i vicini6,7,8. Questo approccio utilizza un apparecchio attaccato al nostro microscopio confocale che possa indirizzare la luce da una pila di laser a una regione di diffrazione limitata di interesse. Con questa tecnica, possiamo etichettare o singole cellule o più grandi popolazioni in un modo definito dall'utente9,10,11. La tecnica è mini-invasiva rispetto alle iniezioni di singola cellula di GFP virale. Come un proof of concept, mostriamo che possiamo fotoconvertita singole cellule all'interno di un ganglio nel sistema nervoso periferico e fotoconvertita più grandi popolazioni come cellule situate sul lato ventrale del midollo spinale9,10, 11,12. Quindi possiamo visualizzare queste popolazioni di cellule photoconverted 24 h più tardi per guadagnare la comprensione nel loro movimento e la differenziazione durante lo sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) animali zebrafishI</td><td></td><td></td> <td>pesci sono stati ottenuti e incrociati dall'impianto ittico dell'Università di Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm capsula di Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embrione medio</td><td></td><td></td><td>Il terreno embrionale viene prodotto settimanalmente e fornito dalla struttura ittica dell'Università di Notre Dame contenente 5 litri di acqua RO, 30 litri di blu di metilene e 200 ml di brodo di sale.</td></tr><tr><td>0,8% Punto di fusione basso Agarosio</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm vetro-vetrino fondo capsula di Petri</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr>Sonda <td></td><td></td><td></td><td>da dissezione ad ago</td></tr><tr><td>0,002% estere dell'acido 3-aminobenzoico (tricaina)</td>Microscopio da dissezione <td>fluorescente Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>con filtri GFP</td> Microscopio confocale <td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con laser per eccitare set di filtri GFP e RFP</td><td>3i confocale</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>a disco rotanteSorgente di luce UV (laser) per fotoconversione</td> laser <td></td><td></td><td>a 405 nm</td></tr><tr><td>Software Slidebook</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cella singola fotoconversione in zebrafish intatto vivente

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Tessuto animale e vegetale è composto da popolazioni distinte delle cellule. Queste cellule interagiscono nel tempo per costruire e mantenere il tessuto e possono causare la malattia quando perturbato. Gli scienziati hanno sviluppato tecniche intelligente per studiare le caratteristiche e dinamiche naturali di queste cellule all'interno del tessuto intatto esprimendo proteine fluorescenti in sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, a volte, gli esperimenti richiedono più selezionato visualizzazione delle cellule all'interno del tessuto, a volte alla maniera unicellulare o popolazione di cellule. Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare le singole celle all'interno di una popolazione di cellule, gli scienziati hanno utilizzato fotoconversione unicellulare di proteine fluorescenti. Per illustrare questa tecnica, vi mostriamo qui come dirigere la luce UV a una cella che esprimono Eos di interesse in un intatto, vivono zebrafish. Abbiamo quindi immagine quelle cellule di Eos+ photoconverted 24 h più successivamente per determinare come sono cambiate nel tessuto. Descriviamo due tecniche: singola cella fotoconversione e photoconversions delle popolazioni della cellula. Queste tecniche possono essere utilizzate per visualizzare le interazioni cellula-cellula, cellula-destino e differenziazione e migrazioni delle cellule, che lo rende una tecnica che è applicabile a numerose domande biologiche.

Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto6. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce9 sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi verifi...

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di fotoconversione è quello di distinguere le singole cellule di un singolo animale da altre popolazioni di cellule fluorescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sullo sviluppo nel campo e permetterci di visualizzare la migrazione di singole cellule nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è minimamente invasiva e può essere utilizzata per marcare singole cellule o popolazioni più grandi.Inoltre, l'utente può selezionare la regione specifica di interesse e convertire le foto dell'obiettivo desiderato. Dopo l'accoppiamento di pesce zebra transgenico maschio e femmina che esprimono una proteina fotoconvertibile e la raccolta delle uova secondo il protocollo di testo, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente di luce a 488 nanometri e set di filtri GFP per esaminare 24 embrioni hpf. Usando un ago o una pinzetta, decoionare manualmente gli embrioni.Preparare nel microonde, cinque millilitri di soluzione di agarosio a basso punto di fusione allo 0,8%. Una volta che l'agarosio si è raffreddato al tatto, posizionare tre o quattro pesci transgenici anestetizzati sox10 eos positivi 48 hpf al centro di una capsula di Petri con fondo coprioggetto in vetro da dieci millimetri. Aggiungere circa un millimetro, o abbastanza agarosio per coprire la superficie del vetrino coprioggetto.Quindi, utilizzare un ago sonda per disporre i pesci sui lati, regolandoli secondo necessità, mentre l'agarosio si solidifica, il che richiederà circa due minuti. Dopo che l'agarosio si è solidificato per due minuti, aggiungere lentamente il terreno embrionale contenente lo 0,02% di estere tricaina dell'acido aminobenzoico al piatto, fino a quando la superficie inferiore dell'agar e del piatto è sommersa. Per eseguire la microscopia confocale, aprire il software confocale e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco.Per eseguire l'imaging pre-conversione, nella finestra di acquisizione e nella scheda a discesa delle impostazioni di acquisizione, selezionare i parametri di imaging. Ecco l'impostazione dello stack specifica del laboratorio è chiamata, imaging dei pesci. Posizionare il campione sul microscopio confocale e utilizzare le manopole di regolazione grossolana e fine per portarlo a fuoco.Quindi apri la finestra di messa a fuoco e individua la regione di interesse desiderata, come il ganglio della radice dorsale. Nel menu di impostazione del filtro, selezionare il laser c488, impostare l'esposizione su 300 millisecondi, la potenza del laser su cinque e l'intensificazione su 75. Successivamente, nella sezione del tipo di acquisizione, seleziona la casella 3D.Nella sezione Acquisizione 3D, selezionare Usa posizione corrente e controllare l'intervallo intorno alla corrente. Nella stessa sezione impostare l'intervallo su 35, il numero di piani su 36 e la dimensione del passo su uno. Seleziona la posizione corrente, quindi fai clic su Avvia nella parte inferiore della finestra di acquisizione per acquisire un'immagine.Prima del processo di fotoconversione, assicurati di controllare due e tre volte i parametri del laser. A volte è necessario regolare nuovamente le impostazioni di conversione, quando la finestra di conversione è aperta. Nella finestra di acquisizione, nella scheda a discesa delle impostazioni della finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di conversione specifica del lab.Qui l'impostazione specifica del laboratorio è chiamata, pesce ablare chip completo. Nel menu del filtro impostato, selezionare i laser c488 e c541. Imposta le esposizioni a 300 millisecondi, la potenza del laser a cinque e l'intensificazione a 75, che produrrà un segnale fluorescente sufficiente senza causare fotosbiancamento o tossicità.Nella finestra di messa a fuoco, fare clic sulla scheda di fotomanipolazione e modificare la potenza del laserstack su due, quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco raster in uno e fare clic su imposta. Quindi modificare la dimensione del doppio clic su quattro e la linea laser su v405.Successivamente, nella finestra di acquisizione apri le impostazioni di acquisizione avanzate. Seleziona la scheda di fotomanipolazione e modifica le ripetizioni del doppio clic su due, quindi fai clic su OK. Selezionare la scheda xy nella finestra di messa a fuoco.Nella scheda fotomanipolazione, ricontrolla i parametri del laser. Quindi, imposta le impostazioni del laser per fotoconvertire la cella di interesse, senza fotoconversione delle celle circostanti. In Tipo di acquisizione, seleziona la casella timelapse, quindi fai clic su Avvia.Una volta aperta la finestra del timelapse in tempo reale, seleziona lo strumento cerchio sulla barra degli strumenti in alto. Disegna un cerchio nella regione più centrale della cella, quindi fai clic con il pulsante destro del mouse sul cerchio disegnato, seleziona Regione FRAP e attendi tre secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare più scura, quando fa clic su Interrompi acquisizione.Se si esegue l'imaging di più di un animale, tornare alla scheda xy nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione due. Quindi, ripeti la fotoconversione. Per convertire una popolazione di cellule, seguire il protocollo e i perametri laser aprendo la finestra timelapse.Ora, invece di disegnare un cerchio per FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea sulla regione di interesse. Quindi, FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri appena dimostrati. Una volta fotoconvertiti tutti i punti, nella scheda a discesa delle impostazioni di acquisizione nella finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione dello stack standard specifica del lab descritta in precedenza in questo video.Seleziona il laser c488 e imposta l'esposizione su 300 millisecondi, la potenza del laser su cinque e l'intensificazione su 75. Seleziona il laser c541 e imposta l'esposizione a 500 millisecondi, la potenza del laser a dieci e l'intensificazione a 75. Nella sezione del tipo di acquisizione, seleziona la casella 3D.Nella sezione Acquisizione 3D, selezionare Usa posizione corrente e controllare l'intervallo intorno alla corrente. Nella stessa sezione, impostare l'intervallo su 35, il numero di piani su 36 e la dimensione del passo su uno. Il numero dell'intervallo può aumentare o diminuire, per adattarsi alla profondità di imaging desiderata.Se sono presenti punti multipli nella scheda di messa a fuoco xy, nella finestra di acquisizione, selezionare l'opzione dell'elenco multipunti. In caso contrario, selezionare la posizione corrente. Infine, nella parte inferiore della finestra di acquisizione, fare clic su Avvia per acquisire un'immagine.Questi pannelli mostrano una singola cellula di pre-fotoconversione, all'interno di un ganglio di un pesce zebra transgenico, che esprime la proteina eos fotoconvertibile, sotto il controllo della sequenza regolatoria sox10. Dopo la fotoconversione, eos era distintamente presente all'interno della regione di interesse, mentre nessuna cella vicina era marcata. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica di fotoconversione, una popolazione di cellule nel lato ventrale del midollo spinale è stata esposta alla luce UV, utilizzando una linea.Successivamente, sono state scattate immagini che mostrano la proteina eos fotoconvertita nella regione della linea. La proteina eos non fotoconvertita era visibile in tutte le altre aree. Diverse ore dopo la fotoconversione, sono state scattate immagini identiche che mostravano cellule eos positive fotoconvertite sparse in tutta la regione del midollo spinale, sia in posizione dorsale che ventrale.Questa scoperta è coerente con l'ipotesi che le cellule spinali ventrali si siano trasferite in posizioni dorsali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-45 minuti, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di scattare un'immagine post-conversione, per confermare che la tua regione di interesse ha sperimentato la fotoconversione.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging timelapse per osservare la migrazione cellulare e la dinamica nel tempo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come distinguere le singole cellule all'interno di una popolazione di cellule fluorescenti. Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre le precauzioni necessarie durante l'esecuzione di questa procedura.Ad esempio, non fissare mai direttamente la luce.

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