Name: In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri come misurare la permeabilità intestinale in vitro e in vivo utilizzando Caco-2bbe e topi C57BL/6. Questi metodi aiutano a studiare le malattie gastrointestinali legate alla disfunzione della barriera epiteliale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo il dottor Jerrold R. Turner, da Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, per il suo generoso aiuto nel completare questo studio. Questo lavoro è sostenuto da Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (concessione numero 81470804, 31401229 e 81200620), il Natural Science Foundation di Jiangsu Province (concessione numero BK20180838 e BK20140319), programma di ricerca dell'innovazione per Collegio laureati della provincia di Jiangsu (concessione numero KYLX16-0116), Advanced Research Progetti di Soochow University (concessione numero SDY2015_06) e di Crohn & colite Foundation Research Fellowship Award (grant numero 310801).

Questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e uso protocollo di Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow University.
1. placcatura e la manutenzione di Caco-2bbe sulle membrane porose in policarbonato
<ol><li>Crescere le cellule in una boccetta di T75 con media (DMEM contenente 10% FBS). Boccette dovrebbero essere alimentati regolarmente, a seconda della densità delle cellule. Nota: Per la placcatura ottima, cellule dovrebbero dividersi rapidamente e hanno una forma piatta "fritto-uovo", che indica che le cellule sono in fase di crescita.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono 80% confluenti, prendere il pallone fuori l'incubatrice e rimuovere il supporto. Sciacquare ogni residua media con 1-2 mL di PBS sterile (senza Ca2 +). Pipettare 1,5 mL di tripsina-EDTA nel pallone e delicatamente roccia il pallone; quindi, posizionare il pallone nell'incubatore 37 ° C per 20 min senza a dondolo.</li>
	<li>Mentre le cellule sono trypsinizing, posto inserisce contenente membrane porose in policarbonato (diametro dei pori, 0,4 µm; superficie, 0,33 cm2; Vedi Tabella materiali) in piastre da 24 pozzetti. Aggiungere 1,0 mL di terreno di coltura in aula basale (lo spazio inferiore della membrana).</li>
	<li>Pipettare 5 mL di media nella boccetta e vigorosamente dispensare le cellule contro il lato del pallone di 5 - 10 volte per raggiungere sciolte, singole celle o cella di 2-3 ciuffi.</li>
	<li>
Piastra di 0,166 mL di cellule (raggiungimento di un rapporto di diluizione di 1:8) nella camera di apicale (lo spazio superiore della membrana). Incubare a 37 ° C fino a 3 settimane.
	<ol>
<li>Alimentazione celle tre volte settimanalmente aspirando attentamente i media dal basale vano di ogni pozzetto usando una pompa a pressione. Delicatamente gocciolare 1ml di media nella camera apicale di ciascun frutto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. uso del Meter epiteliale (Volt/Ohm) per la misurazione TER
Nota: Dopo circa 3 settimane di cultura sulle membrane in policarbonato, cellule Caco-2BBe sono pronte per la misurazione di TER.
<ol><li>Per gli studi di citochina, un giorno prima della misura, sostituire il supporto basale con supporti contenenti 10 ng/mL di IFNγ. Il giorno dell'esperimento, è necessario sostituire il supporto con HBSS contenente 2,5 o 7,5 ng/mL di TNF. Nota: Trattamento IFNγ aumenta l'espressione del recettore TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Per correggere il misuratore, inserire l'elettrodo di correzione nella porta di ingresso e scegliere la modalità "Ohm". Regolare la vite R Adj con un cacciavite fino a quando il misuratore visualizza una lettura di 1.000 Ω.</li>
	<li>Sterilizzare gli elettrodi ponendoli in etanolo al 70% per 15-30 min e poi lasciare li asciugare all'aria per 15 s. Risciacquare l'elettrodo nel mezzo di coltura cellulare sperimentale.</li>
	<li>Accendere l'unità e scegliere la modalità di "Ohm". Posizionare l'estremità lunga dei ponti elettrodo nella camera basale ed il breve finisce nella camera di apicale. Assicurarsi che gli elettrodi più tocchino il fondo del piatto, mantenendo gli elettrodi più brevi sotto la superficie della media, ma soprattutto gli inserti di coltura del tessuto. Mantenere gli elettrodi verticali.</li>
	<li>Misurare la resistenza del campione inserti e inserti in bianco (cioè, la cultura inserisce senza cellule ma con HBSS) a 0, 1, 2, 3, 4 h dopo il trattamento di citochina. Registrare la resistenza.</li>
	<li>Per garantire la coerenza tra piastra diversi formati, è possibile calcolare il prodotto della resistenza e l'area della membrana efficace: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Per inserti 24 pozzetti, l'area della membrana efficace è 0,33 cm2.</li>
</ol>3. modello murino di sodio del solfato del dextrano (DSS)-colite indotta
<ol><li>Aggiungere DSS in autoclave acqua ad una concentrazione finale pari al 3,5% (wt/vol).</li>
	<li>Amministrare il 3,5% DSS ai topi C57BL/6 maschi di 8-settimana-vecchio per un totale di 7 giorni. Dare acqua potabile normale senza DSS ai topi di controllo.<ol>
<li>Passare il DSS-contenenti acqua per acqua potabile normale dopo 7 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Topi di pesare e valutare punteggi clinici di ogni mouse ogni giorno. Normalizzare il peso corporeo di ogni topo al suo peso corporeo iniziale. Punteggi sono definiti secondo la severità di malattia da quattro parametri: prolasso rettale (0-2), la consistenza delle feci (0-2), sanguinamento (0-2) e attività (0-2)5. Sommare i punteggi da questi parametri per un punteggio clinico finale.</li>
	<li>Per analizzare la condizione istopatologica del tessuto del colon, eutanasia topi tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) con trattamento di 1,2% (vol/vol) Avertin (peso corporeo di 0,6 mL/10 g) 7 giorni post-DSS. Per preparare un brodo di 100% avertin, mescolare 10 g di 2,2,2-tribromoethanol con 10 ml di alcool tert-Amilico.  Conservare al buio a 4° C. Per utilizzare, diluire cartoncino 100% al 2% in acqua.</li>
	<li>Isolare il colon e intestino cieco e misurare la lunghezza dei due punti5.</li>
	<li>Tagliare segmenti di 0,5 cm dal colon distale e correzione in un tubo falcon da 15 mL contenente 10 mL di formalina al 10% durante la notte. Lavare i tessuti fissi con etanolo graduato (75, 95 e 100%) e xilene. Incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni da 6 mm per l'ematossilina ed eosina8.</li>
</ol>4. misurare la permeabilità della barriera epiteliale nei topi di colite DSS indotta
<ol><li>Misurare la permeabilità della barriera 7 giorni dopo l'inizio della somministrazione di DSS.</li>
	<li>Il giorno del test, veloce topi per 3 h.</li>
	<li>Autoclave una sonda gastrica dell'ago per garantire la sterilità, quindi i topi di sonda gastrica con 150 µ l 80 mg/mL 4 kDa FITC-Destrano in acqua sterile e mantenere il FITC-Destrano inutilizzato per misurare la curva standard dopo la raccolta del siero. Pesare i topi per il calcolo di permeabilità. Nota: La soluzione di FITC-Destrano dovrebbe essere fatto in acqua.</li>
	<li>Utilizzando un paio di forbici, un pezzo di 1 cm della coda di clip e raccogliere 100 µ l di sangue dalla coda nelle provette di raccolta del siero. Girare il sangue prelevato a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire il siero 1:4 in acqua. Per rendere standard curva, diluire inutilizzato FITC-Destrano con acqua a 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 e 1:3, 000, 000. Aggiungere 100 µ l/pozzetto del siero e dei campioni di curva standard in piastre da 96 pozzetti.</li>
	<li>Leggere la fluorescenza in un lettore di piastra con 485 eccitazione/528 emissione. Calcolare i valori di permeabilità basati sulla curva standard e moltiplicare per 4 per correggere per la diluizione.</li>
	<li>Dividere la concentrazione di FITC-Destrano per il peso per normalizzare i valori (questo aiuta a normalizzare la differenza nella consegna di FITC-Destrano se topi sono malati e hanno perso peso).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le cellule Caco-2BBe (confine-esprimendo la spazzola) vengono sempre utilizzate per la misurazione di TER, selezionato dalla linea delle cellule Caco-2 per l'espressione delle proteine del spazzola-confine. Le cellule Caco-2BBe hanno un fenotipo assorbente del villo quando completamente differenziato (dopo circa 3 settimane di post-confluenza cultura)17. È necessario per evitare la contaminazione durante la misurazione e per sterilizzare l'elettrodo...

Cellule epiteliali intestinali non sono solo responsabili per l'assorbimento dei nutrienti, ma anche formano una barriera importante per difendere contro microrganismi patogeni e tossine microbiche. Questa funzione di barriera intestinale è regolata da permeabilità stretta della giunzione e delle cellule epiteliali integrità1,2,3, e disfunzione della funzione di barriera epiteliale è associata con infiammatorie intestinali malattia (IBD). L'anello di actomiosina perijunctional (PAMR) si trova all'interno della cellula che è strettamente contigua per giunzioni strette. La contrazione di PAMR, che è regolata dalla catena leggera della miosina (MLC), è cruciale per la regolazione della stretta della giunzione permeabilità4,5,6,7,8, 9,10. Fattore di necrosi tumorale (TNF) è centrale alla perdita della barriera intestinale espressione di chinasi (MLCK) upregulating epiteliale intestinale MLC e inducendo occludina interiorizzazione11,12,13.
Ioni come Na+ e Cl– può attraversare lo spazio paracellulare di poro o perdita via14. In un epitelio "colante", cambiamenti in TER riflettono principalmente permeabilità alterata stretta della giunzione. Misurazione di TER è un approccio elettrofisiologico comunemente utilizzato per quantificare la permeabilità stretta della giunzione, principalmente a Na+ e Cl-, basato sull'impedenza di monostrati di cellule umane. Tipi di cellule diverse, tra cui le cellule epiteliali intestinali, cellule epiteliali polmonari e le cellule endoteliali vascolari, sono stati segnalati per misurazioni di TER. Vantaggi di questo metodo sono che le misurazioni TER sono non-invasivo e possono essere utilizzate per monitorare le cellule vive in tempo reale. Inoltre, la tecnica di misurazione TER è utile per droga tossicità studi15.
Caco-2BBe cellule sono cellule epiteliali umane dell'adenocarcinoma del colon-retto con una struttura e funzione simili a piccole cellule epiteliali intestinali differenziate: ad esempio, queste cellule hanno microvilli ed enzimi connessi con la piccola spazzola intestinale confine. Di conseguenza, coltivate Caco-2BBe monostrati sono utilizzati come un modello in vitro per verificare la funzione della barriera.
Nei topi, un modo per studiare la permeabilità intestinale paracellulare è misurando la capacità di FITC-dextrano di attraversare dal lume nel sangue. Così, la permeabilità intestinale può essere valutata da gavaging FITC-Destrano direttamente in topi e misurare la fluorescenza all'interno del sangue. Il seguente protocollo descrive due semplici metodi per valutare la permeabilità dell'epitelio intestinale sia in vitro che in vivo.

<table><tbody><tr><td>22 G gavage ago</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-destrano</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Piastre nere a 96 pozzetti per fluorescenza</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 topi</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute dell'Università</td><td></td><td></td>di Nanchino</tr><tr><td>Cellule Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>destrano solfato di sodio</td><td>MP Biomedicals 2160110</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMED con alto contenuto di glucosio e piruvato di sodio</td> Misuratore epiteliale (volt/ohm) <td>di iclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm ChemicalReagente</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>provetta Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM di glucosio</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centro modulare per l'inclusione dei tessuti</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del siero</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 pallone</td><td>per corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membrane in policarbonato (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a pressione</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomia rotativa</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sinopharm ChimicoReagente</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

La barriera intestinale difende contro i microrganismi patogeni e tossine microbiche. La sua funzione è regolata dalla stretta della giunzione permeabilità e l'integrità delle cellule epiteliali, e rottura della funzione di barriera intestinale contribuisce alla progressione di malattia gastrointestinale e sistematica. Due semplici metodi descritti qui per misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale. In vitro, le cellule Caco-2BBe sono placcate in pozzi di coltura del tessuto come uno strato monomolecolare e resistenza elettrica transepiteliale (TER) può essere misurato con un misuratore di epiteliale (volt/ohm). Questo metodo è convincente per la sua facilità di utilizzo e ripetibilità. In vivo, i topi sono gavaged con 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano e le concentrazioni di FITC-Destrano sono misurati in campioni di siero raccolti da topi per determinare la permeabilità epiteliale. Alimentazione mediante sonda gastrica orale offre una dose precisa e pertanto è il metodo preferito per misurare la permeabilità intestinale in vivo. Presi insieme, questi due metodi in grado di misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale in vitro e in vivoe quindi essere usati per studiare la connessione tra malattie e funzione di barriera.

In coltura, cellule Caco-2BBe crescono come uno strato monomolecolare e lentamente differenziano in enterociti assorbenti maturi che hanno bordi del pennello. In questo protocollo, le cellule Caco-2BBe sono state placcate con un'alta densità su membrane in policarbonato e celle raggiunto 100% confluency un giorno dopo la semina. Tuttavia, le cellule sono indifferenziate in questa fase: completamente differenziare le cellule, il media è cambiato ogni 2-3 giorni per 3 settimane. Le cellule ...

Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le malattie causate dalla disfunzione della barriera epiteliale misurando la permeabilità delle cellule epiteliali intestinali in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della funzione barriera intestinale, come quelle relative alla malattia infiammatoria intestinale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la permeabilità cellulare epiteliale intestinale può essere valutata sia in vitro che in vivo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia o la diagnosi di malattie gastrointestinali, perché la disfunzione della barriera epiteliale intestinale contribuisce a tali malattie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione di barriera intestinale, può anche essere applicato ad altri sistemi, come studi sulla tossicità dei farmaci e integrità della barriera di altri tipi di cellule. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché alcuni passaggi sono difficili da apprendere.Un'operazione accurata di questo metodo può ora essere compresa mediante descrizione testuale. Per iniziare, far crescere le cellule caco-2bbe in un pallone T

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive l'uso di preparati di tessuto intestinale asportati o "sacche intestinali" come modello ex vivo della funzione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'integrità sia della barriera epiteliale che dello strato di gel mucoso in specifici siti intestinali in modelli animali di malattia digestiva.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

Gli attuali trattamenti di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) hanno lo scopo di alleviare i sintomi della malattia, ma possono causare gravi effetti collaterali. Così, strategie alternative sono allo studio in modelli animali colite. Qui, viene spiegato come gli effetti benefici della dieta completa sui segni clinici IBD sono analizzati in un tale modello di colite.

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

L'accesso di nutrienti, microbiota metaboliti e farmaci per la circolazione è controllata dalla barriera intestinale-sangue (GBB). Descriviamo un metodo diretto per misurare la GBB permeabilità in vivo, che, contrariamente ai metodi indiretti comunemente usati, praticamente non è interessato dalle funzioni di fegato e rene.

Un metodo In Vivo per valutare la Gut-barriera e metabolismo epatico del Microbiota prodotti

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.

Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.

Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.

Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

Scopri come misurare la permeabilità intestinale in vitro e in vivo utilizzando Caco-2bbe e topi C57BL/6. Questi metodi aiutano a studiare le malattie gastrointestinali legate alla disfunzione della barriera epiteliale.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

Esplora altri video