Name: In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri come misurare la permeabilità intestinale in vitro e in vivo utilizzando Caco-2bbe e topi C57BL/6. Questi metodi aiutano a studiare le malattie gastrointestinali legate alla disfunzione della barriera epiteliale.

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Ringraziamo il dottor Jerrold R. Turner, da Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, per il suo generoso aiuto nel completare questo studio. Questo lavoro è sostenuto da Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (concessione numero 81470804, 31401229 e 81200620), il Natural Science Foundation di Jiangsu Province (concessione numero BK20180838 e BK20140319), programma di ricerca dell'innovazione per Collegio laureati della provincia di Jiangsu (concessione numero KYLX16-0116), Advanced Research Progetti di Soochow University (concessione numero SDY2015_06) e di Crohn & colite Foundation Research Fellowship Award (grant numero 310801).

Questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e uso protocollo di Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow University.
1. placcatura e la manutenzione di Caco-2bbe sulle membrane porose in policarbonato
<ol><li>Crescere le cellule in una boccetta di T75 con media (DMEM contenente 10% FBS). Boccette dovrebbero essere alimentati regolarmente, a seconda della densità delle cellule. Nota: Per la placcatura ottima, cellule dovrebbero dividersi rapidamente e hanno una forma piatta "fritto-uovo", che indica che le cellule sono in fase di crescita.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono 80% confluenti, prendere il pallone fuori l'incubatrice e rimuovere il supporto. Sciacquare ogni residua media con 1-2 mL di PBS sterile (senza Ca2 +). Pipettare 1,5 mL di tripsina-EDTA nel pallone e delicatamente roccia il pallone; quindi, posizionare il pallone nell'incubatore 37 ° C per 20 min senza a dondolo.</li>
	<li>Mentre le cellule sono trypsinizing, posto inserisce contenente membrane porose in policarbonato (diametro dei pori, 0,4 µm; superficie, 0,33 cm2; Vedi Tabella materiali) in piastre da 24 pozzetti. Aggiungere 1,0 mL di terreno di coltura in aula basale (lo spazio inferiore della membrana).</li>
	<li>Pipettare 5 mL di media nella boccetta e vigorosamente dispensare le cellule contro il lato del pallone di 5 - 10 volte per raggiungere sciolte, singole celle o cella di 2-3 ciuffi.</li>
	<li>
Piastra di 0,166 mL di cellule (raggiungimento di un rapporto di diluizione di 1:8) nella camera di apicale (lo spazio superiore della membrana). Incubare a 37 ° C fino a 3 settimane.
	<ol>
<li>Alimentazione celle tre volte settimanalmente aspirando attentamente i media dal basale vano di ogni pozzetto usando una pompa a pressione. Delicatamente gocciolare 1ml di media nella camera apicale di ciascun frutto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. uso del Meter epiteliale (Volt/Ohm) per la misurazione TER
Nota: Dopo circa 3 settimane di cultura sulle membrane in policarbonato, cellule Caco-2BBe sono pronte per la misurazione di TER.
<ol><li>Per gli studi di citochina, un giorno prima della misura, sostituire il supporto basale con supporti contenenti 10 ng/mL di IFNγ. Il giorno dell'esperimento, è necessario sostituire il supporto con HBSS contenente 2,5 o 7,5 ng/mL di TNF. Nota: Trattamento IFNγ aumenta l'espressione del recettore TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Per correggere il misuratore, inserire l'elettrodo di correzione nella porta di ingresso e scegliere la modalità "Ohm". Regolare la vite R Adj con un cacciavite fino a quando il misuratore visualizza una lettura di 1.000 Ω.</li>
	<li>Sterilizzare gli elettrodi ponendoli in etanolo al 70% per 15-30 min e poi lasciare li asciugare all'aria per 15 s. Risciacquare l'elettrodo nel mezzo di coltura cellulare sperimentale.</li>
	<li>Accendere l'unità e scegliere la modalità di "Ohm". Posizionare l'estremità lunga dei ponti elettrodo nella camera basale ed il breve finisce nella camera di apicale. Assicurarsi che gli elettrodi più tocchino il fondo del piatto, mantenendo gli elettrodi più brevi sotto la superficie della media, ma soprattutto gli inserti di coltura del tessuto. Mantenere gli elettrodi verticali.</li>
	<li>Misurare la resistenza del campione inserti e inserti in bianco (cioè, la cultura inserisce senza cellule ma con HBSS) a 0, 1, 2, 3, 4 h dopo il trattamento di citochina. Registrare la resistenza.</li>
	<li>Per garantire la coerenza tra piastra diversi formati, è possibile calcolare il prodotto della resistenza e l'area della membrana efficace: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Per inserti 24 pozzetti, l'area della membrana efficace è 0,33 cm2.</li>
</ol>3. modello murino di sodio del solfato del dextrano (DSS)-colite indotta
<ol><li>Aggiungere DSS in autoclave acqua ad una concentrazione finale pari al 3,5% (wt/vol).</li>
	<li>Amministrare il 3,5% DSS ai topi C57BL/6 maschi di 8-settimana-vecchio per un totale di 7 giorni. Dare acqua potabile normale senza DSS ai topi di controllo.<ol>
<li>Passare il DSS-contenenti acqua per acqua potabile normale dopo 7 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Topi di pesare e valutare punteggi clinici di ogni mouse ogni giorno. Normalizzare il peso corporeo di ogni topo al suo peso corporeo iniziale. Punteggi sono definiti secondo la severità di malattia da quattro parametri: prolasso rettale (0-2), la consistenza delle feci (0-2), sanguinamento (0-2) e attività (0-2)5. Sommare i punteggi da questi parametri per un punteggio clinico finale.</li>
	<li>Per analizzare la condizione istopatologica del tessuto del colon, eutanasia topi tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) con trattamento di 1,2% (vol/vol) Avertin (peso corporeo di 0,6 mL/10 g) 7 giorni post-DSS. Per preparare un brodo di 100% avertin, mescolare 10 g di 2,2,2-tribromoethanol con 10 ml di alcool tert-Amilico.  Conservare al buio a 4° C. Per utilizzare, diluire cartoncino 100% al 2% in acqua.</li>
	<li>Isolare il colon e intestino cieco e misurare la lunghezza dei due punti5.</li>
	<li>Tagliare segmenti di 0,5 cm dal colon distale e correzione in un tubo falcon da 15 mL contenente 10 mL di formalina al 10% durante la notte. Lavare i tessuti fissi con etanolo graduato (75, 95 e 100%) e xilene. Incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni da 6 mm per l'ematossilina ed eosina8.</li>
</ol>4. misurare la permeabilità della barriera epiteliale nei topi di colite DSS indotta
<ol><li>Misurare la permeabilità della barriera 7 giorni dopo l'inizio della somministrazione di DSS.</li>
	<li>Il giorno del test, veloce topi per 3 h.</li>
	<li>Autoclave una sonda gastrica dell'ago per garantire la sterilità, quindi i topi di sonda gastrica con 150 µ l 80 mg/mL 4 kDa FITC-Destrano in acqua sterile e mantenere il FITC-Destrano inutilizzato per misurare la curva standard dopo la raccolta del siero. Pesare i topi per il calcolo di permeabilità. Nota: La soluzione di FITC-Destrano dovrebbe essere fatto in acqua.</li>
	<li>Utilizzando un paio di forbici, un pezzo di 1 cm della coda di clip e raccogliere 100 µ l di sangue dalla coda nelle provette di raccolta del siero. Girare il sangue prelevato a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire il siero 1:4 in acqua. Per rendere standard curva, diluire inutilizzato FITC-Destrano con acqua a 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 e 1:3, 000, 000. Aggiungere 100 µ l/pozzetto del siero e dei campioni di curva standard in piastre da 96 pozzetti.</li>
	<li>Leggere la fluorescenza in un lettore di piastra con 485 eccitazione/528 emissione. Calcolare i valori di permeabilità basati sulla curva standard e moltiplicare per 4 per correggere per la diluizione.</li>
	<li>Dividere la concentrazione di FITC-Destrano per il peso per normalizzare i valori (questo aiuta a normalizzare la differenza nella consegna di FITC-Destrano se topi sono malati e hanno perso peso).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le cellule Caco-2BBe (confine-esprimendo la spazzola) vengono sempre utilizzate per la misurazione di TER, selezionato dalla linea delle cellule Caco-2 per l'espressione delle proteine del spazzola-confine. Le cellule Caco-2BBe hanno un fenotipo assorbente del villo quando completamente differenziato (dopo circa 3 settimane di post-confluenza cultura)17. È necessario per evitare la contaminazione durante la misurazione e per sterilizzare l'elettrodo...

Cellule epiteliali intestinali non sono solo responsabili per l'assorbimento dei nutrienti, ma anche formano una barriera importante per difendere contro microrganismi patogeni e tossine microbiche. Questa funzione di barriera intestinale è regolata da permeabilità stretta della giunzione e delle cellule epiteliali integrità1,2,3, e disfunzione della funzione di barriera epiteliale è associata con infiammatorie intestinali malattia (IBD). L'anello di actomiosina perijunctional (PAMR) si trova all'interno della cellula che è strettamente contigua per giunzioni strette. La contrazione di PAMR, che è regolata dalla catena leggera della miosina (MLC), è cruciale per la regolazione della stretta della giunzione permeabilità4,5,6,7,8, 9,10. Fattore di necrosi tumorale (TNF) è centrale alla perdita della barriera intestinale espressione di chinasi (MLCK) upregulating epiteliale intestinale MLC e inducendo occludina interiorizzazione11,12,13.
Ioni come Na+ e Cl– può attraversare lo spazio paracellulare di poro o perdita via14. In un epitelio "colante", cambiamenti in TER riflettono principalmente permeabilità alterata stretta della giunzione. Misurazione di TER è un approccio elettrofisiologico comunemente utilizzato per quantificare la permeabilità stretta della giunzione, principalmente a Na+ e Cl-, basato sull'impedenza di monostrati di cellule umane. Tipi di cellule diverse, tra cui le cellule epiteliali intestinali, cellule epiteliali polmonari e le cellule endoteliali vascolari, sono stati segnalati per misurazioni di TER. Vantaggi di questo metodo sono che le misurazioni TER sono non-invasivo e possono essere utilizzate per monitorare le cellule vive in tempo reale. Inoltre, la tecnica di misurazione TER è utile per droga tossicità studi15.
Caco-2BBe cellule sono cellule epiteliali umane dell'adenocarcinoma del colon-retto con una struttura e funzione simili a piccole cellule epiteliali intestinali differenziate: ad esempio, queste cellule hanno microvilli ed enzimi connessi con la piccola spazzola intestinale confine. Di conseguenza, coltivate Caco-2BBe monostrati sono utilizzati come un modello in vitro per verificare la funzione della barriera.
Nei topi, un modo per studiare la permeabilità intestinale paracellulare è misurando la capacità di FITC-dextrano di attraversare dal lume nel sangue. Così, la permeabilità intestinale può essere valutata da gavaging FITC-Destrano direttamente in topi e misurare la fluorescenza all'interno del sangue. Il seguente protocollo descrive due semplici metodi per valutare la permeabilità dell'epitelio intestinale sia in vitro che in vivo.

<table><tbody><tr><td>22 G gavage ago</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-destrano</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Piastre nere a 96 pozzetti per fluorescenza</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 topi</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute dell'Università</td><td></td><td></td>di Nanchino</tr><tr><td>Cellule Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>destrano solfato di sodio</td><td>MP Biomedicals 2160110</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMED con alto contenuto di glucosio e piruvato di sodio</td> Misuratore epiteliale (volt/ohm) <td>di iclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm ChemicalReagente</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>provetta Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM di glucosio</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centro modulare per l'inclusione dei tessuti</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del siero</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 pallone</td><td>per corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membrane in policarbonato (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a pressione</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomia rotativa</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sinopharm ChimicoReagente</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

La barriera intestinale difende contro i microrganismi patogeni e tossine microbiche. La sua funzione è regolata dalla stretta della giunzione permeabilità e l'integrità delle cellule epiteliali, e rottura della funzione di barriera intestinale contribuisce alla progressione di malattia gastrointestinale e sistematica. Due semplici metodi descritti qui per misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale. In vitro, le cellule Caco-2BBe sono placcate in pozzi di coltura del tessuto come uno strato monomolecolare e resistenza elettrica transepiteliale (TER) può essere misurato con un misuratore di epiteliale (volt/ohm). Questo metodo è convincente per la sua facilità di utilizzo e ripetibilità. In vivo, i topi sono gavaged con 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano e le concentrazioni di FITC-Destrano sono misurati in campioni di siero raccolti da topi per determinare la permeabilità epiteliale. Alimentazione mediante sonda gastrica orale offre una dose precisa e pertanto è il metodo preferito per misurare la permeabilità intestinale in vivo. Presi insieme, questi due metodi in grado di misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale in vitro e in vivoe quindi essere usati per studiare la connessione tra malattie e funzione di barriera.

In coltura, cellule Caco-2BBe crescono come uno strato monomolecolare e lentamente differenziano in enterociti assorbenti maturi che hanno bordi del pennello. In questo protocollo, le cellule Caco-2BBe sono state placcate con un'alta densità su membrane in policarbonato e celle raggiunto 100% confluency un giorno dopo la semina. Tuttavia, le cellule sono indifferenziate in questa fase: completamente differenziare le cellule, il media è cambiato ogni 2-3 giorni per 3 settimane. Le cellule ...

Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le malattie causate dalla disfunzione della barriera epiteliale misurando la permeabilità delle cellule epiteliali intestinali in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della funzione barriera intestinale, come quelle relative alla malattia infiammatoria intestinale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la permeabilità cellulare epiteliale intestinale può essere valutata sia in vitro che in vivo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia o la diagnosi di malattie gastrointestinali, perché la disfunzione della barriera epiteliale intestinale contribuisce a tali malattie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione di barriera intestinale, può anche essere applicato ad altri sistemi, come studi sulla tossicità dei farmaci e integrità della barriera di altri tipi di cellule. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché alcuni passaggi sono difficili da apprendere.Un'operazione accurata di questo metodo può ora essere compresa mediante descrizione testuale. Per iniziare, far crescere le cellule caco-2bbe in un pallone T75 con mezzo. Nutrire regolarmente i contenitori, a seconda della densità cellulare.Quando le cellule sono confluenti all'80%, rimuovere il mezzo e utilizzare 1-2 millilitri di PBS sterile senza calcio per risciacquarli. Aggiungere 1,5 millilitri di Triptina-EDTA e scuotere delicatamente il pallone. Quindi, posizionalo nell'incubatore di 37 gradi Celsius per 20 minuti, senza dondolare.Mentre le cellule sono tripinalizzanti, posizionare inserti contenenti membrane porose in policarbonato in 24 piastre di pozzo. Quindi aggiungere 1 millilitro di mezzo di coltura nella camera basale che è lo spazio inferiore della membrana. Aggiungere 5 millilitri di mezzo al pallone e pipettare vigorosamente le cellule contro l'interno del pallone da 5 a 10 volte, per separare la coltura in singole cellule sciolte o grumi da due a tre cellule.Piastra 0,166 millilitri delle cellule nella camera apicale che è lo spazio superiore della membrana. Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un massimo di tre settimane. Nutrire le cellule tre volte alla settimana, utilizzando una pompa di pressione per aspirare con cura il mezzo dal compartimento basale di ogni pozzo.Quindi gocciolare delicatamente un millilitro di mezzo nella camera apicica di ogni inserto. Per gli studi sulle citochine, un giorno prima della resistenza elettrica transepiteliale o delle misurazioni ter, sostituire il mezzo basale con mezzo, contenente 10 nanogrammi per millilitro di gamma di interferone. Il giorno dell'esperimento, sostituire il mezzo con HBSS contenente 2,5 o 7,5 nanogrammi per millilitro di TNF.Per correggere il misuratore, inserire l'elettrodo di correzione nella porta di ingresso e scegliere la modalità Ohm. Quindi utilizzare un cacciavite per regolare la vite di regolazione R fino a quando il misuratore non visualizza una lettura di 1.000 ohm. Sterilizzare gli elettrodi in 70%etanolo per 15-30 minuti e lasciare asciugare l'aria per 15 secondi.Quindi sciacquare gli elettrodi nel mezzo sperimentale di coltura cellulare. Quindi, accendi l'alimentazione e scegli la modalità Ohm. Mantenendo gli elettrodi verticali, posizionare con cura le lunghe estremità dei ponti degli elettrodi nella camera basale, assicurandosi che tocchino il piatto.Quindi posizionare le estremità corte nella camera apicale, assicurando che rimangano sotto la superficie del mezzo, ma sopra gli inserti di coltura tissutale. Misurare la resistenza del campione e degli inserti vuoti a 0, 1, 2, 3 e 4 ore dopo il trattamento con citochina. Quindi registra la resistenza.Per ottenere coerenza tra i diversi formati di piastra, calcolare il prodotto della resistenza e l'area effettiva della membrana come mostrato qui. Per 24 inserti di pozzo, l'area effettiva della membrana è di 0,33 centimetri quadrati. Per indurre la colite, aggiungere DSS all'acqua autoclavata a una concentrazione finale del 3,5% di peso per volume.Quindi utilizzare la soluzione DSS per sostituire l'acqua potabile nelle gabbie di sei topi neri C57 maschi di 8 settimane per un totale di sette giorni. Dare acqua potabile regolare senza DSS per controllare i topi. Dopo il settimo giorno, passare l'acqua DSS all'acqua potabile normale.Ogni giorno, pesare i topi e valutare i punteggi clinici definiti in base alla gravità della malattia da quattro parametri: prolassi rettale, consistenza delle feci, sanguinamento e attività. Sommare i punteggi di questi parametri per un punteggio clinico finale. Analizzare le condizioni istopatologiche dei tessuti del colon sette giorni dopo il trattamento DSS, dopo aver eutanasiato i topi secondo il protocollo di testo, isolare il colon e il cieco e misurare la lunghezza del colon.Tagliare segmenti di 0,5 centimetri dal colon distale e fissare il tessuto in un tubo di falco da 15 millilitri contenente 10 millilitri di formalina al 10% durante la notte. Lavare i tessuti fissi con etanolo graduato e xilene. Quindi incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni di sei millimetri per la colorazione ematossilina ed eosina.Per misurare la permeabilità della barriera epiteliale nei topi indotti dal DSS, sette giorni dopo l'inizio della somministrazione del DSS, velocizza i topi per tre ore. Autoclave un ago di gavage per garantire la sterilità, quindi utilizzare 150 microlitri da 80 milligrammi per millilitro quattro kilodalton FITC dextran in acqua sterile per gavage i topi e mantenere il dextran FITC inutilizzato per misurare la curva standard dopo la raccolta del siero. Successivamente, pesare i topi per il calcolo della permeabilità.Quattro ore dopo, dopo aver anestetizzato i topi per iniezione IP, confermare una corretta anestesia per la mancanza di riflessi e movimento del baffo. Quindi posizionare i topi su un blocco di calore per cinque minuti. Usando un paio di forbici, aggancia un pezzo di un centimetro della coda e raccogli 100 microlitri di sangue dalla coda in un tubo di raccolta del siero.Far girare il sangue raccolto a 10.000 volte g e la temperatura ambiente per dieci minuti. Con l'acqua, diluire il siero uno a quattro. Quindi, per fare una curva standard, utilizzare l'acqua per preparare le diluizioni del dextran FITC inutilizzato.Aggiungere 100 microlitri per pozzo del siero e i campioni di curva standard in 96 piastre di pozzo. Utilizzando un lettore di lastre, leggere la fluorescenza ad un'eccitazione di 485 e un'emissione di 528. Calcolare i valori di permeabilità in base alla curva standard e moltiplicarli per quattro per correggere la diluizione.Dividere la concentrazione di Dextran FITC per il peso per normalizzare i valori. Questo aiuta a normalizzare la differenza nel parto di Dextran FITC se i topi sono malati e hanno perso peso. Le cellule caco-2bbe qui mostrate sono state etichettate con nuclei e macchie di F-actin per mostrare la differenza tra cellule indifferenziate e differenziate.Le fibre di stress sono chiaramente viste nelle cellule indifferenziate. Le cellule differenziate hanno un volume inferiore, nuclei più grandi e meno fibre di stress rispetto alle cellule indifferenziate. Il TNF è fondamentale per la perdita di barriera intestinale attraverso la regolazione della giunzione stretta dipendente dalla MLCK.Come si vede in questa figura, il TNF diminuisce significativamente il TER del monostrato Caco-2bbe in modo dose-dipendente, suggerendo che il TNF aumenta la permeabilità epiteliale. Rispetto al loro peso corporeo iniziale, i topi trattati con DSS perdono una quantità significativa di peso. La gravità della colite è segnata da prolassi rettale, consistenza delle feci, sanguinamento e attività.Sezioni trasversali di tessuti colonici macchiati di ematossilina ed eosina mostrano danni alla mucosa colon nei topi trattati con DSS. Inoltre, la lunghezza della cripta del colon, così come il colon stesso, è diminuita nei topi trattati con DSS. Infine, c'è un aumento di circa due volte dei livelli di colorazione di dextran FITC nei topi trattati con DSS, rispetto ai topi di controllo.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo gli errori, standardizzando le procedure operative e utilizzando metodi statistici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della funzione barriera intestinale per esplorare le malattie gastrointestinali sia negli organismi modello che nelle linee cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la permeabilità epiteliale intestinale misurando il TER, gavaging FITC dextran e osservando i cambiamenti morfologici e istochimici.

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