Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di modificare geneticamente le cellule mieloidi murine 32D-G-CSF-R sovraesprimendo o silenziando il gene di interesse e determinando l'effetto di questi cambiamenti sulla proliferazione e sul differenziamento neutrofilo della linea cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ematologia, come ad esempio il modo in cui la proteina di interesse può essere coinvolta nella crescita e nella differenziazione delle cellule precursori mieloidi. Il vantaggio principale di questa linea cellulare è che possiede una capacità di proliferazione illimitata, è suscettibile a manipolazioni genetiche, il costo è relativamente basso e consente un grado di semplificazione biologica richiesto in alcuni approcci sperimentali.

A dimostrare la procedura oggi sarà Petr Danek, uno studente di dottorato nel mio laboratorio. Preparare 250 millilitri di RPMI-1640 Medium integrati con siero fetale bovino al 10% inattivato termicamente e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Quindi preparare 50 millilitri di terreno di differenziazione.

In una capsula di Petri da 16 centimetri, seminare una singola cellula in sospensione di cellule Bosc23 in 18 millilitri di terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino. Coltura per circa 24 ore fino a quando la confluenza raggiunge l'80%Quindi combinare il costrutto retrovirale MSCV, il vettore di imballaggio dell'eco PCL, la polietilenimmina e ridurre il terreno sierico senza antibiotici. Incubare questa miscela in un Flowbox a temperatura ambiente per 20 minuti.

Quindi sostituire con cura il terreno di coltura cellulare Bosc23 con 16 millilitri di terreno DMEM preriscaldato integrato con siero bovino fetale al 2% mantenuto a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere la miscela retrovirale goccia a goccia sulle cellule Bosc23. Quindi incubare la coltura a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Una volta terminata l'incubazione, aspirare il terreno di coltura Bosc23 e aggiungere 18 millilitri di terreno DMEM preriscaldato con il 10% di siero fetale bovino. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per aspirare il terreno contenente il virus Bosc23 in una provetta conica da 50 millilitri.

Conservare il tubo a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere 18 millilitri di terreno DMEM preriscaldato con il 10% di siero fetale bovino alle cellule Bosc23 e coltivare le cellule per 24 ore. Centrifugare il surnatante virale a 1.500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi aliquotare il virus e congelarlo con azoto liquido per conservarlo a meno 80 gradi Celsius. In ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, seminare cellule NIH/3T3 in tre millilitri di terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino per titolare un virus. Coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno seguente, diluire il virus con un terreno preriscaldato senza agitare le particelle virali. Aspirare il terreno di coltura dalle cellule NIH/3T3 e aggiungere un millilitro di virus diluito in ciascun pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, aspirare con cura il terreno virale diluito e sostituirlo con due millilitri di terreno DMEM con il 10% di siero fetale bovino e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per una notte. Dopo l'incubazione, aspirare il vecchio terreno e sostituirlo con due microgrammi per millilitro di terreno DMEM contenente puromicina. Continuare a coltivare le cellule ogni tre giorni o a meno che il terreno non diventi giallo e rifornire con terreno fresco contenente puromicina.

Tra il 10° e il 12° giorno dopo l'infezione, aspirare il terreno dai pozzetti e lavare delicatamente con soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi colorare con un millilitro di soluzione di cristallovioletto a temperatura ambiente per due minuti. Dopo la colorazione, lavare accuratamente due volte con soluzione salina tamponata con fosfato.

Conta al microscopio il numero totale di colonie blu presenti in ciascun pozzetto. Seminare le cellule 32D-G-CSF-R in una piastra a sei pozzetti. Aggiungi il virus a una molteplicità di infezioni compresa tra 10 e 40.

Quindi aggiungere il polibrene a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per sei ore. Dopo l'incubazione, riunire le cellule in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule 32D possono perdere parzialmente la loro capacità di differenziarsi se coltivate a concentrazioni superiori a un milione di cellule per ml.

Pertanto, è molto importante dividere queste cellule in tempo e non far crescere eccessivamente le colture. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un pallone di coltura T25 contenente sei millilitri di terreno RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% inattivato termicamente e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Lavare due volte le cellule 32D-G-CSF-R con RPMI-1640 Medium senza citochine. Quindi seminare le cellule in un millilitro di terreno di differenziazione in una piastra a 24 pozzetti al giorno zero e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Le cellule impiegheranno dai sette ai nove giorni per differenziarsi in granulociti maturi.

Quindi conta il numero di celle usando il blu di tripano per escludere le cellule morte. Poiché l'IL-3 può inibire il processo di differenziazione, è assolutamente fondamentale rimuovere tutte le tracce della citochina prima di coltivare le cellule in GCSF. Citocentrifugare le cellule su un vetrino in una centrifuga con gli adattatori necessari a 20 volte g per cinque minuti.

Quindi fissare le cellule nel metanolo per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare asciugare le cellule. Colorare le cellule utilizzando la colorazione May-Grunwald Giemsa seguendo il protocollo del produttore. Una volta colorata, visualizza le cellule che hanno preso la macchia usando un ingrandimento 40X.

Sulla base della morfologia cellulare, quantificare il numero di blasti, cellule intermediamente differenziate e granulociti maturi nelle cellule colorate. Qui è mostrata una rappresentazione grafica che dimostra la proliferazione delle cellule 32D-G-CSF-R nell'interleuchina-3 e nel fattore stimolante le colonie di granulociti contenente terreni. L'asse delle ascisse rappresenta i giorni di trattamento.

L'asse y rappresenta il conteggio delle celle in scala logaritmica. Il grafico nero mostra la proliferazione quando le cellule vengono coltivate in terreno contenente interleuchina-3. Il grafico blu mostra un calo della proliferazione cellulare quando coltivate in terreno contenente fattore stimolante le colonie di granulociti.

Qui sono mostrati grafici a torta rappresentativi e la colorazione di May-Grunwald Giemsa che mostrano la proporzione e la morfologia differenziata delle cellule 32D-G-CSF-R nel terreno contenente fattore stimolante le colonie di granulociti. I grafici a torta dimostrano la proporzione di blasti, cellule intermediamente differenziate e neutrofili nel trattamento con fattore stimolante le colonie di granulociti a zero, due, quattro e sei giorni. Le cellule colorate con Giemsa al giorno zero hanno nuclei grandi e caratteristici e citoplasma scuro.

Il sesto giorno, le dimensioni nucleari sono ridotte e il citoplasma è ingrandito ma non scuro. Di seguito sono mostrati grafici a torta rappresentativi che mostrano la percentuale più elevata di cellule blastiche quando trasdotte con proteine di fusione BCR-ABL rispetto al vettore MSCV di controllo in terreni contenenti fattore stimolante le colonie di granulociti. La colorazione di Giemsa nel pannello inferiore è rappresentativa delle cellule quando trasdotta con proteine di controllo o di fusione BCR-ABL.

Le cellule sono state sottoposte a differenziazione neutrofila al sesto giorno quando sono state trasdotte con il vettore di controllo MSCV, ma le cellule trasdotte da BCR-ABL hanno mostrato principalmente cellule blastiche e nessun neutrofilo maturo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di coltivare le cellule del recettore 32D-G-CSF alle concentrazioni indicate.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come saggi di migrazione ed esperimenti di sopravvivenza per rispondere a ulteriori domande. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire la linea cellulare del recettore 32D-G-CSF che copre la manipolazione genetica mediante trasduzione, espansione, differenziazione lentivirale e retrovirale, e valutazione della proliferazione e della differenziazione di queste cellule. Non dimenticare che lavorare con i virus può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e vetri protettivi.