Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

L'obiettivo generale di questo esperimento è modificare geneticamente le cellule murine mieloidi 32D-G-CSF-R mediante sovraespressione o silenziamento del gene di interesse e determinare l'effetto di queste modifiche sulla proliferazione e sulla differenziazione neutrofila della linea cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ematonologia, come ad esempio in che modo la proteina di interesse possa essere coinvolta nella crescita e nella differenziazione delle cellule precursori mieloidi. Il principale vantaggio di questa linea cellulare è la capacità di proliferazione illimitata, la suscettibilità alle manipolazioni genetiche, il costo relativamente basso e la possibilità di ottenere un grado di semplificazione biologica necessario in determinati approcci sperimentali. A dimostrare la procedura oggi sarà Petr Danek, studente di dottorato nel mio laboratorio.

Preparare 250 millilitri di mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Quindi preparare 50 millilitri di mezzo di differenziamento.

In una piastra di Petri da 16 centimetri, seminare una sospensione monocellulare di cellule Bosc23 in 18 millilitri di mezzo DMEM integrato con siero fetale bovino al 10%. Coltivare per circa 24 ore fino a quando la confluenza raggiunge l'80%. Quindi, combinare il costrutto retrovirale MSCV, il vettore di impacchettamento PCL-echo, polietilenimina e mezzo con siero ridotto senza antibiotici. Incubare questa miscela in un Flowbox a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, sostituire con attenzione il mezzo di coltura delle cellule Bosc23 con 16 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato, integrato con siero fetale bovino al 2%, mantenuto a 37 gradi Celsius. Aggiungere quindi la miscela retrovirale goccia a goccia sulle cellule Bosc23. Infine, incubare la coltura a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo di coltura Bosc23 e aggiungere 18 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato con 10% di siero fetale bovino. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per trasferire il mezzo contenente il virus Bosc23 in un tubo conico da 50 millilitri. Conservare il tubo a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 18 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato con 10% di siero fetale bovino alle cellule Bosc23 e coltivare le cellule per 24 ore.

Centrifugare il supernatante virale a 1.500 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aliquotare il virus e congelarlo rapidamente con azoto liquido per conservarlo a meno 80 gradi Celsius.

In ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, seminare le cellule NIH/3T3 in tre millilitri di mezzo DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino per titolare un virus. Coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire il virus con mezzo preriscaldato senza vorticare le particelle virali. Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule NIH/3T3 e aggiungere un millilitro di virus diluito in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, aspirare con attenzione il mezzo virale diluito e sostituirlo con due millilitri di mezzo DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino e nuovamente incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, aspirare i vecchi mezzi e sostituirli con mezzo DMEM contenente due microgrammi per millilitro di puromicina. Continuare la coltivazione delle cellule ogni tre giorni o fino a quando il mezzo non diventa giallo, rifornendo con mezzo fresco contenente puromicina.

Tra il 10° e il 12° giorno dopo l'infezione, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare delicatamente con soluzione salina tamponata al fosfato. Quindi colorare con un millilitro di soluzione di violetto di cristallo a temperatura ambiente per due minuti. Dopo la colorazione, lavare attentamente due volte con soluzione salina tamponata al fosfato. Contare il numero totale di colonie blu presenti in ciascun pozzetto al microscopio.

Piastri le cellule 32D-G-CSF-R in una piastra a sei pozzetti. Aggiungi il virus a una multiplicità di infezione compresa tra 10 e 40. Quindi aggiungi la polibrenina a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro alle cellule e incuba a 37 gradi Celsius per sei ore. Dopo l'incubazione, raccogli le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifuga a 450 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule 32D possono perdere parzialmente la capacità di differenziarsi se crescono a concentrazioni superiori a un milione di cellule per ml; pertanto, è molto importante suddividere tempestivamente queste cellule e non far sovracrescere le colture.

Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un fiasco da coltura T25 contenente sei millilitri di Mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Lavare le cellule 32D-G-CSF-R due volte con mezzo RPMI-1640 privo di citochine. Successivamente, seminare le cellule in un millilitro di mezzo di differenziamento in una piastra a 24 pozzetti al giorno zero e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Le cellule impiegheranno da sette a nove giorni per differenziarsi in granulociti maturi. Quindi, contare il numero di cellule utilizzando il blu di tripano per escludere le cellule morte.

Poiché l'IL-3 può inibire il processo di differenziamento, è assolutamente fondamentale rimuovere ogni traccia della citochina prima di coltivare le cellule in GCSF.

Centrifugare le cellule su un vetrino in una centrifuga dotata di adattatori necessari a 20 volte g per cinque minuti. Quindi fissare le cellule in metanolo per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare asciugare le cellule. Colorare le cellule utilizzando la colorazione di May-Grunwald Giemsa seguendo il protocollo del produttore. Dopo la colorazione, osservare le cellule che hanno assunto il colorante con un ingrandimento di 40X.

In base alla morfologia cellulare, quantificare il numero di blasti, cellule intermedie differenziate e granulociti maturi nelle cellule colorate.

Qui è mostrata una rappresentazione grafica della proliferazione delle cellule 32D-G-CSF-R in un mezzo contenente interleuchina-3 e fattore stimolante le colonie di granulociti. L'asse x rappresenta i giorni di trattamento, l'asse y rappresenta il numero di cellule in scala logaritmica. Il grafico nero mostra la proliferazione quando le cellule sono coltivate in un mezzo contenente interleuchina-3. Il grafico blu mostra una ridotta proliferazione cellulare quando le cellule sono coltivate in un mezzo contenente fattore stimolante le colonie di granulociti.

Qui sono mostrati grafici a torta rappresentativi e colorazioni con May-Grunwald Giemsa che evidenziano la proporzione e la morfologia della differenziazione delle cellule 32D-G-CSF-R in un mezzo contenente fattore stimolante le colonie di granulociti. I grafici a torta mostrano la proporzione di blasti, cellule intermedie differenziate e neutrofili dopo trattamento con fattore stimolante le colonie di granulociti a zero, due, quattro e sei giorni. Le cellule colorate con Giemsa al giorno zero presentano nuclei grandi e caratteristici e citoplasma scuro. Al sesto giorno, le dimensioni del nucleo si riducono e il citoplasma aumenta ma non risulta scuro.

Qui sono mostrati grafici a torta rappresentativi che evidenziano la maggiore proporzione di cellule blastiche quando trasdotte con proteine di fusione BCR-ABL rispetto al vettore di controllo MSCV in un mezzo contenente fattore di stimolazione delle colonie di granulociti. La colorazione con Giemsa nel pannello inferiore è rappresentativa delle cellule trasdotte con proteine di fusione di controllo o BCR-ABL.

Le cellule hanno subito una differenziazione neutrofila al giorno sei quando sono state trasdotte con il vettore di controllo MSCV, mentre le cellule trasdotte con BCR-ABL hanno mostrato prevalentemente cellule blastiche e nessun neutrofilo maturo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di coltivare le cellule 32D-G-CSF recettore alle concentrazioni indicate. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come saggi di migrazione ed esperimenti di sopravvivenza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come gestire la linea cellulare 32D-G-CSF recettore, inclusa la manipolazione genetica mediante trasduzione lentivirale e retrovirale, l'espansione, la differenziazione e la valutazione della proliferazione e della differenziazione di queste cellule. Non dimenticate che lavorare con virus può essere pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti e occhiali protettivi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.