Name: Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Impara a modificare geneticamente le cellule precursori mieloidi murine 32D/G-CSF-R per studiare proliferazione e differenziazione neutrofila. Questo metodo avanzato aiuta a comprendere i meccanismi ematologici fondamentali.

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Gli autori ringraziano la Prof. ssa Ruud Delwel e Prof Ivo Touw per averci fornito la linea cellulare 32D/G-CSF-R e Prof. ssa Daniel G. Tenen per averci fornito la linea cellulare Bosc23. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dell'Agenzia Grant della Repubblica Ceca (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, l'Istituto di genetica molecolare dell'Accademia Ceca delle scienze (RVO 68378050) di supporto a MA-J, una borsa di studio UK GA (progetto n. 341015) da Charles University di Praga a MK e una borsa di studio UK GA (progetto n. 1278217) da Charles University di Praga al PD.

Nota: Passaggi che descrivono espansione, differenziazione e trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R sono presentati qui di seguito.
1. preparazione
<ol><li>Preparazione dei terreni
	<ol>
<li>Preparare 250 mL di terreno di coltura: medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 supplementato con 10% calore inattivato FBS (siero fetale bovino) e murini IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>In alternativa, utilizzare IL-3 fatta in casa. Per produrre IL-3 casalingo, trasduce cellule HEK293 con il vettore di espressione di IL-3 e raccogliere IL-3 contenente surnatante22. Nota: Gli antibiotici, quali penicillina G (100 UI/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), può essere utilizzati per la coltura di cellule in qualsiasi fase del protocollo se non diversamente specificato.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 50 mL di mezzo di differenziazione: medium RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e G-CSF umano (100 ng/mL). Nota: (Importante) non tutti i batch di siero supportano la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R. Prima dell'inizio di esperimento testare diversi lotti di siero. Si consiglia di testare almeno 4 diversi lotti e selezionare l'ottimale basato sulla capacità delle cellule 32D/G-CSF-R per differenziare. Vedi protocollo di differenziazione 32D/G-CSF-R qui sotto.</li>
		<li>Preparare 10 mL di medium di congelamento: medium RPMI 1640 supplementato con 40% FBS e 10% DMSO (dimetilsolfossido).</li>
	</ol></li>
	<li>Produzione del retrovirus
	<ol>
<li>Piastra di una sospensione unicellulare di cellule Bosc23 (6 × 10-6) in una capsula Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM (di per volta Eagle di Dulbecco Medium) contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h). Nota: Le cellule devono crescere in un monostrato e non forma grumi nella cultura. Conta cellulare può essere eseguita utilizzando diversi metodi (validi per il resto dei protocolli presentato qui). In caso di basso numero di campioni, conteggio manuale sotto il microscopio con camera di Bürker è raccomandato. In questo caso, utilizzare Trypan blu per l'esclusione delle cellule morte. Mescolare cellule 1:1 con 0,4% Trypan Blue in PBS. Per eseguire il conteggio del numero elevato di campioni, un contatore di cellule automatico può essere impiegato.</li>
		<li>Unire 40 µ g di retroviral costrutto (ad esempio MSCV), 20 µ g di pCL-Eco (packaging vettoriale)23, 80 µ l di PEI (polyethylenimine) e 2 mL di siero ridotto medio (ad es. Opti-MEM) medio (senza antibiotici). Incubare la miscela per 20 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Sostituire con attenzione medie cellule Bosc23 con 16 mL DMEM completate con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso. Nota: Non utilizzare antibiotici durante la transfezione, poiché può ridurre l'efficienza di trasfezione.</li>
		<li>Aggiungere la miscela preparata in 1.2.2. goccia a goccia e attentamente la Bosc23 cultura e incubare per 4 h a 37 ° C. Incubazione di limite a meno di 6 h a causa di tossicità di PEI.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, cambiare la sostanza Bosc23 a 18 mL pre-riscaldati DMEM contenente 10% FBS e coltivare le cellule per 48 h a 37 ° C. Posizionare i piatti in un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, tenere qui a partire da questo punto e seguire le procedure standard di sicurezza.</li>
		<li>Bosc23 medio (contenente ecotropic di particelle retrovirali) usando una pipetta sierologica di 25 mL in una provetta conica da 50 mL di raccogliere e conservare a 4 ° C. Nota: L'efficienza di trasfezione (importante) dovrebbe raggiungere il 90% per produrre un virus di alto titolo.</li>
		<li>Aggiungere mL 18 pre-riscaldati DMEM 10% FBS per Bosc23 cellule e coltivare per 24 h.</li>
		<li>Ripetere il punto 1.2.6. Nota: I surnatanti retrovirali da 1.2.6 e 1.2.8 possono essere pool quando raggiungono la stessa temperatura (4 ° C) per mantenere l'integrità virale.</li>
		<li>Per evitare la contaminazione di Bosc23 in surnatanti virali, spin virus raccolti a 1500 × g per 10 min a 4 ° C. Aliquotare virus, snap congelamento con azoto liquido o ghiaccio secco e conservare a-80 ° C. Si noti tuttavia che il virus preparato al momento è di qualità superiore in termini di efficienza di infezione rispetto gli stock congelati. Nota: (Importante) evitare ripetuti di congelamento/scongelamento del virus, poiché conduce alla degradazione virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Produzione di lentivirus
	<ol>
<li>Piastra di una sospensione unicellulare di HEK293T (rene embrionale umano 293T) cellule (6 × 10-6) in una capsula di Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h). Nota: Le cellule devono crescere in un monostrato e non forma grumi nella cultura.</li>
		<li>Combinare 15 µ g di costrutto lentivirale (ad esempio pGhU6), imballaggio pCMVdR8.74 di plasmidi (codifica per gag/pol, 12 µ g) e pMD2.VSVG (codifica per VSV-G, 1,4 µ g), PEI 85,2 µ l e 2 mL di siero ridotto medio (senza antibiotici). Incubare la miscela per 20 minuti a TA.</li>
		<li>Sostituire con attenzione HEK293T medio con 16 mL di DMEM completate con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso. Non usare antibiotici durante la transfezione, poiché può ridurre l'efficienza di trasfezione.</li>
		<li>Attentamente la miscela preparata in 1.3.2 alla coltura delle cellule HEK293T di goccia e incubare per 4 h a 37 ° C. Limitare la durata di incubazione per entro 6 ore per impedire la tossicità di PEI.</li>
		<li>Medio di cambiamento-18 mL pre-riscaldati DMEM 10% FBS e coltivare le cellule per 48 h a 37 ° C. Posizionare i piatti in un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, tenere qui a partire da questo punto e seguire le procedure standard di sicurezza.</li>
		<li>HEK293T medio (contenenti amphotropic particelle lentivirali) usando una pipetta sierologica di 25 mL in una provetta conica da 50 mL di raccogliere e conservare a 4 ° C. Nota: L'efficienza di trasfezione (importante) dovrebbe raggiungere il 90% per produrre un virus di alto titolo.</li>
		<li>Aggiungere con cautela 18 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS alle cellule HEK293T. Coltivare per 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Ripetere il punto 1.3.6. Nota: Una volta che raggiungono la stessa temperatura (4 ° C) per mantenere l'integrità virale pool surnatanti lentivirali da 1.3.6 e 1.3.8.</li>
		<li>Per evitare contaminazioni del surnatante virale con cellule di HEK293T, spin virus raccolti a 1500 × g per 10 min a 4 ° C. Aliquotare virus, snap congelamento con azoto liquido o ghiaccio secco e conservare a-80 ° C. Tuttavia, notare che preparata virus è di qualità superiore in termini di efficienza di infezione rispetto gli stock congelati. Nota: (Importante) evitare ripetuti di congelamento/scongelamento del virus, poiché conduce alla degradazione virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Titolazione del virus contenente un reporter GFP
	<ol>
<li>Semi di 1 × 10 cellule di NIH/3T35 a 300 µ l di DMEM 10% FBS per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. 7 pozzetti saranno impiegati per un virus titolo.</li>
		<li>Scongelare i virus a 37 ° C e aggiungere 1, 5, 10, 50, 100 e 500 µ l virus NIH/3T3 culture. Non aggiungere alcun virus nel controllo negativo bene. Coltivare le cellule in presenza di virus per 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Raccogliere le cellule NIH/3T3 utilizzando 30 µ l di tripsina/EDTA (acido etilendiamminotetracetico) (0,25% tripsina, EDTA 0,01% in PBS) e inserire le celle in 250 µ l PBS in un tubo di FACS (ordinamento delle cellule attivate la fluorescenza).</li>
		<li>Determinare la frequenza delle cellule GFP+ da citometria a flusso in ogni campione24. Escludere le cellule morte tramite l'aggiunta di una tintura di vitalità, come Hoechst 33258.</li>
		<li>Calcolare il numero totale di cellule GFP+ (basate sul numero delle cellule placcate e percentuale di cellule GFP+ ) e loro complotto contro il volume di virus usati per l'infezione. Nota: (Importante) efficienza di infezione raggiunge un plateau, quando vengono applicate le grandi dosi virale. Pertanto, è importante stimare il titolo basato sulle concentrazioni virali in cui l'infezione efficienza si verifica in un intervallo lineare (esempio riportato nella tabella 1). Il numero di cellule GFP+ indica il numero di particelle virali funzionale (TU - unità di trasformazione) in un volume determinato virus. Ricalcolare il numero di TU / mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Titolazione del virus contenente un reporter con puromicina.
	<ol>
<li>Semi di 5 × 104 cellule NIH/3T3 in 3 mL di DMEM 10% FBS per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti; impiegano 6 pozzi al virus di un titolo. Cultura durante la notte a 37 ° C.</li>
		<li>Giorno successivo diluire virus come indicato nella tabella 2. Per diluire il virus, utilizzare pre-riscaldato DMEM 10% FBS. Non centrifugare.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule NIH/3T3 e aggiungere 1 mL di virus diluito.</li>
		<li>Incubare per una notte a 37 ° C.</li>
		<li>Delicatamente sostituire il mezzo contenente virus con 2 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
		<li>Sostituire delicatamente NIH/3T3 medio con 2 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS contenente con puromicina (2 µ g/mL).</li>
		<li>Coltura a 37 ° C e con attenzione il refresh medio con con puromicina ogni 3 giorni o quando diventa giallo medio.</li>
		<li>A 10-12 giorni dopo l'infezione, aspirare medio da ciascun pozzetto e lavare delicatamente con PBS.</li>
		<li>Macchia con 1 mL di soluzione al cristalvioletto (cristalvioletto di 0,5% a 20% etanolo e dH2O), 2 min a RT e lavare accuratamente con PBS due volte.</li>
		<li>Contare le colonie blu presenti in ciascun pozzetto sotto un microscopio (ingrandimento X4). Nessun colonie dovrebbero essere osservati bene nel controllo negativo.</li>
		<li>Calcolare il numero totale di TU/mL considerando il fattore di diluizione.</li>
	</ol></li>
</ol>2. espansione e manutenzione delle cellule 32D/G-CSF-R
<ol><li>Se cellule 32D/G-CSF-R sono congelate, prendete un'aliquota e scongelare le cellule in bagnomaria a 37 ° C per 1 min e versare le cellule dal flaconcino direttamente in 10 mL di pre-riscaldato RPMI 1640 supplementato con 10% FBS in un tubo di 15mL. Inverti il tubo 3 volte e rallentare le cellule a 400 × g. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura contenente IL-3 ad una concentrazione di 0,3 × 106 cellule/mL.</li>
	<li>Concentrazione di crescita cellulare ottimale è 0.25-0.5 × 106 cellule/mL. Dividere le celle ogni 2 giorni, portandoli ad una concentrazione di 0.1-0.2 × 106 cellule/mL. Nota: Cellule 32D/G-CSF-R (importante) possono parzialmente perdono la loro capacità di differenziare se coltivate a concentrazioni superiori a 1 × 106 cellule/mL. Di conseguenza, è molto importante dividere le celle 32D/G-CSF-R in tempo.</li>
	<li>Se necessario, congelare e conservare le aliquote di cella per lunghi periodi di tempo a-80 ° C o in azoto liquido. Rotazione verso il basso 3 × 106 cellule, rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di medium di congelamento. Tubo posto in un contenitore di congelamento a-80 ° C. Per l'archiviazione a lungo termine, riposizionare le cellule in azoto liquido.</li>
</ol>3. trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R
<ol><li>Celle 32D/G-CSF-R Piastra in piastra a 6 pozzetti ad una concentrazione di 0,3 × 106 cellule/mL.</li>
	<li>Aggiungere la quantità appropriata di virus per raggiungere un MOI (molteplicità di infezione) tra 10 e 40. Nota: Più alto MOI si tradurrà in una maggiore percentuale di cellule GFP+ così come i livelli elevati di espressione del gene di interesse. Esempio: Per infettare 0,3 × 106 celle con un MOI di 10; 3 × 106 TU dovrà essere aggiunto alle cellule 32D/G-CSF-R.</li>
	<li>Aggiungere polybrene alla concentrazione finale 8 µ g/mL e incubare per 6 h a 37 ° C. In alternativa, eseguire la procedura di rotazione-inoculazione: Centrifugare a 1200 × g per 90 min a 30 ° C in una piastra di coltura utilizzando un rotore di swing-secchio e incubare per 3 ore a 37 ° C.</li>
	<li>Cellule di raccogliere, trasferire in una provetta da 15 mL e spin a 450 × g per 5 min (4 ° C).</li>
	<li>Eliminare il supernatante, risospendere le cellule pellettate in 6 mL di terreno di coltura, mettere in un matraccio di cultura cellulare T25 e la coltura a 37 ° C.</li>
	<li>48 ore più tardi, raccogliere le cellule e li spin a 450 × g per 5 min (4 ° C). Scartare il surnatante.</li>
	<li>In caso di un reporter GFP: posizionare le cellule in 500 µ l di PBS e ordinamento cellule GFP+ utilizzando un sorter di citometria a flusso. In caso di un reporter con puromicina contenente vettoriale: posizionare le cellule nel mezzo di coltura contenente 2 µ g/mL di con puromicina.</li>
	<li>Espandere le celle come necessario per esperimenti e un'ulteriore analisi. Nota: Le cellule Transduced (opzionale) possono essere congelate in media in un contenitore di congelamento a-80 ° C di congelamento e ulteriormente conservate nell'azoto liquido.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R cella analisi di proliferazione
<ol><li>Per valutare la proliferazione tasso posto 0.2 × 106 cellule in 1 mL di terreno di coltura e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
	<li>Giorno successivo conteggio delle cellule e diluirli torna a una concentrazione di 0,2 × 106 cellule/mL utilizzando il terreno di coltura. Incubare per una notte a 37 ° C. Tenere un registro delle concentrazioni di cella e diluizioni applicati alle culture quotidiane utilizzando la tabella 3.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.2 per tanti giorni come proliferazione deve essere valutata. Nota: La lunghezza dei saggi proliferazione dipenderà l'effetto del gene di interesse. In caso di un fenotipo forte, 8-9 giorni potrebbe essere sufficiente osservare un effetto significativo (Vedi Figura 3A). Tuttavia, in caso di un fenotipo più lieve, lunghi periodi di tempo potrebbero essere necessari.</li>
	<li>Valutare la crescita delle cellule facendo una curva di proliferazione, come indicato nella tabella 3.</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R cella analisi di differenziazione
<ol><li>Lavare 0,2 × 106 cellule 32D/G-CSF-R due volte con medium RPMI senza citochine. Nota: I passaggi di lavaggio prima dell'aggiunta di G-CSF nella cultura sono importanti, poiché la presenza di IL-3 residuo potrebbe inibire la differenziazione.</li>
	<li>Posizionare le cellule nel mezzo di differenziazione 1 mL (contenente 100 ng/mL G-CSF), in un pozzo 24/piatto, con una concentrazione di cellule di 0,2 × 106 cellule/mL (giorno 0). Cultura durante la notte a 37 ° C.</li>
	<li>Contare il numero di cellule/mL come indicato sopra (punto 1.2.1).</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 cellule su un vetrino (76 X 26 mm) utilizzando una centrifuga con adattatori necessari a 20 × g.</li>
	<li>Aggiornare le cellule di supporto e piastra di differenziazione ad una concentrazione di 0,2 × 105 cellule/mL su una piastra 24/pozzetti (1 giorno). Scartare la vecchia zolla e procedere il giorno successivo con passo 5.6 con la nuova piastra.</li>
	<li>Nei giorni 2-7, ripetere i passaggi da 5.3 a 5.5. Valutare la proliferazione delle cellule in presenza di G-CSF come descritto nel passaggio 4. Nota: (Importante) durante il differenziamento, proliferazione cellulare rallenta, quindi dopo 3-4 giorni in presenza di G-CSF è adeguata alle cellule di cultura alle più alte concentrazioni.</li>
	<li>Valutare stato di differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R basata sulla morfologia delle cellule.<ol>
<li>Difficoltà cellule dal passaggio 5.4 in metanolo per 5 min a RT e lasciare diapositive asciugare all'aria. Nota: Diapositive da 0 a 7 al giorno possono essere conservati a RT e fissa contemporaneamente. Allo stesso modo, essi possono anche essere tenuti a RT per periodi più lunghi dopo la fissazione.</li>
		<li>Macchia di celle utilizzando May-Grünwald Giemsa che macchia protocollo seguente del produttore.</li>
		<li>Visualizzare cellule marcate utilizzando un microscopio e ingrandimento X40.</li>
		<li>Quantificare il numero di blasti, cellule mediamente differenziate e granulociti maturi utilizzando immagini illustrative sulla descrizione nella tabella 4e Figura 1 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La scelta di un modello sperimentale è uno dei principali problemi nella ricerca. Anche se le cellule animali e umane primarie sono credute per produrre i dati più biologicamente rilevanti, questi modelli possono comportare preoccupazioni etiche e sono spesso associati a procedure costose e/o sofisticato isolamento/coltura. Cellule primarie sono limitate in numero e si stenta a manipolarle geneticamente. Inoltre, le cellule primarie rappresentano una popolazione eterogenea composta da vari tipi di cellule che possono com...

La popolazione di staminali e progenitrici ematopoietica fornisce l'organismo con una vasta gamma di cellule mature, tra cui cellule della linea mieloide (neutrofili, eosinofili, basofili e monociti). Il processo che spinge la produzione di cellule mieloidi da cellule staminali ematopoietiche è noto come mielopoiesi, e un'adeguata produzione di cellule mieloidi mature in risposta alle mutevoli esigenze è un prerequisito per il corretto superamento dell'organismo allo stress condizioni, come le infezioni e la perdita di sangue. Insufficiente produzione di cellule mieloidi mature può portare all'incapacità di eliminare gli agenti patogeni, la coagulazione del sangue ridotto e altre pericolose condizioni1,2. Inoltre, alterazioni nello sviluppo della linea mieloide possono anche essere associate con le malignità ematologiche, quali la leucemia mieloide acuta (AML)3. Alterazioni nella mielopoiesi possono verificarsi a causa di vari motivi, come difetti di cellule recettori di superficie4, alterate espressione di fattori di trascrizione5, alterata segnalazione percorsi6, mutazioni conseguente formazione / attivazione di oncogeni7o inattivazione di geni di tumore soppressore8.
Vari metodi sono stati sviluppati per studiare sviluppo mieloide e valutare l'effetto di specifiche alterazioni genetiche in questo processo. Approcci comuni usati per studiare la mielopoiesi coinvolgono cellule primarie e topi transgenici. Se questi modelli consentono l'acquisizione di dati biologicamente rilevanti, essi hanno alcune limitazioni. L'utilizzo di cellule primarie incontra un numero limitato di cellule e un limitato periodo di cultura, restringere le possibilità per alterare l'espressione genica e la successiva analisi biologica o biochimica. Topi transgenici sono costosi e richiedono un grado ragionevole di giustificazione biologica. Inoltre, l'utilizzo di modelli in vivo aggiunge un grado di complessità nella comprensione del ruolo di un gene di interesse in un determinato processo. Pertanto, sono necessari approcci alternativi per aggirare queste limitazioni. Linee cellulari hanno indiscutibili vantaggi: (1) possiedono capacità di proliferazione illimitata che permette di generare abbastanza materiale per studi biochimici e biologici, (2) essi sono suscettibili di manipolazioni genetiche (atterramento, ad eliminazione diretta, sovraespressione), (3) il costo è relativamente basso, e (4) consentono un certo grado di semplificazione biologica necessaria in alcuni approcci sperimentali.
Parentale IL-3 (interleuchina-3) dipendente 32D linea cellulare è stata fondata nel 1983 da Greenberger e colleghi tramite l'infezione di cellule del midollo osseo da topi C3H/HeJ con amico leucemia murina virus9. 32D diversi cloni sono stati descritti in letteratura: cl-239, cl-310e cl-1011. Le cellule di cl-3 32D sono state indicate per proliferare in IL-3 e subire la differenziazione neutrophilic previo trattamento con granulocyte-colonia stimolazione fattore (G-CSF)10. Al contrario, 32D cl-10 cellule, pur essendo dipendente di IL-3, non sono stati originariamente distinguendo in risposta al trattamento di G-CSF. Nel 1995 il gruppo del Dr. Ivo Touw retrovirally trasdotte 32D cl-10 cellule con wild type e forme mutanti del recettore del G-CSF (G-CSF-R), al fine di identificare le aree funzionalmente importanti di questo recettore11. Questo studio ha provocato la generazione delle cellule 32D/G-CSF-R, che sono allo stesso modo dipendenti IL-3, ma entro 6-10 giorni dopo il rimontaggio di IL-3 con G-CSF, le cellule smettono di proliferare e differenziarsi irreversibilmente in neutrofili maturi. Queste proprietà rendono 32D cl-3 e cellule 32D/G-CSF-R modelli semplificati di differenziazione neutrophilic murina che può essere modulata da due ben definito fattori di crescita e differenziazione - IL-3 e G-CSF. Durante gli ultimi decenni più gruppi hanno utilizzato cellule 32D/G-CSF-R per studiare il ruolo dei geni particolari nella proliferazione e differenziazione delle cellule mieloidi in cultura12,13,14,15 , 16e per lo studio di G-CSF, segnalazione17,18. D'importanza, i risultati ottenuti con questa linea cellulare correlate con i dati ottenuti con le cellule primarie e topi transgenici16,19,20,21. Di conseguenza, crediamo che cellule 32D/G-CSF-R, essendo un modello ampiamente usato e ben consolidato, rappresentano un sistema prezioso per lo studio del differenziamento mieloide che può essere utilizzato in parallelo con altri approcci questa domanda.
Qui, protocolli dettagliati che descrivono la gestione della linea cellulare 32D/G-CSF-R, quale espansione di copertura, la differenziazione e valutazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule è presentato. Vengono fornite informazioni dettagliate per la modificazione genetica di cellule 32D/G-CSF-R, mediante trasduzione retrovirale o lentivirali, così come protocolli per titolazione del virus. Inoltre, vengono forniti diversi risultati rappresentativi che illustrano le potenziali applicazioni delle cellule 32D/G-CSF-R.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 terreno in polvere</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td><td>T 121-10</td><td>senza NaHCO3, con L-glutammina</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>31985-047</td><td>L-glutammina, fenolo rosso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>PAA Laboratories (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)</td><td>MT35011CV</td><td>Per la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R Siero</td></tr><tr><td>fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule HEK293T, NIH3T3, BOSC23</td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>Polvere di sale solfato di streptomicina</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murino IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>umano G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td>Lineare, MW 25.000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cristallovioletto</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Maggio-Gr&uuml; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Italia</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32d/g-csf-r cellule

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Comprensione della biologia delle cellule staminali e progenitrici ematopoietica ha implicazioni importanti per la medicina rigenerativa e il trattamento delle patologie ematologiche. Nonostante i dati più rilevanti che possono essere acquistati utilizzando modelli in vivo o colture primarie, la scarsa abbondanza di cellule staminali e progenitori emopoietici limita considerevolmente la piscina delle tecniche idonee per le loro indagini. Pertanto, l'uso di linee cellulari permette una produzione sufficiente di materiale biologico per l'esecuzione di proiezioni o saggi che richiedono numeri di grandi cellule. Qui presentiamo una descrizione dettagliata, lettura e interpretazione delle analisi di proliferazione e differenziazione che vengono utilizzati per l'indagine dei processi coinvolti nella mielopoiesi e differenziazione neutrophilic. Questi esperimenti utilizzano la linea cellulare mieloide murino dipendente 32D/G-CSF-R citochina, che possiede la capacità di proliferare in presenza di IL-3 e si differenziano in G-CSF. Forniamo ottimizzato protocolli per la gestione delle cellule 32D/G-CSF-R e discutere problemi e inconvenienti che potrebbero compromettere l'analisi descritte e risultati attesi. Questo articolo contiene inoltre protocolli per produzione retrovirale e lentivirale, titolazione e trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R. Dimostriamo che la manipolazione genetica di queste cellule può essere impiegato per eseguire con successo gli studi molecolari e funzionali, che possono integrare i risultati ottenuti con le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche primarie o modelli in vivo .

Proliferazione e la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R
Per valutare la proliferazione di cellule 32D/G-CSF-R condizioni pro-proliferativa e pro-differenziazione, 32D/G-CSF-R cellule sono state coltivate in media che contengono IL-3 e G-CSF, rispettivamente. È stato osservato che le cellule coltivate in medium contenente IL-3 (10 ng/mL) si dividono circa ogni 24 h (Figura 2A). Per la sostituzion...

Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.

Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è modificare geneticamente le cellule murine mieloidi 32D-G-CSF-R mediante sovraespressione o silenziamento del gene di interesse e determinare l'effetto di queste modifiche sulla proliferazione e sulla differenziazione neutrofila della linea cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ematonologia, come ad esempio in che modo la proteina di interesse possa essere coinvolta nella crescita e nella differenziazione delle cellule precursori mieloidi. Il principale vantaggio di questa linea cellulare è la capacità di proliferazione illimitata, la suscettibilità alle manipolazioni genetiche, il costo relativamente basso e la possibilità di ottenere un grado di semplificazione biologica necessario in determinati approcci sperimentali. A dimostrare la procedura oggi sarà Petr Danek, studente di dottorato nel mio laboratorio.Preparare 250 millilitri di mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Quindi preparare 50 millilitri di mezzo di differenziamento.In una piastra di Petri da 16 centimetri, seminare una sospensione monocellulare di cellule Bosc23 in 18 millilitri di mezzo DMEM integrato con siero fetale bovino al 10%. Coltivare per circa 24 ore fino a quando la confluenza raggiunge l'80%. Quindi, combinare il costrutto retrovirale MSCV, il vettore di impacchettamento PCL-echo, polietilenimina e mezzo con siero ridotto senza antibiotici. Incubare questa miscela in un Flowbox a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, sostituire con attenzione il mezzo di coltura delle cellule Bosc23 con 16 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato, integrato con siero fetale bovino al 2%, mantenuto a 37 gradi Celsius. Aggiungere quindi la miscela retrovirale goccia a goccia sulle cellule Bosc23. Infine, incubare la coltura a 37 gradi Celsius per quattro ore.Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo di coltura Bosc23 e aggiungere 18 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato con 10% di siero fetale bovino. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per trasferire il mezzo contenente il virus Bosc23 in un tubo conico da 50 millilitri. Conservare il tubo a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 18 millilitri di mezzo DMEM preriscaldato con 10% di siero fetale bovino alle cellule Bosc23 e coltivare le cellule per 24 ore. Centrifugare il supernatante virale a 1.500 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aliquotare il virus e congelarlo rapidamente con azoto liquido per conservarlo a meno 80 gradi Celsius. In ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, seminare le cellule NIH/3T3 in tre millilitri di mezzo DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino per titolare un virus. Coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire il virus con mezzo preriscaldato senza vorticare le particelle virali. Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule NIH/3T3 e aggiungere un millilitro di virus diluito in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, aspirare con attenzione il mezzo virale diluito e sostituirlo con due millilitri di mezzo DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino e nuovamente incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, aspirare i vecchi mezzi e sostituirli con mezzo DMEM contenente due microgrammi per millilitro di puromicina. Continuare la coltivazione delle cellule ogni tre giorni o fino a quando il mezzo non diventa giallo, rifornendo con mezzo fresco contenente puromicina.Tra il 10° e il 12° giorno dopo l'infezione, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare delicatamente con soluzione salina tamponata al fosfato. Quindi colorare con un millilitro di soluzione di violetto di cristallo a temperatura ambiente per due minuti. Dopo la colorazione, lavare attentamente due volte con soluzione salina tamponata al fosfato. Contare il numero totale di colonie blu presenti in ciascun pozzetto al microscopio.Piastri le cellule 32D-G-CSF-R in una piastra a sei pozzetti. Aggiungi il virus a una multiplicità di infezione compresa tra 10 e 40. Quindi aggiungi la polibrenina a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro alle cellule e incuba a 37 gradi Celsius per sei ore. Dopo l'incubazione, raccogli le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifuga a 450 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule 32D possono perdere parzialmente la capacità di differenziarsi se crescono a concentrazioni superiori a un milione di cellule per ml; pertanto, è molto importante suddividere tempestivamente queste cellule e non far sovracrescere le colture. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un fiasco da coltura T25 contenente sei millilitri di Mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-3 murina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore.Lavare le cellule 32D-G-CSF-R due volte con mezzo RPMI-1640 privo di citochine. Successivamente, seminare le cellule in un millilitro di mezzo di differenziamento in una piastra a 24 pozzetti al giorno zero e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Le cellule impiegheranno da sette a nove giorni per differenziarsi in granulociti maturi. Quindi, contare il numero di cellule utilizzando il blu di tripano per escludere le cellule morte. Poiché l'IL-3 può inibire il processo di differenziamento, è assolutamente fondamentale rimuovere ogni traccia della citochina prima di coltivare le cellule in GCSF. Centrifugare le cellule su un vetrino in una centrifuga dotata di adattatori necessari a 20 volte g per cinque minuti. Quindi fissare le cellule in metanolo per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare asciugare le cellule. Colorare le cellule utilizzando la colorazione di May-Grunwald Giemsa seguendo il protocollo del produttore. Dopo la colorazione, osservare le cellule che hanno assunto il colorante con un ingrandimento di 40X.In base alla morfologia cellulare, quantificare il numero di blasti, cellule intermedie differenziate e granulociti maturi nelle cellule colorate. Qui è mostrata una rappresentazione grafica della proliferazione delle cellule 32D-G-CSF-R in un mezzo contenente interleuchina-3 e fattore stimolante le colonie di granulociti. L'asse x rappresenta i giorni di trattamento, l'asse y rappresenta il numero di cellule in scala logaritmica. Il grafico nero mostra la proliferazione quando le cellule sono coltivate in un mezzo contenente interleuchina-3. Il grafico blu mostra una ridotta proliferazione cellulare quando le cellule sono coltivate in un mezzo contenente fattore stimolante le colonie di granulociti.Qui sono mostrati grafici a torta rappresentativi e colorazioni con May-Grunwald Giemsa che evidenziano la proporzione e la morfologia della differenziazione delle cellule 32D-G-CSF-R in un mezzo contenente fattore stimolante le colonie di granulociti. I grafici a torta mostrano la proporzione di blasti, cellule intermedie differenziate e neutrofili dopo trattamento con fattore stimolante le colonie di granulociti a zero, due, quattro e sei giorni. Le cellule colorate con Giemsa al giorno zero presentano nuclei grandi e caratteristici e citoplasma scuro. Al sesto giorno, le dimensioni del nucleo si riducono e il citoplasma aumenta ma non risulta scuro.Qui sono mostrati grafici a torta rappresentativi che evidenziano la maggiore proporzione di cellule blastiche quando trasdotte con proteine di fusione BCR-ABL rispetto al vettore di controllo MSCV in un mezzo contenente fattore di stimolazione delle colonie di granulociti. La colorazione con Giemsa nel pannello inferiore è rappresentativa delle cellule trasdotte con proteine di fusione di controllo o BCR-ABL.Le cellule hanno subito una differenziazione neutrofila al giorno sei quando sono state trasdotte con il vettore di controllo MSCV, mentre le cellule trasdotte con BCR-ABL hanno mostrato prevalentemente cellule blastiche e nessun neutrofilo maturo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di coltivare le cellule 32D-G-CSF recettore alle concentrazioni indicate. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come saggi di migrazione ed esperimenti di sopravvivenza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come gestire la linea cellulare 32D-G-CSF recettore, inclusa la manipolazione genetica mediante trasduzione lentivirale e retrovirale, l'espansione, la differenziazione e la valutazione della proliferazione e della differenziazione di queste cellule. Non dimenticate che lavorare con virus può essere pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti e occhiali protettivi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

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