Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di migliorare l'efficienza produttiva di embrioni ricostruiti e topi clonati utilizzando il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia di base, nella biologia dello sviluppo e nel salvataggio di animali in via di estinzione. Come lo sviluppo embrionale, la programmazione nucleare e la conservazione della ricerca genetica.

Il vantaggio principale di questo metodo e di questa tecnica è che è possibile generare topi clonati con un livello pratico di efficienza con procedure semplici. Dopo aver preparato il terreno di coltura secondo il protocollo di testo, sciogliere 1,2 grammi di BSA in 10 ml di acqua sterile a temperatura ambiente. Aggiungere circa 0,12 grammi di perle di resina a scambio ionico misto alla soluzione BSA a temperatura ambiente mescolando delicatamente.

Quando le perle cambiano colore da blu verde a oro, utilizzare una pipetta per recuperare la soluzione surnatante, quindi sostituire le perle con un lotto fresco. Dopo aver confermato che le perle fresche non cambiano colore, recuperare la soluzione. Quindi aggiungere 250 microlitri di bicarbonato di sodio al 10,5%.

Utilizzando un filtro da 0,45 micron, sterilizzare il surnatante, quindi etichettarlo come soluzione madre DBSA e conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver eseguito l'eutanasia su topi femmina sottoposti a superovulazione secondo il protocollo di testo, ha utilizzato tecniche di dissezione standard per incidere l'addome per accedere al tratto riproduttivo. Usando piccole forbici e pinzette, estirpare gli ovidotti e trasferirli su un foglio di carta da filtro per rimuovere il sangue dalla superficie.

Successivamente, immergere gli ovidotti in olio minerale, quindi utilizzare aghi da dissezione per tagliare l'ampolla dell'ovidotto e spostare i complessi di ovociti cumuliformi provenienti dall'ampolla in gocce da 200 microlitri di terreno HCZB con ialuronidasi allo 0,1%. Incubare il fazzoletto su una piastra riscaldante per cinque minuti. Sotto uno stereomicroscopio, confermare che le cellule del cumulo vengono rilasciate dai complessi ovocitari del cumulo, quindi trasferire gli ovociti del secondo stadio meiotico o della metafase M2 con alcune cellule del cumulo rimanenti al terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA.

Lavare gli ovociti dello stadio M2 quattro volte pipettandoli su e giù nel terreno per staccare le cellule del cumulo rimanenti. Quindi incubare gli ovociti in terreno a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino all'enucleazione. Per isolare gli ovociti denudati dai complessi ovocitari del cumulo, al microscopio stereoscopico utilizzando una pipetta, trasferire un piccolo numero delle cellule del cumulo rimanenti disperse dai complessi ovocitari del cumulo al terreno HCZB con il 6% di DBSA.

Posizionare le cellule del cumulo sulla piastra riscaldante a 37 gradi Celsius fino a quando non sono necessarie per il trasferimento nucleare delle cellule somatiche o SCNT. Dopo aver preparato il terreno PVP e le soluzioni madre CB secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta sterilizzata con 20 microlitri di terreno HCZB contenente cinque microgrammi per millilitro di CB per lavare gli ovociti dello stadio M2. Dopo aver ripetuto il lavaggio cinque volte, incubare gli ovociti in soluzione di enucleazione sulla piastra riscaldante per 10 minuti.

Successivamente, preparare la camera di enucleazione, quindi utilizzare una pipetta per trasferire gli ovociti M2 nella camera. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di enucleazione e coprire la camera con olio minerale. Al microscopio a temperatura ambiente, identificare i fusi e i cromosomi dell'ovocita dello stadio M2.

Quindi, utilizzando una pipetta di mantenimento e una micropipetta, orientare l'ovocita con un primo corpo polare pronunciato in modo che il posizionamento del fuso e del cromosoma sia alla posizione 3:00 o 9:00. Impostare l'intensità dell'impulso paizo da tre a sei e, utilizzando una pipetta di micromanipolazione, perforare la zona pellucida e praticare un foro in essa. Quindi con una quantità minima di citoplasma enucleare completamente i fusi e i cromosomi.

Alla luce visibile, confermare l'assenza di cromosomi nel citoplasma, quindi con il terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA privo di CB, lavare accuratamente gli ovociti enucleati. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino alla fusione cellulare. Per preparare l'HBJE, aggiungere 260 microlitri di soluzione di sospensione HBJE ghiacciata all'HVJ-E liofilizzato e pipettare su e giù fino a completa sospensione.

Preparare aliquote da cinque microlitri della soluzione e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino alla fusione cellulare. Per effettuare la fusione cellulare, utilizzare 20 microlitri di tampone di fusione cellulare per diluire cinque microlitri di soluzione HVJ-E. Mettere la soluzione HBJE diluita sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Dopo aver preparato la camera di fusione cellulare come mostrato qui, utilizzare una pipetta per trasferire gli ovociti enucleati nel terreno HCZB nella camera. Aggiungere quattro microlitri di ciascuna soluzione come mostrato e utilizzare circa un millilitro di olio minerale per coprire la camera. Posizionare la camera con gli ovociti enucleati a temperatura ambiente al microscopio con ingrandimento 400x.

Quindi, utilizzando la pipetta di micromanipolazione, trasferire le cellule del donatore nella soluzione di sospensione HVJ-E. Aspirare le cellule del cumulo una per una per separarle equamente l'una dall'altra, consentendo la fusione seriale delle cellule. Quindi, con una pipetta di mantenimento, mantenere gli ovociti enucleati nel terreno HCZB e utilizzare l'impulso paizo con la pipetta di micromanipolazione per perforare la zona pellucida.

Dopo aver aperto il foro nella zona pellucida, pipettare una cellula cumuliforme con circa cinque volte il volume della soluzione di HVJ-E ed espellerla ermeticamente nella membrana dell'ovocita senza passare attraverso la membrana. Dopo la manipolazione della fusione cellulare, trasferire prontamente gli ovociti in un terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA e spostarli in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora. Le fasi di elaborazione devono essere completate entro 10 minuti dal posizionamento degli ovociti enucleati nel terreno HCVB al microscopio e al loro ritorno nell'incubatore.

Dopo la fusione cellulare, al microscopio con ingrandimento 400x, verificare la presenza di condensazione cromosomica prematura negli ovociti ricostruiti. Trasferisci gli ovociti ricostruiti in un terreno di attivazione contenente tricostatina A, o TSA, e incubali a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica nell'aria per sei ore. Osservare la formazione di pronuclei negli embrioni SENT, quindi applicare altre due ore di trattamento TSA in terreno MKSOM con 0,3% di TBSA.

Effettuare il trattamento con vitamina C secondo il protocollo di testo. Come si vede in questa tabella, il trattamento con TSA e vitamina C su ovociti di topi clonati ha mostrato un tasso molto elevato di formazione pronucleata e si è sviluppato fino allo stadio di due cellule in tutte le condizioni. Alcuni embrioni clonati, che sono stati derivati da cellule del cumulo e sviluppati fino allo stadio di due cellule, sono stati trasferiti in ovidotti di femmine pseudo gravide.

Questa figura mostra sei progenie clonata che si è sviluppata su 72 embrioni trasferiti prodotti da tre femmine gravide mediante il trattamento seriale di TSA e vitamina C. Infine, come dimostrato qui, il trattamento con TSA e VC ha migliorato significativamente l'efficienza dello sviluppo embrionale in vitro fino allo stadio di blastocisti. Durante il tentativo di eseguire questa procedura è importante ricordare che tutti i terreni e i reagenti necessari sono preparati in anticipo. La procedura stessa, semplice da seguire e ben preparata, garantirà il raggiungimento dei risultati attesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre ovociti ricostruiti.