Name: Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora lefficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per la clonazione di topi mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche con tricostatina A e vitamina C. Questo protocollo standardizzato migliora l'efficienza dello sviluppo embrionale.

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Questo lavoro è stato supportato dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 di K.M. Sumitomo Foundation Grant per progetti di ricerca scienza base (150810 di K.M.). Kindai University Research Grant (15-I-2 K.M. e M.A.). Modus operandi riconoscere il supporto di base fornito da Cancer Research UK (C6946/A24843) e il Wellcome Trust (203144/Z/16/Z).  Ringraziamo la sig. ra N. Backes-Kamimura e Mr. J. Horvat per correzione di bozze.

Tutte le procedure di animale conformano alle linee guida di Kindai University per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. preparazione di terreni di coltura
<ol><li>Preparare il supporto di KSOM (mKSOM) modificato per la coltura embrionale, composto da 95 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM P (+)-glucosio, 0,2 mM sodio piruvato, L-Glutammina, polivinilpirrolidone (PVP), mM 25,07 NaHCO3, 1,0 g/L di 1.0 mM 10 mM DL-lattato di sodio 0,05 g/L penicillina e streptomicina in acqua sterile 0,05 g/L.</li>
	<li>Preparare il supporto di tamponata Hepes CZB (HCZB) per la manipolazione dell'embrione, costituito da 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM DL-lattato di sodio, 5,55 mM P (+)-glucosio, 0,025 g/mL penicillina, 0,035 g/L streptomicina, 0,014 mM rosso fenolo, alcool polivinilico 1,0 g/L, 5.0 mM NaHCO3e 20,0 mM Hepes sale di sodio in acqua sterile.</li>
	<li>Preparare il supporto di attivazione per l'attivazione degli ovociti: mKSOM supplementato con 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µ g/mL citocalasina B (CB) e 5 mM SrCl2.</li>
</ol>2. preparazione di deionizzata albumina di siero bovino (dBSA)
<ol><li>Sciogliere 1,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in 10 mL di acqua sterile a temperatura ambiente (una concentrazione finale di 12%).</li>
	<li>Aggiungere circa 0,12 g di perle di resina di scambio ionico misto al precedente preparato 12% di BSA in acqua sterile a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
	<li>Quando le perline cambia colore dal blu-verde all'oro, recuperare la soluzione surnatante con una pipetta. Quindi sostituire le perline con il fresco (Figura 1). Nota: La sostituzione di perline normalmente viene eseguita una sola volta. Forse richiede poche sostituzioni di deionizzazione completa. Solo come una guida, se il colore delle perle rimane invariato da blu-verde all'oro, indica che lo scambio ionico è completo.</li>
	<li>Recuperare la soluzione dopo la conferma che non esiste nessun cambiamento di colore nelle perle. Nota: Se la soluzione recuperata diventa torbida, centrifugare per impedire l'intasamento del filtro (175 x g, 5 min).</li>
	<li>Integrare il recuperato la soluzione con 250 µ l di 10,5% NaHCO3. Nota: Questo processo è inteso per la soluzione di dBSA neutralizzare condizione di pH. Tuttavia, NaHCO3 può essere superflua.</li>
	<li>Sterilizzare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 µm e conservare a-20 ° C come soluzione di riserva dBSA.</li>
</ol>3. ovocita collezione
Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in camere con aria condizionate e luce controllata.
<ol><li>Super-ovulare ogni mouse B6D2F1 femminile (età compresa tra 8-10 settimane) tramite l'iniezione intraperitoneale di 7,5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG) e 7,5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) 48 h dopo l'iniezione di PMSG.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia di dislocazione cervicale 14-16 h dopo l'iniezione di hCG. Incise l'addome per accedere il tratto riproduttivo usando tecniche di dissezione standard13. Brevemente, pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale al midline con le forbici. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle verso la testa e la coda. Tagliare il peritoneo utilizzando le forbici, spingere via le bobine dell'intestino e confermare la presenza di due corni dell'utero, ovidotti e le ovaie.</li>
	<li>Estirpare ovidotti con piccole Forbici rette e pinzette, posto su un foglio di carta da filtro per pulire il sangue dalla superficie. Impostare gli ovidotti in olio minerale. Quindi, tagliare l'ampolla dell'ovidotto utilizzando aghi di dissezione e spostare i complessi cumulo-ovocita proveniente dal ampulla dell'ovidotto in gocce per 200 µ l di HCZB con 0,1% ialuronidasi. Incubare per 5 minuti su una piastra riscaldante. Attenzione: Un'esposizione di più di 10 min in mezzo HCZB con 0,1% ialuronidasi sarebbe dannosa per gli ovociti.</li>
	<li>Confermare che le cellule del cumulo vengono rilasciate dai complessi cumulo-ovocita sotto un microscopio stereoscopico, trasferimento seconda metafase meiotica (MII) fase ovociti con alcune cellule del cumulo restante per mKSOM media contenenti 0,3% dBSA. Quindi, lavare gli ovociti di fase MII quattro volte pipettando su e giù (usando una pipetta di < 100 µm di diametro interno) in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA per staccare le restanti cellule del cumulo. Nota: L'uso di una pipetta piccola facilita il distacco delle cellule del cumulo.</li>
	<li>Incubare gli ovociti di fase di Mll in mKSOM Media contenente dBSA 0,3% a 37 ° C inferiore al 5% CO2 incubatrice fino al enucleation. Nota: È consigliabile una piccola pipetta con un diametro che è leggermente superiore a quello dell'ovocita.</li>
</ol>4. preparazione delle cellule erogarici per trasferimento nucleare
<ol><li>Dopo passi 3,3-3,5, ovociti decumulati sono isolati dai complessi cumulo-ovocita. Trasferire una piccola quantità (circa 2 µ l) delle restanti cellule del cumulo dislocate dai complessi cumulo-ovocita nel mezzo di HCZB con l'ialuronidasi 0,1% a mezzo HCZB con 6% dBSA utilizzando una pipetta sotto un microscopio stereoscopico.</li>
	<li>Posizionare le cellule del cumulo in mezzo HCZB con 6% dBSA sulla piastra riscaldante a 37 ° C fino a quando necessario per SCNT. Nota: Quando le cellule del fibroblasto (ad es., cellule dei fibroblasti embrionali murini) sono usate come cellule del donatore, staccare le cellule da un piatto di coltura del tessuto e centrifugare a loro in una pallina. Risospendere il pellet di cellule nel mezzo HCZB che contiene 6% dBSA.</li>
</ol>5. enucleazione di ovociti
<ol><li>Preparare il supporto di PVP di 9% aggiungendo 0,9 g PVP a 10 mL di terreno di HCZB, conservare in frigorifero durante la notte (4 ° C) e poi sterilizzarlo usando un filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Preparare soluzioni «stock» CB (concentrazione di 1 mg/mL) con l'aggiunta di 5 mg di CB a 5 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Diluire la soluzione di riserva CB con il mezzo di HCZB (una concentrazione finale di 5 µ g/mL) e utilizzare come soluzione di enucleazione.</li>
	<li>Lavare gli ovociti di fase di Mll in 20 µ l di terreno HCZB contenente 5 µ g/mL CB (soluzione di enucleazione) di inspirare ed espirare attraverso la pipetta sterilizzata (diametro interno: 150 µm a 200 µm). Ripetere il lavaggio cinque volte. Attendere circa 10 min sulla piastra di riscaldamento in soluzione di enucleazione prima di iniziare il processo di enucleazione.</li>
	<li>Preparare la camera di enucleazione come mostrato nella Figura 2A. Trasferire gli ovociti di Mll alla camera di enucleazione di inspirare ed espirare con la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); mettere 4 µ l di soluzione di enucleazione e coprire la camera con olio minerale. Nota: Invece di una camera, una cover di un 60mm di Petri può essere utilizzata.</li>
	<li>Identificare i mandrini e cromosomi dell'ovocita fase MII al microscopio (400 X) a temperatura ambiente. Orientare l'ovocita di fase di Mll con il primo globulo polare pronunciato, in modo che il posizionamento del mandrino e del cromosoma è alle 3 o 9 posizione (Figura 2B) usando una pipetta di supporto e la micropipetta. Nota: Il microscopio utilizzato ha lenti di ingrandimento di 400 volte in totale. Inoltre, la lente dell'obiettivo Nardi è 5 X / 0.12 e 40 X / 0.55. L'azionamento di impulso piezo-elettrici della pipetta consente rapida perforazione della zona pellucida. Inoltre, un sistema laser (ad esempio, XYClone) è anche utilizzabile per la perforazione della zona pellucida al posto del sistema di azionamento piezo-elettrico.</li>
	<li>Impostare l'intensità di stimolazione piezo per 3-6 e drill per la zona pellucida usando una pipetta di micromanipolazione (7-8 µm diametro interno estremità piatta in punta) con l'impulso di piezo di guida. Dopo l'apertura di un foro nella zona pellucida, completamente enucleare i mandrini e cromosomi con una minima quantità di citoplasma (Figura 2). Nota: Durante questo processo, gli ovociti tendono a strettamente attaccare sul fondo del piatto o dispensare dovuto il mezzo senza BSA14. Entro 10 minuti, deve essere completato il processo di enucleazione e gli ovociti enucleated devono essere restituiti nell'incubatore. Il numero appropriato di ovociti che possono essere manipolate in un enucleation è tra 10 e 20. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di enucleazione.</li>
	<li>Confermare l'assenza dei cromosomi nel citoplasma sotto luce visibile (Figura 2, medio), quindi lavare accuratamente gli ovociti enucleated in mKSOM medium contenente 0,3% dBSA carente CB. Introdurre il piatto nell'incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 fino a quando la fusione cellulare. Nota: Dopo il enucleation, rimosso da ooplasma citoplasma contiene i mandrini e cromosomi.</li>
</ol>6. fusione di una cellula donatrice e un ovocita Enucleated
<ol><li>
Preparazione di HVJ-E
	<ol>
<li>Aggiungi 260 µ l di soluzione di sospensione HVJ-E ghiacciata a liofilizzato HVJ-E (da kit, vedere la Tabella materiali) e pipettare su e giù fino a quando completamente sospesa. Nota: La quantità appropriata di liofilizzato HVJ-E viene preparata in una bottiglia, e 260 µ l HVJ-E sospensione soluzione è incluso nel kit.</li>
		<li>Preparare 5 aliquote µ l della soluzione HVJ-E e quindi conservare a-80 ° C fino a fusione cellulare. Attenzione: Trattare con cura il HVJ-E su ghiaccio, poiché è sensibile alla temperatura. Dopo il completamento dell'esperimento, in modo appropriato autoclave HVJ-E materiali e contenitori per inattivare completamente componenti virus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fusione cellulare
	<ol>
<li>Diluire il 5 µ l di soluzione di HVJ-E con 20 µ l di tampone di fusione la cella immediatamente prima dell'uso. Posto la soluzione diluita di HVJ-E su ghiaccio fino all'utilizzo. Nota: Il buffer di fusione delle cellule è incluso nel kit HVJ-E.</li>
		<li>Preparare la camera di fusione delle cellule come mostrato in Figura 3A. Trasferire gli ovociti enucleated a terreno di HCZB sulla camera di fusione di cella usando la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); posto 4 µ l di ciascuna soluzione (mezzo HCZB che contiene 6% -BSA per le cellule erogarici, soluzione HVJ-E, HCZB medio, 9% PVP in mezzo HCZB) e coprire la camera con circa 1 mL di olio minerale. Nota: Il numero appropriato di enucleated ovociti che vengono trasferiti alla camera per manipolazione durante una procedura di fusione delle cellule è da 5 a 30. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di fusione delle cellule. Invece di camera, una cover di 60 mm di Petri può essere utilizzata, se disponibile.</li>
		<li>Posizionare gli ovociti enucleated nel mezzo di HCZB sotto un microscopio a 400 X magnificationat temperatura. Aspirare le cellule del donatore con la pipetta di micromanipolazione (6-7 µm diametro interno estremità piatta in punta) e di espellere le cellule in soluzione di sospensione HVJ-E.</li>
		<li>Quindi aspirare le cellule del cumulo uno per uno con la soluzione di sospensione HVJ-E altrettanto essere separato da altro, consentendo la fusione cellulare seriale. Tenere gli ovociti enucleated medium HCZB facendo uso di una pipetta di supporto. Forare la zona pellucida con la pipetta di micromanipolazione con l'impulso di piezo (intensità di 3-6, velocità di 2-3).</li>
		<li>Dopo aver aperto il foro nella zona pellucida, mettere una cella di cumulus strettamente alla membrana dell'ovocita, insieme con la soluzione di sospensione HVJ-E con un volume di 5 volte il volume di una cella di cumulus, senza passare attraverso la membrana dell'ovocita. Nota: Preparare 6-7 punte di estremità piatta di µm di diametro interno di pipette di micromanipolazione per le cellule del cumulo. Pipette devono essere lavati regolarmente usando 9% PVP mezzo per mantenere il rilascio regolare delle cellule. 6.2.3 --passi-6.2.5 devono concludersi entro 10 min, o l'efficienza di fusione cellulare sarà inferiore. Attività di fusione della membrana di HVJ-E è inattivato in autoclave, trattamento con etanolo al 70%, o un detergente. Dopo l'esperimento, la soluzione di HVJ-E deve essere opportunamente smaltita.</li>
		<li>Dopo manipolazione di fusione cellulare, prontamente trasferire gli ovociti mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e spostare in un incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. attivazione del ricostruito ovociti e trattamento con tricostatina A e vitamina C
<ol><li>
Preparazione di TSA
	<ol>
<li>Pipettare 5 mM TSA soluzione in 3 aliquote µ l e conservare la soluzione a-20 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 µ l di soluzione madre di TSA di 5 mM a 1 mL di DMSO (a una concentrazione di 12,5 µM).</li>
		<li>Diluire 8 µ l di 12,5 µM TSA soluzione in 2 mL di attivazione medio e medio mKSOM (una concentrazione finale di 50 nM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di VC
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mg di VC in 1 mL di acqua sterile privo di endotossina e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di riserva di VC mKSOM medio (una concentrazione finale di 10 µ g/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Attivazione degli ovociti ricostruiti
	<ol>
<li>Un'ora dopo la fusione cellulare, controllare la condensazione prematura dei cromosomi (PCC) in ovociti ricostruiti (Figura 3B) utilizzando un microscopio (400 X).</li>
		<li>Trasferire gli ovociti ricostruiti al mezzo di attivazione (Vedi punto 1.3) contenenti TSA e incubare per 6 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 nell'aria (Figura 3). Osservare la formazione di pro-nuclei negli embrioni SCNT, quindi applicare 2 ore di trattamento TSA in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire gli embrioni trattati con TSA mKSOM supplementato con VC e incubare per 7 h, come illustrato nella Figura 3D.</li>
	<li>Dopo 7 h del trattamento VC, trasferire gli embrioni trattati con VC mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e incubare per 4 giorni a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 nell'aria. Nota: Per produrre topi clonati, trasferire gli embrioni morfologicamente normale fase 2-cell in ovidotti di topi femminili pseudo-incinto (MCH(ICR)) il giorno quando un plug vaginale viene trovato (giorno 0,5 di pseudogravidanza)15. Dopo 19,5 giorni, il numero di siti di impianto ed i neonati è registrato dopo la sezione cesarean.</li>
</ol>

<ol><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+cloned+mice+by+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer.</a> Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).</li>
<li>Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+mice+after+nuclear+transfer+by+electrofusion+using+tail+tip+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells.</a> Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).</li>
<li>Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+mice+from+fetal+fibroblast+cells+arrested+at+metaphase+by+a+serial+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+following+somatic+cell+nuclear+transfer+impeded+by+persisting+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.</a> Cell. 159 (4), 884-895 (2014).</li>
<li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).</li>
<li>Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+acetylation+in+reprogramming+of+somatic+nuclei+following+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+trichostatin+A+on+chromatin+remodeling%2C+histone+modifications%2C+DNA+replication%2C+and+transcriptional+activity+in+cloned+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos.</a> Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methylation+is+a+barrier+during+somatic+cell+reprogramming+into+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs.</a> Nat Genet. 45, 34-42 (2013).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+in+vitro+and+in+vivo+development+of+porcine+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos.</a> Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).</li>
<li>Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracytoplasmic+injection+of+deionized+bovine+serum+albumin+immediately+after+somatic+cell+nuclear+transfer+enhances+full-term+development+of+cloned+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos.</a> J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+towards+totipotency+is+greatly+facilitated+by+synergistic+effects+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules.</a> Biol Open. 6, 415-424 (2017).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/mmouse4p.htm">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).</li>
<li>Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+effect+of+partial+zona-pellucida+dissection+on+the+in+vitro+fertilizing+capacity+of+cryopreserved+C57BL%2F6J+transgenic+mouse+spermatozoa+of+low+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility.</a> Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).</li>
<li>Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+male+mice+from+adult+tail-tip+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of male mice from adult tail-tip cells.</a> Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).</li>
<li>Ogura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+male+cloned+mice+from+fresh%2C+cultured%2C+and+cryopreserved+immature+sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells.</a> Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).</li>
<li>Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+cloned+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mice cloned from embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).</li>
<li>Tachibana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+gene+replacement+in+primate+offspring+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells.</a> Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oocytes+reprogram+adult+somatic+nuclei+of+a+type+1+diabetic+to+diploid+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells.</a> Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).</li>
<li>Mizutani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cloned+mice+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cell+lines+from+urine-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells.</a> Sci Rep. 6, 1-8 (2016).</li>
<li>Kaminuma, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyper-reactive+cloned+mice+generated+by+direct+nuclear+transfer+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells.</a> EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).</li>
<li>Terashita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latrunculin+A+can+improve+the+birth+rate+of+cloned+mice+and+simplify+the+nuclear+transfer+protocol+by+gently+inhibiting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization.</a> Biol Reprod. 86 (6), 180(2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+improve+in+vitro+and+in+vivo+developmental+competence+of+somatic+cell+nuclear+transfer+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).</li>
<li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichostatin+A+%28TSA%29+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos%2C+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li>
<li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In conclusione, questi risultati indicano che il metodo presentato SCNT potrebbe ridurre le difficoltà tecniche e aumentare l'efficienza del SCNT senza richiedere modificazioni genetiche ed il completamento di mRNA (tabella 1, tabella 2) e garantire produzione stabile di embrioni clonati. Questo metodo ci consente di ricostruire più embrioni SCNT rispetto ai metodi convenzionali a causa della migliore tasso di sopravvivenza e protocollo semplificato. In questo protocollo, un passaggio fondamentale è la fusione cellulare. Per produrre con successo clonati topi, è fondamentale per garantire che la quantità adeguata di HVJ-E descritto nel protocollo viene mantenuta durante il processo di fusione delle cellule e gli ovociti devono essere restituiti nell'incubatore entro 10 min durante i passaggi 6.2.3 - 6.2.5. Poiché le cellule erogarici di 20-30 possono essere aspirate insieme HVJ-E contemporaneamente nella pipetta di manipolazione, il numero di ovociti ottenuti con una sola operazione è maggiore di quella del metodo esistente. Alla fine, possiamo produrre ovociti ricostruiti circa 20-30 entro 10 min. Anche quando si lavora con una grande serie di ovociti (100 o più), la procedura di fusione delle cellule dovrebbe prendere un'ora o meno ripetendo i passaggi 6.2.3 - 6.2.5. Il metodo e le tecniche qui presentate possono servire come efficienti protocolli con requisiti tecnici semplificati.
Attualmente, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo degli embrioni SCNT sono ancora poco chiari. Questo metodo SCNT migliorato contribuisce anche allo studio di tali meccanismi di riprogrammazione, dato che questo metodo può produrre molti embrioni clonati in un solo esperimento. Questo metodo utilizza cellule somatiche con le membrane delle cellule intatte per fusione cellulare. Quindi, sarebbe possibile applicare questo approccio ad altre cellule come cellule punta coda16,17di cellule di sertoli e cellule staminali embrionali (ES)18. Quando vengono utilizzati i metodi convenzionali di SCNT per l'iniezione di cellule relativamente grandi, come le cellule di punta coda, direttamente nel citoplasma dell'ovocita, diventa anche più tecnicamente impegnativo ottenere embrioni dal vivo. Inoltre, cellule relativamente dure, come cellule di sertoli, sono difficili da rompere pipettando per via parenterale. Quando si considerano questi vari tipi di cellule, il metodo di fusione delle celle che utilizzano HVJ-È semplice ed efficace. Anche se il valore e la sicurezza di HVJ-E sono stati dimostrati in modo convincente19,20, potrebbe essere importante per ri-considerare la possibilità di usando HVJ-E per la produzione di animali clonati per scopi agricoli o biomedicali.
Inoltre, recentemente un gruppo prodotto con successo clonati topi derivati da urina cellule21. Per salvare la specie di mammiferi in via di estinzione, d'ora in poi SCNT usando le cellule raccolte in maniera non invasiva, ad esempio la cella di urina, sarà ideale. Più recentemente, un altro gruppo ha direttamente generato topi clonati utilizzando antigene-specifici CD4 cellule+ T22. Sarebbe interessante esaminare se questo metodo è applicabile per clonare in modo efficiente i topi da tali cellule. Inoltre, Latrunculina A è stato segnalato come un'alternativa migliore per inibire la polimerizzazione dell'actina durante l'enucleazione e partenogenetico attivazione di SCNT ovociti23. Lo studio futuro può rivelare se il trattamento di Latrunculina A, invece di citocalasina B, migliora ulteriormente la generazione della prole clonato. Inoltre, il trattamento di TSA è stato utilizzato con successo nei topi, maiali24e conigli25 modificando la concentrazione, periodo e durata del trattamento. Inoltre, il VC non solo migliora lo sviluppo embrionale nella specie suina SCNT10, ma migliora anche la produzione di cellule iPS in esseri umani e topi26. Pertanto, è plausibile a speculare che la TSA e VC trattamento può essere applicato anche ad altre specie di mammiferi, e potremmo dover ottimizzare i tempi di trattamento della TSA e VC per ciascuna specie.
In conclusione, questo metodo renderebbe possibile generare topi clonati con un pratico livello di efficienza con procedure semplici. Di conseguenza, i risultati di questo studio potrebbero condurci a utilizzare la tecnologia SCNT per preservare le risorse genetiche degli animali rari e per comprendere i meccanismi molecolari della riprogrammazione nucleare e lo sviluppo embrionale precoce.

La tecnologia SCNT consente la produzione di animali clonati utilizzando solo una cellula somatica o un nucleo di essere trasferito a un ovocita enucleated. Uno degli scopi della tecnica SCNT è la derivazione di linee di cellule staminali embrionali (NT-ESCs) trasferimento nucleare da embrioni clonati. Nel 1998, Wakayama et al., segnalati producendo un mouse con successo clonato denominato Cumulina per la prima volta1. Da allora, la clonazione dei topi è stata ampiamente studiata, e molti importanti intuizioni riprogrammazione nucleare dei nuclei somatici sono stati ottenuti. D'altra parte, questa tecnica è accompagnata da numerosi passaggi di micromanipolazione che sono piuttosto difficili da Maestro, che richiedono una formazione intensiva di più di 3 mesi2.
Produzione di topi clonati utilizzando SCNT si è evoluta dal originale Honolulu metodo1, il metodo di elettrofusione3, per il metodo di fusione cellulare da virus Hemagglutinating del Giappone (HVJ)4. Tuttavia, l'iniezione diretta di un nucleo cellulare attraverso la cytomembrane tende a compromettere la sopravvivenza degli ovociti. L'elettrofusione è basso in termini di efficienza, poiché ogni membrana cellulare ha durezza differente, che lo rende difficile determinare una condizione ottima. La gestione di HVJ è laboriosa poiché richiede attrezzature specifiche per la sicurezza di ricercatori e di animali da laboratorio. Recentemente, per fondere il citoplasma delle cellule e degli ovociti di donatori, HVJ-E è stato usato5. HVJ-E ha solo la capacità di fondere le membrane senza la capacità proliferativa o infettiva del virus. RNA genomico di HVJ sono completamente inattivato in HVJ-E. L'utilizzo di HVJ-E supporta così facile movimentazione della fusione cellulare durante SCNT.
Parecchi rapporti hanno indicato che il trattamento degli embrioni SCNT con TSA, un inibitore delle deacetilasi istoniche, migliora notevolmente l'efficienza di produzione di cuccioli dal vivo da meno di 1% al 6,5%6,7. Trattamento di TSA accelera riprogrammazione tramite modifica dell'istone marchi SCNT embrioni8. Recentemente, l'iniezione di particolare mRNA, sottofamiglia Istone lisina demetilasi 4 (KDM4), che rimuovere lisina istone H3 9 (H3K9) trimethylation in embrioni SCNT, soprattutto alle regioni riprogrammazione-resistente, è stato indicato per aumentare lo sviluppo di clonato embrioni di topo9. Nel frattempo, VC, che serve anche come un modificatore di istone, ha diminuito trimethylation di H3K910. Inoltre, VC migliora lo sviluppo embrionale nella specie suina SCNT10. È stato segnalato che l'iniezione di dBSA negli embrioni SCNT conduce al miglioramento di sviluppo embrionale11.
Precedentemente abbiamo trovato che la combinazione di piccole molecole, vale a dire TSA e VC, insieme a dBSA, migliorato drammaticamente sviluppo del SCNT embrioni12. Qui, abbiamo dettaglio il metodo SCNT precedentemente segnalato per topi, che rappresenta a procedure altamente efficiente e semplice clonazione12. Descriviamo anche la manipolazione di HVJ-E. Questi potrebbe aiutare molti ricercatori nel campo della biologia riproduttiva e dello sviluppo di preservare risorse genetiche o di produrre animali geneticamente modificati attraverso questo metodo SCNT.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>28-2270-5</td><td>Per</td></tr><tr><td>KCl</td> medio <td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-03542</td><td>Per KH</td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>165-04242</td><td>Per</td></tr><tr><td>MgSO4 e middot; 7H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>137-00402</td><td>Per</td></tr><tr><td>CaCl2 e middot; 2H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00431</td><td>Per il medio</td></tr><tr><td>D (+)-glucosio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td>Per medio</td></tr><tr><td>Piruvato di Sodio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-03062</td><td>Per</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td> media <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>G3126</td><td>Per</td></tr><tr><td>medio Polivinilpirrolidone</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>168-17042</td><td>Per</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31213-15</td><td>Per</td></tr><tr><td>il DL-Lattato di sodio</td> medio <td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31605-72</td><td>Per la</td></tr><tr><td>penicillina</td> media <td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222637671 (GTIN-13)</td><td>Per</td></tr><tr><td>la streptomicina</td> media <td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222665643 (GTIN-13)</td><td>Per</td></tr><tr><td>acqua sterile media, priva di endotossine</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-15645</td><td>Per</td></tr><tr><td>EDTA medio e middot; 2Na</td><td>Dojindo Lab.</td><td>345-01865</td><td>Per</td></tr><tr><td>rosso fenolo</td> medio <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P0290</td><td>Per</td></tr><tr><td>sale sodico HEPES</td> medio <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3784</td><td>Per</td></tr><tr><td>alcool polivinilico</td> medio <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P8136</td><td>Per</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td> media <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A3311</td><td>Per resina</td></tr><tr><td>media BT AG 501-X8 (D)</td><td>Bio-Rad Lab., Inc.</td><td>143-7425</td><td>Per la preparazione di dBSA</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3506</td><td>Per la raccolta di ovociti e cellule cumuliformi</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>034-17554</td><td>Per l'enucleazione e l'attivazione degli ovociti</td></tr><tr><td>Micro manipolatore piezoelettrico</td><td>Prime tech, Co., Ltd.</td><td>PMM-150FU</td><td>Per micromanipolazione</td></tr><tr><td>HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF</td><td>Ishihara sangyo kaisha, Ltd.</td><td>CF001</td><td>Contiene 0,5 mL di soluzione di sospensione HVJ-E e 10 mL di tampone di fusione cellulare per la fusione cellulare</td></tr><tr><td>SrCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>193-09442</td><td>Per l'attivazione degli ovociti</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>E8145</td><td>Per l'attivazione degli ovociti</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>045-24511</td><td>Per il solvente</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>T1952</td><td>Per l'incubazione con embrioni SCNT</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A5960</td><td>Per l'incubazione con embrioni SCNT</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>M8410</td><td>Per mezzo di copertura</td></tr></tbody></table>

trattamento combinatorio di tricostatina a e la vitamina c migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) offre un'opportunità unica per produrre direttamente un animale clonato da una cellula donatrice, e richiede l'utilizzo di tecniche abili. Inoltre, le efficienze di clonazione sono rimasti basse poiché il successo della produzione di animali clonati, soprattutto topi. Ci sono stati molti tentativi per migliorare l'efficienza di clonazione e tricostatina A (TSA), un inibitore delle deacetilasi istoniche, è stato ampiamente utilizzato per migliorare l'efficienza di clonazione. Qui, segnaliamo un metodo di clonazione notevolmente migliorato nei topi. Questo metodo di trasferimento nucleare del somatocita comporta l'utilizzo del virus Hemagglutinating del Giappone busta (HVJ-E), che consente la facile manipolazione. Inoltre, il trattamento utilizzando due piccole molecole, TSA e vitamina C (VC), con l'albumina di siero bovino deionizzata (dBSA), è altamente efficace per lo sviluppo embrionale. Questo approccio richiede ulteriori iniezione né manipolazione genetica e presenta dunque un metodo semplice, adatto per l'uso pratico. Questo metodo potrebbe diventare un approccio tecnicamente fattibile per i ricercatori per la produzione di animali geneticamente modificati da cellule coltivate. Inoltre, potrebbe essere un modo utile per il soccorso di animali in via di estinzione tramite clonazione.

Per produrre embrioni clonati del mouse, le cellule del cumulo e fibroblasti fetali sono stati usati. Il numero di ovociti ricostruiti e sviluppo alla fase 2 celle dopo l'attivazione dell'ovocita è riportato nella tabella 1. Un tasso molto alto di formazione pronuclei (89-100%) e lo sviluppo alla fase 2 celle (77-89%) sono stati osservati in tutte le condizioni. Alcuni degli embrioni clonati, che sono stati derivati dalle cellule cumulus e sviluppati alla fase 2 celle, furono trasferite a ovidotti delle pseudo-gravidanze. Sei clonati prole fuori 72 embrioni trasferiti erano prodotte da tre femmine gravide dal trattamento seriale di TSA e VC (Figura 4). Circa il 15% degli embrioni clonati sono stati segnalati per svilupparsi a termine seguendo questo SCNT procedure12. Inoltre, il trasferimento degli embrioni clonati 2 celle alle altre istituzioni ha raggiunto piccoli vivi 9 al 15%, che rappresenta il migliore sviluppo rispetto al singolo trattamento di TSA su embrioni clonati. Inoltre, il trattamento con TSA e VC ha migliorato significativamente l'efficienza dello sviluppo embrionale in vitro alla fase blastocisti (tabella 2, P &lt; 0.05, test t di Student). Questi dati di inerente allo sviluppo in vitro dimostrano che l'effetto positivo della TSA e VC è limitato da diversi ceppi di topi né da tipi di cellule. Questi risultati indicano che questo metodo SCNT facilita la capacità di sviluppo degli embrioni clonati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg"> Figura 1: Preparazione di dBSA. Procedure dettagliate per la preparazione di soluzione dBSA sono raffigurate. Nella misura di scambio ionico può essere giudicata dal cambiamento di colore delle perle. Mostra la figura di sinistra superiore che 1,2 g di BSA è disciolto in 10 mL di acqua sterile a temperatura ambiente. Dopo BSA è dissolto, le perle di resina di scambio ionico vengono aggiunti (alto a destra). Quando la miscela di soluzione di BSA con perle di resina di scambio ionico cambia colore dal blu-verde all'oro (basso a destra), sostituire le perline con quelli freschi. La figura in basso a sinistra mostra che rimane il colore delle perle blu-verde, e scambio ionico è finito. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg"> Figura 2: Procedure di enucleazione. (A) un'illustrazione della camera enucleazione. Enucleation di ovociti è effettuato nel medio HCZB con CB. Per il sistema di azionamento piezo, un posto di mezzo PVP 9% viene utilizzato per preparare la pipetta di vetro per enucleazione. Macchie sono coperti da olio minerale. (B) un diagramma e un Micrografo mostrare la posizione dei mandrini e cromosomi prima enucleazione. Punte di freccia di nero: i mandrini e cromosomi. Punte di freccia rosse: il primo corpo polare. Diagramma (C) A e un Micrografo mostrare successo enucleazione. Punte di freccia di nero: i mandrini e cromosomi. Punta di freccia rossa: il primo corpo polare. Freccia blu: il foro nella zona pellucida. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg"> Figura 3: Procedure di fusione di cella e condizione degli embrioni SCNT della coltura. (A) un'illustrazione della camera di fusione delle cellule. Fusione cellulare avviene nel mezzo di HCZB che contiene 6% dBSA. Un posto di mezzo PVP 9% è utilizzato per preparare la pipetta di vetro per fusione cellulare. Macchie sono coperti da olio minerale. (B) un diagramma e un Micrografo della condensazione prematura dei cromosomi formata un'ora dopo la fusione delle cellule (freccia nera). Diagramma (C) A e un Micrografo della struttura pronuclei formati sei ore dopo l'attivazione (frecce nere). (D) sistema del trattamento TSA, VC e dBSA per gli embrioni SCNT. Freccia verde rappresenta il trattamento con TSA, seguita da incubazione con VC (freccia gialla) sotto mKSOM mezzo contenente con 0,3% dBSA (freccia blu). Le frecce indicano i tempi per il cambio medio. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg"> Figura 4: Prole clonati derivati da cellule del cumulo solo dopo taglio cesareo dopo 19,5 giorni di gravidanza. Esistono abruptio nella fila superiore. La prole clonata mostrata qui sono stata generata in uno esperimento di trasferimento nucleare da tre madri affidatarie. La placenta era 1,5 a 2 volte più grande della dimensione di quelle prodotte da fecondazione in vitro . <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gruppo</td>
			<td>Tipo di cellule del donatore</td>
			<td colspan="2">Razza del topo</td>
			<td>Lol di ovociti utilizzati</td>
			<td>Lol di ovociti fusa</td>
			<td>Lol di ovociti risultati condensazione prematura dei cromosomi</td>
			<td>Lol di ovociti risultati formazione pronuclei (%)</td>
			<td>Lol di ovociti pronuclei-formata che ha sviluppato agli embrioni 2 celle (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
<tr>
<td>non trattati</td>
			<td>Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>dei fibroblasti fetali</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
<tr>
<td>non trattati</td>
			<td>dei fibroblasti fetali</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: effetti del trattamento TSA e VC sulla in vitro sviluppo di embrioni di topo clonato per la fase 2-cell.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Gruppo</td>
			<td rowspan="2">Tipo di cellule del donatore</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Razza del topo</td>
			<td rowspan="2">Lol di embrioni di 2 celle utilizzati</td>
			<td colspan="3">Lol di 2 celle embrioni sviluppati per ogni fase (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-cella</td>
			<td>morula</td>
			<td>blastocisti</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) un
</td>
		</tr>
<tr>
<td>non trattati</td>
			<td>Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>dei fibroblasti fetali</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>non trattati</td>
			<td>dei fibroblasti fetali</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) d
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
a-b, c-d Gli apici differenti all'interno delle cellule del donatore stesso rappresentano le differenze significative (P &lt; 0,05)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: effetti del trattamento TSA e VC sulla in vitro sviluppo di embrioni di topo clonato alla fase blastocisti.

Descriviamo un metodo migliorato notevolmente per mouse clonazione usando tricostatina A, vitamina C e deionizzata albumina di siero bovino. Vi mostriamo un protocollo semplificato, riproducibile che supporta lo sviluppo efficiente di embrioni clonati. Quindi, questo metodo potrebbe diventare una procedura standardizzata per la clonazione del mouse.

Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di migliorare l'efficienza produttiva di embrioni ricostruiti e topi clonati utilizzando il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia di base, nella biologia dello sviluppo e nel salvataggio di animali in via di estinzione. Come lo sviluppo embrionale, la programmazione nucleare e la conservazione della ricerca genetica.Il vantaggio principale di questo metodo e di questa tecnica è che è possibile generare topi clonati con un livello pratico di efficienza con procedure semplici. Dopo aver preparato il terreno di coltura secondo il protocollo di testo, sciogliere 1,2 grammi di BSA in 10 ml di acqua sterile a temperatura ambiente. Aggiungere circa 0,12 grammi di perle di resina a scambio ionico misto alla soluzione BSA a temperatura ambiente mescolando delicatamente.Quando le perle cambiano colore da blu verde a oro, utilizzare una pipetta per recuperare la soluzione surnatante, quindi sostituire le perle con un lotto fresco. Dopo aver confermato che le perle fresche non cambiano colore, recuperare la soluzione. Quindi aggiungere 250 microlitri di bicarbonato di sodio al 10,5%.Utilizzando un filtro da 0,45 micron, sterilizzare il surnatante, quindi etichettarlo come soluzione madre DBSA e conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver eseguito l'eutanasia su topi femmina sottoposti a superovulazione secondo il protocollo di testo, ha utilizzato tecniche di dissezione standard per incidere l'addome per accedere al tratto riproduttivo. Usando piccole forbici e pinzette, estirpare gli ovidotti e trasferirli su un foglio di carta da filtro per rimuovere il sangue dalla superficie.Successivamente, immergere gli ovidotti in olio minerale, quindi utilizzare aghi da dissezione per tagliare l'ampolla dell'ovidotto e spostare i complessi di ovociti cumuliformi provenienti dall'ampolla in gocce da 200 microlitri di terreno HCZB con ialuronidasi allo 0,1%. Incubare il fazzoletto su una piastra riscaldante per cinque minuti. Sotto uno stereomicroscopio, confermare che le cellule del cumulo vengono rilasciate dai complessi ovocitari del cumulo, quindi trasferire gli ovociti del secondo stadio meiotico o della metafase M2 con alcune cellule del cumulo rimanenti al terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA.Lavare gli ovociti dello stadio M2 quattro volte pipettandoli su e giù nel terreno per staccare le cellule del cumulo rimanenti. Quindi incubare gli ovociti in terreno a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino all'enucleazione. Per isolare gli ovociti denudati dai complessi ovocitari del cumulo, al microscopio stereoscopico utilizzando una pipetta, trasferire un piccolo numero delle cellule del cumulo rimanenti disperse dai complessi ovocitari del cumulo al terreno HCZB con il 6% di DBSA.Posizionare le cellule del cumulo sulla piastra riscaldante a 37 gradi Celsius fino a quando non sono necessarie per il trasferimento nucleare delle cellule somatiche o SCNT. Dopo aver preparato il terreno PVP e le soluzioni madre CB secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta sterilizzata con 20 microlitri di terreno HCZB contenente cinque microgrammi per millilitro di CB per lavare gli ovociti dello stadio M2. Dopo aver ripetuto il lavaggio cinque volte, incubare gli ovociti in soluzione di enucleazione sulla piastra riscaldante per 10 minuti.Successivamente, preparare la camera di enucleazione, quindi utilizzare una pipetta per trasferire gli ovociti M2 nella camera. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di enucleazione e coprire la camera con olio minerale. Al microscopio a temperatura ambiente, identificare i fusi e i cromosomi dell'ovocita dello stadio M2.Quindi, utilizzando una pipetta di mantenimento e una micropipetta, orientare l'ovocita con un primo corpo polare pronunciato in modo che il posizionamento del fuso e del cromosoma sia alla posizione 3:00 o 9:00. Impostare l'intensità dell'impulso paizo da tre a sei e, utilizzando una pipetta di micromanipolazione, perforare la zona pellucida e praticare un foro in essa. Quindi con una quantità minima di citoplasma enucleare completamente i fusi e i cromosomi.Alla luce visibile, confermare l'assenza di cromosomi nel citoplasma, quindi con il terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA privo di CB, lavare accuratamente gli ovociti enucleati. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino alla fusione cellulare. Per preparare l'HBJE, aggiungere 260 microlitri di soluzione di sospensione HBJE ghiacciata all'HVJ-E liofilizzato e pipettare su e giù fino a completa sospensione.Preparare aliquote da cinque microlitri della soluzione e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino alla fusione cellulare. Per effettuare la fusione cellulare, utilizzare 20 microlitri di tampone di fusione cellulare per diluire cinque microlitri di soluzione HVJ-E. Mettere la soluzione HBJE diluita sul ghiaccio fino al momento dell'uso.Dopo aver preparato la camera di fusione cellulare come mostrato qui, utilizzare una pipetta per trasferire gli ovociti enucleati nel terreno HCZB nella camera. Aggiungere quattro microlitri di ciascuna soluzione come mostrato e utilizzare circa un millilitro di olio minerale per coprire la camera. Posizionare la camera con gli ovociti enucleati a temperatura ambiente al microscopio con ingrandimento 400x.Quindi, utilizzando la pipetta di micromanipolazione, trasferire le cellule del donatore nella soluzione di sospensione HVJ-E. Aspirare le cellule del cumulo una per una per separarle equamente l'una dall'altra, consentendo la fusione seriale delle cellule. Quindi, con una pipetta di mantenimento, mantenere gli ovociti enucleati nel terreno HCZB e utilizzare l'impulso paizo con la pipetta di micromanipolazione per perforare la zona pellucida.Dopo aver aperto il foro nella zona pellucida, pipettare una cellula cumuliforme con circa cinque volte il volume della soluzione di HVJ-E ed espellerla ermeticamente nella membrana dell'ovocita senza passare attraverso la membrana. Dopo la manipolazione della fusione cellulare, trasferire prontamente gli ovociti in un terreno MKSOM contenente lo 0,3% di DBSA e spostarli in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora. Le fasi di elaborazione devono essere completate entro 10 minuti dal posizionamento degli ovociti enucleati nel terreno HCVB al microscopio e al loro ritorno nell'incubatore.Dopo la fusione cellulare, al microscopio con ingrandimento 400x, verificare la presenza di condensazione cromosomica prematura negli ovociti ricostruiti. Trasferisci gli ovociti ricostruiti in un terreno di attivazione contenente tricostatina A, o TSA, e incubali a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica nell'aria per sei ore. Osservare la formazione di pronuclei negli embrioni SENT, quindi applicare altre due ore di trattamento TSA in terreno MKSOM con 0,3% di TBSA.Effettuare il trattamento con vitamina C secondo il protocollo di testo. Come si vede in questa tabella, il trattamento con TSA e vitamina C su ovociti di topi clonati ha mostrato un tasso molto elevato di formazione pronucleata e si è sviluppato fino allo stadio di due cellule in tutte le condizioni. Alcuni embrioni clonati, che sono stati derivati da cellule del cumulo e sviluppati fino allo stadio di due cellule, sono stati trasferiti in ovidotti di femmine pseudo gravide.Questa figura mostra sei progenie clonata che si è sviluppata su 72 embrioni trasferiti prodotti da tre femmine gravide mediante il trattamento seriale di TSA e vitamina C. Infine, come dimostrato qui, il trattamento con TSA e VC ha migliorato significativamente l'efficienza dello sviluppo embrionale in vitro fino allo stadio di blastocisti. Durante il tentativo di eseguire questa procedura è importante ricordare che tutti i terreni e i reagenti necessari sono preparati in anticipo. La procedura stessa, semplice da seguire e ben preparata, garantirà il raggiungimento dei risultati attesi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre ovociti ricostruiti.

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