Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di valutare e quantificare relativamente lo stravaso o la perdita di plasma negli organi di topi o altre specie di piccoli animali utilizzando un metodo Evans Blue Dye modificato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo vascolare, come ad esempio: quali fattori endogeni o esogeni modificano lo stravaso plasmatico in una specifica specie o organo di interesse? Il vantaggio principale di questa tecnica è che, sebbene il cateterismo richieda un modesto grado di competenza chirurgica, il metodo fornisce un accesso venoso duraturo ed è riproducibile da topo a topo.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della modesta difficoltà chirurgica del posizionamento del catetere. Dopo aver pesato un topo adulto FVB NJ di età compresa tra 16 e 20 settimane, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e radere l'area del collo ventrale dell'animale. Posizionare il mouse in posizione supina su un tampone preriscaldato e fissare tutte e quattro le zampe alla superficie chirurgica.

Applicare un unguento sugli occhi dell'animale per evitare che si secchi. Praticare un'incisione di un centimetro nel collo ventrale destro sopra la vena giugulare. Applicare una o due gocce di lidocaina all'1-2% sull'area dell'incisione per la gestione del dolore e per favorire la vasodilatazione.

Isolare la vena giugulare interna destra mediante dissezione smussata. Lega la vena con una sutura 4-0 e usa un emostatico per ritrarre delicatamente l'estremità rostrale del vaso. Usando le forbici sottili, praticare un foro di circa tre millimetri caudale alla sutura e circa a metà del diametro della vena.

Quindi, inserire un catetere in polivinile PV1 nella vena giugulare attraverso il foro e infilare il catetere a circa 1,5 centimetri verso l'estremità caudale del vaso. Utilizzare una nuova sutura 4-0 per legare saldamente il catetere all'interno della sezione caudale del vaso e legare la parte rostrale del vaso all'esterno del catetere con le estremità libere della sutura originariamente utilizzata per legare la vena giugulare rostrale. Fissare la pelle attorno al catetere con un altro pezzo di sutura 4-0 per prevenire la disidratazione, la perdita di calore corporeo e l'essiccazione dei tessuti.

Quindi, collegare il catetere a una siringa contenente soluzione salina eparinizzata e lavare il catetere con la soluzione salina. Per valutare lo stravaso e la fuoriuscita dall'organo di interesse, iniettare prima 50 microlitri di soluzione di Evans Blue nel catetere della vena giugulare, quindi un piccolo volume di soluzione salina eparinizzata per lavare la linea. Due minuti dopo, iniettare 100 microlitri di sostanza P nel catetere, seguiti da una seconda iniezione di soluzione fisiologica eparinizzata.

Diciotto minuti dopo l'iniezione della sostanza P, aprire la cavità toracica dell'animale e perfondere per gravità il cuore e i vasi sanguigni con 50 millilitri di soluzione di citrato di sodio da 50 millimolari per rimuovere l'eccesso di Evans Blue dall'interno dei vasi sanguigni. Prelevare gli organi e i tessuti di interesse e rimuovere eventuali contenuti residui per ciascun tessuto, se necessario. Sciacquare gli organi in PBS a temperatura ambiente, tamponare gli organi con una salvietta da laboratorio e tagliare ogni organo a metà.

Ottenere i pesi umidi di ogni metà dell'organo su una bilancia e asciugare 1/2 di ogni organo su un foglio di carta stagnola in un forno di essiccazione a 150 gradi Celsius per 48 ore. Quindi, posizionare l'altra metà di ciascun organo in un massimo di 200 microlitri di formamide in un tubo di microfuge per 48-72 ore per l'estrazione del colorante blu Evans. I topi knockout per neprilisina dimostrano un aumento dello stravaso plasmatico indotto dalla sostanza P dalla vescica urinaria rispetto agli animali selvatici, suggerendo un ruolo della neprilisina nella regolazione negativa dello stravaso plasmatico indotto dalla sostanza P dalla vescica.

trattamento con doxiciclina di topi transgenici per la sovraespressione di Neprilisina per una settimana per attivare la sovraespressione di Neprilisina indica un ruolo aggiuntivo per questo enzima nello stravaso duodenale poiché gli animali transgenici trattati con doxiciclina mostrano uno stravaso plasmatico indotto da sostanza P significativamente ridotto dal duodeno rispetto a tutti e tre i gruppi di animali che non è osservato dopo il trattamento con doxiciclina di animali wild type o knockout. Una volta padroneggiate, le fasi di cateterismo, iniezione e isolamento degli organi possono essere completate in 45-55 minuti se eseguite correttamente. Concedi altri due o tre giorni per il resto del protocollo.

Quando si impara per la prima volta questa tecnica, è importante ripetere la procedura in almeno 10-20 animali da allenamento prima di eseguire un esperimento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare e quantificare relativamente lo stravaso o la perdita di plasma negli organi di topi o altre piccole specie animali utilizzando questo metodo Evans Blue Dye modificato.