Name: Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Scopri il metodo del blu di Evans ottimizzato per valutare l'estravasazione plasmatica nei topi FVB NJ. Questa tecnica riproducibile consente di studiare la permeabilità vascolare in vari organi e specie animali.

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Gli autori desiderano ringraziare Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski per il loro prezioso aiuto e le modifiche apportate a questo manoscritto.  Sostenuta da sovvenzioni ricevute dal cuore nazionale, polmone e Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 e HL095439 RO3) e il dipartimento degli affari dei veterani (recensione di merito).

Tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali (topi) sono state seguite negli esperimenti descritti in questo manoscritto.
Questo metodo utilizza topi adulti FVBN, età compresa tra 16-20 settimane, trovato per essere ottimale per gli scopi di questo studio. Giorno 1 include i passaggi 1-5 e 2 giorni include i passaggi 6-7 (Figura 1).
1. preparazione del materiale
<ol><li>Garantire un'adeguata disponibilità di siringhe sterili, monouso e aghi, se chetamina/xilazina è usato come anestetico (come consigliato). Se isoflurane è usata come anestetico, controllare la bombola dell'ossigeno e il livello del liquido di isoflurane per assicurarsi che non ci sono rifornimenti sufficienti per l'esperimento prima di iniziare. Inoltre, montare la punta conica circuiti respiratori e allegarli alla casella di induzione; fissare nuovi contenitori del carbone di legna per i circuiti di respirazione. Preparare la casella induzione attivando l'ossigeno e accertare che la seconda fase legge circa 50 psi.</li>
	<li>Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare la sonda di temperatura rettale per la chirurgia.</li>
</ol>2. preparazione di Mouse
Questo passaggio include l'anestesia, depilazione e posizionamento (adulto FVBN topi-età 16-20 settimane).
<ol><li>Pesare i topi e registrare i pesi.</li>
	<li>Anestetizzare i topi.<ol>
<li>Amministrare la ketamina e xilazina IP (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, rispettivamente). Tuttavia, si raccomanda di iniziare con basse dosi di ketamina e xilazina (circa 30 mg/kg e 6 mg/kg, rispettivamente).</li>
		<li>Mantenere l'anestesia con circa 0,1 - 0,25 volte iniziale dosi di chetamina/xilazina durante l'intervento chirurgico. Ketamina e xilazina erano degli agenti anestetici di scelta in questo studio particolare, come maggiore riproducibilità e capacità di sopravvivenza sono stati osservati. Degli agenti anestetici di scelta in altri studi possono essere trovati per essere diversi.  Se viene utilizzato l'isoflurano, mettere il mouse in un'aula di induzione e accendere isoflurano al 5%, fino a quando il mouse perde coscienza completa. Quindi utilizzare un musetto nasale fissato a isoflurane 1.5-2.5% per tutto il resto della procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorare i topi ogni 2-3 min di pizzico di punta per verificare la profondità appropriata dell'anestesia.</li>
	<li>Radere la zona ventrale del collo del mouse.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una posizione supina sul pad preriscaldato. Fissare le zampe e i piedi del mouse alla superficie chirurgico con nastro adesivo.</li>
	<li>Posto lacrime artificiali unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la chirurgia.</li>
</ol>3. chirurgici dettagli
<ol><li>Praticare un'incisione di 1 cm nel collo proprio ventrale sopra la vena giugulare.</li>
	<li>Applicare una o due gocce di lidocaina (1-2%) nell'area di incisione per la gestione del dolore e per promuovere la vasodilatazione. Attendere 2 minuti per la lidocaina effettive.</li>
	<li>Esporre e isolare la vena giugulare interna destra tramite dissezione smussa. Legare la vena con sutura 4-0 e retrarre delicatamente alla fine rostrale della nave con una pinza emostatica. Tagliare un buco, utilizzando forbici bene, circa 3 mm inferiore o caudale alla cravatta, circa a metà strada attraverso il diametro della vena.</li>
	<li>Contrassegnare un catetere polivinilico PV-1 1,5 cm dall'estremità e inserirla nella vena giugulare attraverso il foro utilizzando un dilatatore e infilare il catetere verso l'estremità caudale della nave, circa 1,5 cm.</li>
	<li>Legare il catetere in modo sicuro all'interno della parte caudale della nave (sotto il taglio), con seta 4-0. Legare la parte rostrale del vaso verso l'esterno del catetere con le estremità della sutura che è stata usata per legare la vena giugulare rostrale, al punto 3.3.</li>
	<li>Aderenza alla pelle senza bloccare di nuovo insieme intorno al catetere con seta 4-0 per aiutare a prevenire la perdita di calore corporeo ed essiccazione dei tessuti.</li>
	<li>Collegare il catetere ad una siringa contenente soluzione fisiologica eparinata (10 U/mL) e irrorare il catetere.</li>
</ol>4. iniezioni
<ol><li>Iniettare la soluzione di blu di Evans (50 µ l di una soluzione di 30 mg/mL in soluzione salina normale, unheparinized 0,9% o circa 50 mg/kg) il catetere giugulare, seguito da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea.</li>
	<li>2 min dopo, iniettare la sostanza P (100 μL di soluzione 0,3 μM in soluzione salina normale, unheparinized 0,9%, o 1 nmol/kg), seguita da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea. Sostanza P aumenta lo stravaso di proteine plasmatiche attraverso lo strato endoteliale; in questo protocollo, ordinariamente induce un aumento dei valori di stravaso di plasma di circa 1,5 volte, rendendo al plasma stravaso valori più facile da misurare.</li>
	<li>Attendere 18 min dopo la sostanza P viene iniettato. Durante questo periodo, il colorante blu di Evans sarà equilibrare e circolare.</li>
	<li>Terminare l'esperimento 18 min dopo l'iniezione della sostanza P (20 min dopo l'iniezione di blu di Evans) sacrificando il mouse con dislocazione cervicale. È probabile che il mouse può essere direttamente cervicale slogato, senza prima dare un'overdose di anestetico, come il mouse è probabilmente ancora ben anestetizzati dalla chirurgia. Tuttavia, se è necessario, una dose eccessiva del anestetici chetamina/xilazina, isoflurano o pentobarbital può essere concesse, seguita da dislocazione cervicale.</li>
</ol>5. isolamento degli organi
<ol><li>Tagliati la cavità toracica del mouse e gravità-irrorare (da un'altezza di circa 51 cm o 20") il cuore e vasi sanguigni con 50 mL di citrato di sodio di 50 mM, pH 3.5. pH 3.5 conserva presumibilmente associazione blu di Evans all'albumina.</li>
	<li>Asportare organi pertinenti 1-5 (tessuti) con un bisturi per dissezione (ad es. la vescica urinaria, rene, stomaco, fegato, pancreas, prossimale o distale del colon, ileo, duodeno, fianco pelle, orecchie, coda, cuore e polmoni) e per rimuovere qualsiasi residuo, se presenti.</li>
	<li>Sciacquare gli organi a temperatura ambiente (TA) tampone fosfato salino (PBS; 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4, 8,0 g di NaCl e 0,20 g di KCl in 1 L, pH 7.4).</li>
	<li>Asciugare gli organi con tessuto, tagliare ogni organo a metà e pesare ogni mezzo (bagnato pesi, in g).</li>
	<li>Asciughi uno metà del tessuto in un forno a 150 ° C, su pellicola, per 48 h.</li>
	<li>Posizionare l'altro tessuto metà in un volume costante (fino a 200 µ l) di formammide in una microfuge tube per 48 h (e fino a 72 h) per estrarre il blu di Evans.</li>
</ol>6. misurazione del tessuto OD
<ol><li>Rimuovere 50 µ l di Evans blue-infuso formammide (dopo incubazione di 48-72 h RT) dal tubo di microfuge e posto in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti in polistirolo. Fare attenzione a non trasferire i pezzi di tessuto insieme la formammide.</li>
	<li>Mettere 50 µ l di formamide nuovo, puro in ciascuno dei due pozzetti vuoti della piastra 96 pozzetti per gli spazii in bianco.</li>
	<li>Misurare e registrare il OD620 di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti su un lettore di piastra di assorbanza. 620 nm è la capacità di assorbimento max di blu di Evans.</li>
</ol>7. calcolo di stravaso di Plasma
<ol><li>Pesare il tessuto asciutto metà che è stata in forno per 48 h.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di peso peso umido/a secco per l'organo specifico di interesse da ogni mouse individuali, a partire con il peso bagnato di questo tessuto metà (ottenuti nel punto 5.4), diviso per il peso a secco di questo tessuto stesso mezzo (ottenuti in punto 7.1).</li>
	<li>Calcolare il peso a secco (in g) del tessuto metà in formammide dividendo il peso bagnato del tessuto metà prima di esso è stato disposto in formammide (ottenuta al passaggio 5.4) dall'umido: rapporto di peso a secco per l'organo specifico di interesse (calcolato al punto 7.2).</li>
	<li>Calcolare i valori di620 OD rettificato . A partire con il OD620 valore da ogni pozzetto sperimentale della piastra 96 pozzetti (contenente formammide blu-infuso di Evans da ogni tessuto, ottenuto nel passaggio 6.3), sottrarre il valore vuoto del620 OD ben (il OD620 valore medio di i due pozzi contenente formammide pura, preparata al punto 6.2, OD620 valori ottenuti nel passaggio 6.3) da ogni valore sperimentale.</li>
	<li>Calcolare il valore di stravaso di plasma dividendo il corretto OD620 (calcolato nel passaggio 7.4) per il peso a secco del tessuto metà in formammide (calcolato in punto 7.3). Le unità di stravaso di plasma sarà il peso a secco OD620/g.</li>
	<li>Analizzare i dati ed espressa come media ± SEM. statisticamente confrontare i gruppi di test t o analisi unidirezionale della varianza e test di multiplo-confronto di Scheffe (lycofs01.lycoming.edu), come appropriato.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come discusso in precedenza, lo studio di stravaso di plasma può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. Il riuscito uso del protocollo di stravaso di plasma (sopra), usando il colorante blu di Evans, è stato dimostrato nel manoscritto attuale. Anche se i dati riportati indietro l'ipotesi che la NEP può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma, questo è un obiettivo secondario attualmente, con l'obiettivo primario è di presenta...

Perdita vascolare negli organi si riferisce allo stravaso, o perdita del plasma sanguigno attraverso le lacune prodotta nell'endotelio di post capillare venule negli organi. Questo stravaso di plasma o aumento della permeabilità vascolare, che può derivare da qualche tipo di risposta infiammatoria, può avere gravi conseguenze. Quindi, è importante che questo fenomeno, le cause, modulatori e conseguenze, sono studiate e capite, e allo stesso modo, che gli investigatori hanno una buona strumenti e protocolli con cui per studiarli. Le lacune endoteliale possono essere prodotto tramite una serie di stimoli, ma solitamente sono prodotte dall'azione di neurotrasmettitori peptidici e/o neurochinine sugli endoteli. Uno dei principali mediatori naturali di questo processo, che si traduce nello stravaso aumentati del plasma, è il neuropeptide tachykinin undecapeptide, la sostanza P1.
Metodi per indagare e misurare la permeabilità vascolare o stravaso di plasma, che utilizzano la proprietà di albumina-associazione di colorante blu di Evans, sono stati sviluppati e di solito sono noti per la loro precisione, semplicità, economia, sicurezza e capacità di consentire la determinazione di stravaso di plasma dai tessuti diversi in una sola volta, se così desidera il2,3,4,5,6,7,8,9 . Questo protocollo di blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN utilizza tutti questi, ma aggiunge alcune importanti modifiche che lo rendono generalmente utile e adattabile per gli studi futuri, che coinvolge il laboratorio di medio che conduce o sarà condurre studi importanti dei fattori connessi con stravaso di plasma o permeabilità vascolare. In questo protocollo, la sostanza P è stato introdotto per i topi a 1 nmol/kg, che aumenta lo stravaso di plasma di 1,5 volte. Questo aumenta la sensibilità del protocollo, con conseguente risultati più facilmente osservabili e ottenibile. Altri fattori che influenzano la permeabilità, come vari altri peptidi, sostanze chimiche o alcune forme di lesione tossica, possono essere utilizzati o studiati da altri laboratori, come desiderato. Vena giugulare iniezioni sono utilizzate nel presente protocollo per introdurre il blu di Evans e sostanza P sistemica, che richiede un intervento chirurgico terminale. Tuttavia, vena giugulare iniezioni5,7,10, anche dopo un esame delle tecniche chirurgiche terminale necessarie, sono più facili da padroneggiare e portano alla produzione di risultati più coerenti rispetto altri iniezioni di venose, compresa la coda della vena iniezioni4,9. Anche se potrebbe essere possibile per il blu di Evans da consegnare tramite le iniezioni retro-orbitale del seno venoso, riferimenti nella letteratura non sono stati trovati che utilizzano questo metodo di consegna di blu di Evans. Tuttavia, per quanto riguarda le iniezioni di vena della coda, l'elevato grado di competenza e pratica riproducibile padroneggiare questa tecnica notevolmente limita l'impiego per successo iniezioni di blu di Evans. Al contrario, il metodo di iniezione della vena giugulare alternativo come descritto nel nostro protocollo, offre una soluzione tecnicamente ottenibile. Una procedura fondamentale per la perfusione delle vene del mouse, eseguita solo dopo il sacrificio del mouse irrorato di blu di Evans, rimuove l'eccesso di blu di Evans ed è stato standardizzato nel presente protocollo. Metodi precedentemente descritti di aspersione sono stati attentamente esaminati e modificati per ottenere la presente procedura. Altre modifiche descritte qui sono tutti ottimizzati, semplice e poco costoso.
Ci sono alcune importanti limitazioni del metodo del colorante blu di Evans. Ad esempio, bassa sensibilità a volte connessa con questo metodo potrebbe impedire alcuni ulteriore esame lordo di patologico ed istologico dei tessuti da animali iniettati blu di Evans. Tuttavia, queste e altre limitazioni hanno portato allo sviluppo di metodi alternativi e modelli che, comunque, ancora utilizzano il blu di Evans. La misurazione di blu di Evans di fluorescenza (piuttosto che di visual-gamma) spettroscopia può aumentare la sensibilità del metodo. Inoltre, microscopia di fluorescenza dei tessuti tinto di blu di Evans è stata sviluppata per consentire l'osservazione di perdita vascolare in più distinte posizioni11. Inoltre, corpo intero di imaging e la scansione di un animale vivo precedentemente iniettato con Evans blue12 consente di indagine delle concentrazioni di blu di Evans in modo continuo, piuttosto che ad uno specifico scelto tempo punto dell'esperimento. Tuttavia, questo metodo richiede la disponibilità di adeguate strutture di imaging e può essere molto costoso. Modifiche che coinvolgono Evans blu e si è esibito in un tipo in vitro di modello, come in una cella cultura o pulcino chorioallantoic modello13 (CAM) inoltre sono stati descritti. Questi modelli sono monitorati da fluorescenza e microscopia intravital14 e consentono la quantificazione dei cambiamenti di permeabilità vascolare nel corso del tempo, ma possono sollevare questioni per quanto riguarda la modellazione accurata delle condizioni in vivo e possono anche essere costoso.
Ci sono stati altri metodi sviluppati per determinare e quantificare la perdita vascolare o permeabilità, che non comportano la somministrazione di blu di Evans. Questi metodi possono impiegare una molecola fluorescente appropriata (ad esempio l'albumina o fluoresceina), o una molecola con tag isotopicamente etichettata o altrimenti, agli animali vivi (o alla cella cultura o chorioallantoic (CAM) modelli13, seguita da non-invasivo Imaging (scansione PET, MRI, microscopia intravital, scansione di tutto il corpo) o di imaging invasivo (microscopia fluorescente)3,12,15. Anche se queste tecniche possono offrire un numero di vantaggi sopra altri Evans metodi blu, hanno anche gli svantaggi, che possono includere il loro notevole complessità, necessaria esperienza, risorse e costi monetari alti.
Neprilisina16 (peptidasi enzima NEP, noto anche come CD10, MME o Enkephalinase) è stata suggerita per essere coinvolti nell'inibizione dello stravaso di plasma, almeno in parte, attraverso il metabolismo enzimatico e inattivazione di endogeno sostanza p. Così, nei tessuti in cui si verifica la peptidasi di superficie delle cellule NEP, ci può essere un'attenuazione dell'effetto della sostanza P, presumibilmente dall'attività della peptidasi di NEP.
Inizialmente, abbiamo testato per lo stravaso di plasma indotta da sostanza P che utilizzano questo protocollo modificato di blu di Evans, con FVBN wild type (WT) e topi knockout (KO) NEP. Coinvolgimento di NEP nello stravaso di plasma sostanza P-aumentata è stata ritenuta sospetto da questi studi iniziali, e Descriviamo questi ed ulteriori esperimenti ruolo di NEP coinvolgendo nello stravaso di plasma. Tuttavia, il focus di questo manoscritto non è NEP o il suo ruolo nello stravaso di plasma, ma piuttosto lo stravaso di plasma esperimenti stessi. I risultati di NEP sono rappresentativi del tipo di risultati che possono essere ottenuti attraverso l'uso di questo protocollo modificato. Il metodo di blu di Evans per misurare lo stravaso di plasma è stato ottimizzato e modificato, come descritto in dettaglio qui di seguito per i topi FVBN.

<table><tbody><tr><td>isoflurano</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>ketamina anestetica per via inalatoria</td></tr><tr><td></td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>xilazina anestetica iniettabile</td></tr><tr><td></td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td> siringhe <td>per anestesia iniettabile</td></tr><tr><td>(10,3 e 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657 aghi 309659</td><td></td></tr><tr><td>(20G1,23G1 e 26G1/2)</td><td>Becton Camera di induzione dell'isoflurano Dickinson</td><td>305178, 305193 305111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>circuiti di respirazione a cono da 1 litro&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Roditore Circuito Controller 2</td></tr><tr><td>bombole di ossigeno</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% termoforo medicale</td></tr><tr><td></td><td>CWE Inc.</td><td>Regolatore di temperatura</td> <td>TC-1000</td></tr><tr><td>sonda di temperatura rettale</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td> bilancia <td>del mouse</td></tr><tr><td>(per roditori)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-forbici</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>15000-00</td><td>Vannas Forbici a molla lama dritta da 3 mm (vasi da taglio)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11151-10</td><td>Pinze extra fini Graefe (isolamento dei vasi del topo)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-emostatici Strumenti per le</td><td>scienze</td><td>13009-12</td><td>Emostatici per zanzare di Halstead (sezionare smussato, trattenere il tessuto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-driver per sutura</td><td>Strumenti</td> per le scienze <td>12502-12</td><td>Driver per sutura Olsen-Hegar (sutura)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Fine Strumenti scientifici</td><td>11627-12</td><td>Pinze a coccodrillo Adson-Brown (presa dei tessuti, sutura, ratto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-forbici Strumenti per le scienze</td><td>Fine</td><td>14110-15</td><td>Forbici per tagli duri Mayo 15 cm (chirurgia, dissezione, ossa, ratto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Strumenti</td> per le scienze <td>18025-10</td><td>pinze per legare le suture (utilizzate per il cateterismo Millar)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-forbici Strumenti per</td> le <td>scienze Fine 14078-10</td><td></td><td>Lexer Forbici per bambini dritte (chirurgia, topo)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Strumenti per</td> le scienze Fine <td>11254-20</td><td>Dumont #5 Pinze a punta fine (vasi per ratti, dissezione)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-forbici Strumenti per le scienze</td><td>Fine 14082-09</td><td></td><td>Forbici per dissettore 12 mm (chirurgia, topo di ratto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Strumenti per le scienze Fine</td><td>11051-10</td><td>Pinze Graefe da 10 cm (presa dei tessuti, topo di ratto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Strumenti per le scienze Fine</td><td>11251-35</td><td>Pinze Dumont 5/45 (introduttore per vasi)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-divaricatori Strumenti per</td> le <td>scienze Fini</td><td>17012-11</td><td>Divaricatori Weitlaner 2/3 denti (chirurgia dei ratti)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze Strumenti per le scienze</td><td>11294-00</td><td>Pinze Dumont #4 (ratti e topi per l'isolamento dei vasi)</td><td></td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td><td>Fine Strumenti scientifici</td><td>11297-00</td><td>Pinze Dumont #7 (presa dei tessuti, dissezione)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-forbici Strumenti per le scienze</td><td>Fine</td><td>14058-11</td><td>forbici per iride dal taglio duro (dissezione del topo, ossa)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze</td> Strumenti per le scienze <td>Fine 11009-13</td><td></td><td>pinza Semken seghettata e curva (presa dei tessuti, ratto del topo)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-emostatici Strumenti per le</td><td>scienze 13003-10</td><td></td><td>Emostatici curvi Hartman (smussato, sezionare, trattenere il tessuto)</td></tr><tr><td>strumenti chirurgici-pinze,</td><td>strumenti Fine Science</td><td>11006-12</td>, <td>pinza seghettata Adson (presa dei tessuti)</td></tr><tr><td>clipper,</td> nastro <td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>Fisherbrand</td>, <td>159015G</td><td></td></tr>, <tr><td>unguento lacrimale artificiale</td><td>Akorn, Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr>, <tr><td>lidocaina</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td></td></tr><tr><td>Cateteri in polivinile</td> iniettabili al 2% <td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Sostanza P</td><td>Bachem&nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>eparina</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>soluzione salina</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0,9% cloruro di sodio</td></tr><tr><td>fenobarbital&nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>citrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes per blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbilancia</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>provette per microfuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polistirene piastra a 96 pozzetti</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr> piastra di <tr><td>assorbanza lettore</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>gel di poliacrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>standard di peso molecolare delle proteine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran Protran supported nitrocellulosa</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>scatola di gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Fisher Anticorpo</td> policlonale NEP primario <td>Scientific S271-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>R & D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxiciclina chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ topi wild type</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secondario (capra anti-coniglio)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

blu di un evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Perdita vascolare, o lo stravaso di plasma, ha un certo numero di cause e può essere una conseguenza grave o sintomo di una risposta infiammatoria. Questo studio può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. È importante che i ricercatori hanno gli strumenti adeguati, tra cui i migliori metodi disponibili, per lo studio di stravaso di plasma. In questo articolo, descriviamo un protocollo, utilizzando il metodo di colorante blu di Evans, per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN. Questo protocollo è volutamente semplice, a come grande un grado possibile, ma fornisce dati di alta qualità. Blu di Evans è stato scelto principalmente perché è facile per il laboratorio di medio da utilizzare. Abbiamo utilizzato questo protocollo per fornire prove e supporto per l'ipotesi che l'enzima neprilisina può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato sperimentalmente e facilmente adattato per l'uso in altri ceppi di topi o in altre specie, in molti diversi organi o tessuti, per gli studi che possono coinvolgere altri fattori che sono importanti per comprendere, prevenire o curare stravaso di plasma. Questo protocollo è stato ampiamente ottimizzato e modificato da protocolli esistenti e combina affidabilità, facilità d'uso, economia e disponibilità generale di materiali e attrezzature, rendendo questo protocollo superiore per il laboratorio di medio da utilizzare in quantificare lo stravaso di plasma da organi.

Nella Figura 1, è indicato uno schema della procedura, che è stato trovato per causare i valori di stravaso di plasma indotta da sostanza P più affidabili e coerenti da organi dei topi FVBN. Questa procedura richiede solitamente due giorni di lavoro, separati da almeno 48 ore di tempo di attesa. È possibile diffondere ancora di più, se questa operazione viene eseguita costantemente per tutti gli esperimenti da confrontare. Ad esempio, dopo che gli organi sono...

In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di valutare e quantificare relativamente lo stravaso o la perdita di plasma negli organi di topi o altre specie di piccoli animali utilizzando un metodo Evans Blue Dye modificato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo vascolare, come ad esempio: quali fattori endogeni o esogeni modificano lo stravaso plasmatico in una specifica specie o organo di interesse? Il vantaggio principale di questa tecnica è che, sebbene il cateterismo richieda un modesto grado di competenza chirurgica, il metodo fornisce un accesso venoso duraturo ed è riproducibile da topo a topo.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della modesta difficoltà chirurgica del posizionamento del catetere. Dopo aver pesato un topo adulto FVB NJ di età compresa tra 16 e 20 settimane, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e radere l'area del collo ventrale dell'animale. Posizionare il mouse in posizione supina su un tampone preriscaldato e fissare tutte e quattro le zampe alla superficie chirurgica.Applicare un unguento sugli occhi dell'animale per evitare che si s

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Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

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