Name: In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Impara a valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica nei topi utilizzando traccianti fluorescenti. Questo metodo quantitativo combina fluorimetria e microscopia per studiare disfunzioni vascolari cerebrali.

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Gli autori desidera ringraziare Sphingonet consorzio finanziato dalla Fondazione Leduq per sostenere questo lavoro. Questo lavoro è stato anche sostenuto del Collaborative Research Center "differenziazione vascolare e rimodellamento" (CRC / Transregio23, progetto C1) e dalla 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programma GO-IN, no. 291776 finanziamenti. Riconosciamo ulteriormente Kathleen Sommer per la sua assistenza tecnica con i topi, manipolazione e genotipizzazione.

Tutti gli animali erano gestiti con la massima cura, riducendo al minimo dolore o fastidio durante la procedura. Questa procedura segue le linee guida di cura degli animali della nostra istituzione ed è stata approvata dal comitato locale (Regierungspraesidium Darmstadt, numero di omologazione FK/1044).
Uno schema delle fasi di lavoro per dosaggio di permeabilità in vivo in topi è illustrato nella Figura 1. I dettagli di ogni passaggio sono descritti di seguito.
1. animale movimentazione
<ol><li>
Preparazione e somministrazione di traccianti e anestetici
	<ol>
<li>Preparare provette e stampi per tessuto che almeno un giorno prima del dosaggio di permeabilità. Mantenere condizioni di sterilità in tutto il protocollo lavora sotto cappa pulita e utilizzando strumenti puliti con 80% di etanolo. Utilizzare il maschio o femmina wild-type (WT) o topi (GOF) CD1 di angiopoietina-2 (Ang-2) guadagno di funzione nel gruppo d'età adulto maturo di 3-6 mesi per il protocollo corrente. Eseguire la genotipizzazione dei topi come descritto in precedenza 10. Nota: 80% di alcol non si tradurrà in strumenti sterili ma riduce al minimo la contaminazione dei campioni preparati.</li>
		<li>Diluire tutti i traccianti in PBS sterile in scorte di 2 mM e conservare le aliquote al riparo dalla luce a-20 ° C.</li>
		<li>Scegliere elementi traccianti come (tetrametil rodamina) TMR e (isotiocianato di fluoresceina) FITC con spettri di eccitazione/emissione distinti e che sono lisina risolvibile con conseguente interferenza minima tra i coloranti da microscopia di fluorescenza (utilizzando il TMR o FITC filtrare rispettivamente) e dalla fluorometria in un lettore di piastre per il dosaggio di permeabilità. Nota: Destrano TMR 3 kD e destrano FITC 3 kD utilizzati nello studio sono entrambi lisina risolvibile e quindi potrebbe essere anche usato per la post-fissazione analisi di immunohistochemical con aldeidi al fine di indagare le differenze regionali.</li>
		<li>Gestire tutti gli animali con la massima cura seguendo le linee guida di assistenza istituzionale. Iniettare per via intraperitoneale ogni mouse con 100 µ l di soluzione di tracciante che può essere aumentata fino a 200 µ l quando un ulteriore elemento tracciante è combinato con 100 µ l di ciascun elemento tracciante in un mix 1:110,13. Iniettare almeno un animale con PBS da solo invece i traccianti per fungere da controllo sham per la sottrazione del background di autofluorescenza.</li>
		<li>5 min dopo l'iniezione dell'elemento tracciante, anestetizzare l'animale con un'iniezione dei. p di ketamina e xilazina (100 mg e 5-10 mg in 0,9% soluzione fisiologica per kg di peso rispettivamente, 150 µ l del cocktail per topo 25 g). Nota: Unguento Vet non è stato applicato sugli occhi durante la procedura di come il periodo tra anestesia animale e aspersione/sacrificio è stato breve (10 minuti) dove qualsiasi secchezza degli occhi non era osservata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aspersione di sangue raccolta e cardiaco
	<ol>
<li>Preparare gli animali per la perfusione cardiaca 10 min dopo la somministrazione di anestetico. Verificare l'assenza di risposta di contrazione di zampa al fine di garantire che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia.</li>
		<li>Posare gli animali sulla schiena e applicare 80% etanolo sulla pelle della zona addominale. Utilizzando le forbici piccole, aprire la parete addominale con una piccola incisione (2 cm) appena sotto la gabbia toracica. Separare il fegato dal diaframma e poi lentamente tagliare attraverso il diaframma esponendo la cavità pleurica 15.</li>
		<li>Tagliare la gabbia toracica bilateralmente e fissare lo sterno taglio al fine di esporre il ventricolo sinistro. Inserire un ago a farfalla 21-manometro collegato ad un sistema di perfusione peristaltica nel posteriore del ventricolo sinistro.</li>
		<li>L'atrio di destra di puntura e rapidamente (entro 10 s) raccogliere 200-300 µ l di sangue che viene rilasciato nella cavità di cassa utilizzando puntali per pipette da 1 mL (con taglio fine) in tubi di raccolta del siero e memorizzarlo sul ghiaccio. Nota: Questa procedura di perfusione è non-sopravvivenza.</li>
		<li>Non appena il sangue viene raccolto, accendere il sistema di perfusione (10-12 giri/min, 5 mL/min) e irrorare l'animale per 3 min con caldo (RT) 1x PBS (libero di Ca2 +ioni Mg2 + ). Nota: PBS contenente Ca2 +/Mg2 + ioni possono essere utilizzati per meglio attività cardiaca durante la perfusione. La quantità totale di PBS utilizzato per aspersione è nella gamma di 15-20 mL.</li>
		<li>Valutare la qualità di perfusione osservando il colore del fegato, i reni, che appaiono bianco/pale dopo aspersione. Nota: Aspersione del fegato o del rene non indicano necessariamente aspersione del cervello come le arterie (carotide/vertebrali) raggiungendo il cervello dall'aorta potrebbe avere rotto durante la preparazione nel passaggio 3 in particolare durante la puntura atriale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tessuto lavorazione
<ol><li>Organo di raccolta e conservazione
	<ol>
<li>Alla fine della perfusione, confermare la morte dell'animale di dislocazione cervicale e raccolto cervello e reni. Verificare di aspersione del cervello dal colore dei cervelli (nessun sangue visibile nei vasi delle meningi), in modo da escludere gli animali dall'analisi permeabilità quando aspersione qualità non è buona. Separare il cervello in 2 hemibrains usando un bisturi (Figura 1).</li>
		<li>Sezionare con un bisturi un hemibrain gratuito del lobi olfattivi e del cervelletto e trasferire la hemicerebrum in una provetta 2 mL. Conservare hemi-cervelletto in un tubo aggiuntivo se necessari per la valutazione della permeabilità cerebellare.</li>
		<li>Trasferire un singolo rene in un'altra provetta 2 mL. Conservare i campioni immediatamente il ghiaccio secco.</li>
		<li>Incorporare in temperatura di taglio ottimale del tessuto-tek (O.C.T) mescola il ghiaccio secco in modo nativo il restante rene e hemi-cervello (che comprende il cervelletto e lobi olfattivi).</li>
		<li>Alla fine, centrifugare i campioni di sangue conservati il ghiaccio nelle provette di raccolta del siero a 10, 000G, 10 min a 4 ° C. Trasferire i surnatanti di siero per provette da 1,5 mL e metterli nel contenitore di ghiaccio secco.</li>
		<li>Trasferire tutti i campioni raccolti su ghiaccio secco per congelatore a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Nota: È importante a congelare i campioni prima di procedere con i passaggi di omogeneizzazione come aumenti di efficienza di omogeneizzazione dopo come congelare lo scongelamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Omogeneizzazione e centrifugazione
	<ol>
<li>Scongelare il ghiaccio l'hemi-cervello e reni campioni congelati giù a-80 ° C e pesare le provette contenenti gli organi. Da questi pesi, sottrarre il valore medio di diversi tubi vuoti (circa 20) per ottenere il peso del tessuto. Aggiungere 300 µ l e 200 µ l di freddo 1 X PBS per le provette contenenti il rene e hemi-cervello, rispettivamente. Nota: per gli importi più bassi del tessuto (come hemi-cervelletto, inferiore a 100 mg) pesatura dei singoli tubi è raccomandato.</li>
		<li>Omogeneizzare ogni campione nella provetta eppendorf originale con un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE) collegato a un agitatore elettrico (1, 000rpm) eseguendo circa 15 colpi (1 colpo = 1 a e 1 giù). Il pestello con PBS tra campioni di risciacquare ed asciugare prima di procedere con l'esempio successivo. Nota: L'uso di detergenti durante l'omogeneizzazione è stata evitata a causa di possibili interferenze con fluorometria. Tuttavia, tracciante intracellulare viene anche rilevato in questo protocollo come il tessuto è accuratamente omogeneizzato, che è più efficiente dopo un round di congelamento scongelamento.</li>
		<li>Conservare i campioni omogeneizzati su ghiaccio protette dalla luce e centrifuga tutti insieme alla fine alle 15.000 g, 20 min, 4 ° C in una centrifuga da tavolo. Trasferire i surnatanti in un nuove provette da 1,5 mL sul ghiaccio per fluorimetria immediato o a-80 ° C per essere analizzati successivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione e misurazione di fluorescenza
	<ol>
<li>Se congelati alla fine del passaggio precedente, scongelare su ghiaccio i campioni di tessuto surnatante e siero conservati a-80 ° c li protegge dalla luce con la pellicola.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di siero diluito (30 µ l 1X PBS + 20 µ l di siero) o surnatanti di tessuto (come è) in una piastra 384 pozzetti nera. Includere almeno un campione da animale di falsità da surnatanti del siero e del tessuto garantire sottrazione sfondo corretto, come questo sfondo di omogenato di tessuto è normalmente superiore a quella di PBS usato come diluente. Nota: Una media di 3 animali sham utilizzabile per autofluorescenza anche se è stata osservata una variabilità molto poco nei valori di autofluorescenza sham (dati non mostrati). La quantità di siero utilizzato può essere ridotto diluendo con PBS, che può anche aumentare il rapporto segnale-rumore per campioni con bassa fluorescenza come i campioni di cervello. Fino a 10 µ l di siero è stato testato diluendola con 40 µ l PBS. Assicurarsi che nessun bolle sono presente nei pozzetti.</li>
		<li>Inserire la piastra 384 pozzetti nera nel lettore della piastra e aprire un nuovo script selezionando la misura della fluorescenza.</li>
		<li>Impostare il guadagno ottimale e utilizzare rispettivamente i valori di eccitazione/emissione (nm) di 550/580 o 490/520 per dyee TMR o FITC e avviare la misurazione per ottenere le unità di fluorescenza crudo (RFU).</li>
		<li>Utilizzare le unità di fluorescenza crudo (RFU) dal lettore di piastra per calcolare l'indice di permeabilità (PI) dopo avere sottratto i corrispondenti valori di sham.<ol>
<li>
* Indice di permeabilità (mL/g) = (Peso del tessuto tessuto RFU/g) / (siero RFU/mL di siero)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Esempio di calcolo per l'indice di permeabilità del cervello (PI) dell'animale GOF1 (tabella 1):<ol>
<li>GOF1 cervello RFU - SHAM cervello RFU = 154-22,5 = 131,5</li>
			<li>GOF1 siero RFU - siero SHAM RFU = 38305-27 = 38278</li>
			<li>Peso (g) del cervello = 0,195</li>
			<li>Volume del siero (ml) = 0,02</li>
			<li>Indice di permeabilità (10-3 mL/g) del cervello = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 Nota: Il calcolo di indici di permeabilità yield valori assoluti e comparabili tra esperimenti e tipi di tessuto. Questi, tuttavia, può essere presentati come rapporti per facilità di confronto tra i 2 gruppi di 12. Ciò può essere ottenuto dividendo il PI di ogni animale in entrambi i gruppi con il PI medio del gruppo di controllo, la media del gruppo di controllo attraverso 1 pur mantenendo la variazione animale inter nel gruppo di controllo di guida. Questa trasformazione fornisce i valori per il gruppo sperimentale (o gruppi) rispetto al gruppo di controllo impostato su 1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione di immunofluorescenza del tracciante
	<ol>
<li>Tagliare i blocchi di rene/hemi-cervello incorporati in modo nativo in tessuto-tek composto (O.C.T) (punto 2.1) in µm 10 sezioni su un criostato impostato a-20 ° C e trasferire le sezioni a diapositive disposto a temperatura ambiente. Una volta che le sezioni vengono essiccate (circa 30 min), trasferimento diapositive per congelatore a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Il giorno di macchiatura, scongelare le diapositive a 37 ° C per 10 min e poi fissare le sezioni con paraformaladehyde 4% (PFA) per 10 min a temperatura ambiente, seguita da rapido lavaggio in PBS.</li>
		<li>Incubare le sezioni nel tampone di permeabilizzazione/blocco di PBS sterile contenente BSA 1% e 0,5% Triton X-100 pH 7.5 per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare i vetrini per 1,5 h a temperatura ambiente con l'anticorpo primario CD31 (0,5 mg/ml, clonare MEC 13,3), diluito in 1: 100 in tampone PBS sterile, BSA 0,5%, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) seguita da tre min 5 lavaggi in PBS.</li>
		<li>Eseguire incubazione anticorpo secondario nel buffer di cui sopra per 1 h a temperatura ambiente con specie-specifica con l'etichetta fluorescente anticorpi diluiti 1: 500 (2 mg/mL). Per CD31, capra anti-topo Alexa 568 o Alexa 488 può essere utilizzato ad una diluizione di 1: 500. Sono DAPI (300 µM) nell'anticorpo secondario mescolare (1:1, 000 diluizione dallo stock) per macchiare per i nuclei.</li>
		<li>Montare le sezioni macchiate con aqua polymount e lasciarlo tutta la notte per polimerizzazione a temperatura ambiente buio.</li>
		<li>Acquisire immagini utilizzando un laser confocale imaging spettrale microscopio sistema di scansione. Analizza le immagini per software di NIS elements (versione 4.3). Software come Photoshop può essere utilizzato per la generazione di figure di montaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Disfunzione della barriera emato - encefalica è associata con una serie di disturbi neurologici, compreso i tumori cerebrali primari e secondari o ictus. Ripartizione BBB è spesso associata a edema CNS pericoloso. La delucidazione dei meccanismi molecolari che determinano l'apertura o chiusura della BBB è quindi di importanza terapeutica nelle malattie neurologiche e comunemente studiato dai ricercatori. Tuttavia, metodi per indagare BBB permeabilità in vivo segnalati nella letteratura, sono spesso associati con...

Emato - encefalica (BBB) è costituito da cellule endoteliali microvascolari (ECs) supportate da periciti strettamente associati (pz), che sono ensheathed nella lamina basale, e astrociti (ACs) che avvolgono la membrana dello scantinato con i piedi di fine1 ,2. ECs interagire con diversi tipi di cellule che supportano e regolano la funzione di barriera, principalmente ACs e PC, e anche i neuroni e microglia, che insieme formano l'unità neurovascolare (NVU). Il NVU è critico per la funzione della barriera emato-encefalica, che limita il trasporto di ematica tossine e agenti patogeni di entrare il cervello. Questa funzione è un risultato di molecole di giunzione stretta come claudin-5, occludina, zonula occludens-1, che sono presenti tra ECs e anche a causa dell'azione dei trasportatori come la p-glicoproteina (P-gp) che efflusso molecole che entrano l'endotelio nuovamente dentro il vaso lumen1,2,3. Il BBB tuttavia consente il trasporto di molecole essenziali quali sostanze nutritive (glucosio, ferro, aminoacidi) dai trasportatori specifici espressi sul CE membrane plasmatiche1,2,3. Il livello di CE è altamente polarizzato rispetto alla distribuzione dei vari trasportatori tra il luminal (esposto a sangue) e abluminal (cervello esposto membrane) per consentire il trasporto vettoriale e specifica funzione4,5 . Mentre la BBB è protettiva per quanto riguarda strettamente che regolano il milieu di CNS, è una sfida importante per la somministrazione di farmaci CNS in malattie come il Parkinson con un funzionale BBB. Anche in malattie neurologiche con disfunzione BBB, non si può presumere che la consegna di droga del cervello è aumentata in particolare come la disfunzione della barriera potrebbe includere i bersagli di trasportatore specifico ad esempio come nel morbo di Alzheimer (annuncio). D.c., parecchi trasportatori di amiloide beta quali LRP1, RAGE, P-gp sono noti per essere dysregulated e quindi targeting questi trasportatori potrebbe essere inutile6,7,8. La BBB è alterata in diverse malattie neurologiche come meningite da ictus, annuncio, sclerosi multipla e nel cervello tumori9,10,11. Ripristinare la funzione di barriera è una parte cruciale della strategia terapeutica e così la sua valutazione è fondamentale.
In questo lavoro, abbiamo descritto un'oggettiva e quantitativa protocollo per l'analisi permeabilità nei roditori che abbiamo applicato con successo a numerose linee di mouse entrambi malattia transgenici e sperimentale modelli10,12,13 ,14. Il metodo si basa su una semplice iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione dei topi per rimuovere gli elementi traccianti dal compartimento vascolare. Cervello e altri organi sono raccolti post aspersione e permeabilità valutati da un obiettivo e indice di permeabilità assoluta basata su misure di fluorescenza degli omogeneati del tessuto in un lettore di piastra. Tutti i valori di fluorescenza grezzi vengono corretti per lo sfondo utilizzando omogenati o siero da animali di falsità che non ricevono alcun elemento tracciante. Le normalizzazioni di ampio sono incluse per volume del siero, di fluorescenza del siero e il peso dei tessuti, producendo così l'indice di permeabilità che è assoluto e comparabili tra esperimenti e tipi di tessuto. Per facilità di confronto tra i gruppi, i valori di indice di permeabilità assoluta possono essere trasformati prontamente ai rapporti come abbiamo in precedenza avevamo effettuato12. Contemporaneamente, stored hemi-cervello ed il rene potrebbe essere utilizzate per la visualizzazione dell'elemento tracciante da microscopia di fluorescenza10. La microscopia di fluorescenza classico potrebbe essere preziosa nell'ottenere differenze regionali nella permeabilità seppur ingombrante a causa della selezione soggettiva di sezioni di tessuto e immagini per un'analisi semi-quantitativa. I passaggi dettagliati sono presentati nel protocollo e se del caso, vengono aggiunte note. Questo fornisce le informazioni necessarie per eseguire correttamente il dosaggio di permeabilità in vivo in topi che possono essere ridimensionati per altri piccoli animali. Il dosaggio può essere applicato a molti tipi di rivelatori permettendo per la carica e la dimensione ha basato la valutazione di permeabilità da una combinazione di traccianti con spettri di fluorescenza distinti.

<table><tbody><tr><td>destrano tetrametil rodamina (TMR) 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato di fluoresceina (FITC) destrano 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>ketamina (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xilazina (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,9% soluzione salina</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% soluzione di formaldeide</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>preparare una soluzione al 4%</td></tr><tr><td>di albumina sierica bovina, frazione V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ratto anti CD31 anticorpo, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>capra anti ratto alexa 568</td><td>sonde molecolari</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>capra anti ratto alexa 488</td><td>sonde molecolari</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sonde molecolari</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>ago a farfalla calibro 21</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>siero provetta per prelievi</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>provette eppendorf da 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Salviette di precisione Kimtech tergicristalli per tessuti</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>piastra nera a 384 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>vetrini superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>pestello in PTFE</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>agitatore elettrico ad asta</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>lettore di piastre</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocale Sistema di microscopio a scansione laser Sistema</td><td></td> di perfusione peristaltica Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Barriera emato - encefalica (BBB) è una barriera specializzata che protegge il microambiente del cervello dalle tossine e agenti patogeni nella circolazione e mantiene l'omeostasi del cervello. I siti principali della barriera sono cellule endoteliali dei capillari del cervello cui funzione barriera risultati da giunzioni intercellulari strette e trasportatori di efflusso espressi sulla membrana plasmatica. Questa funzione è regolata da periciti e astrociti che insieme formano l'unità neurovascolare (NVU). Parecchie malattie neurologiche come l'ictus, morbo di Alzheimer (annuncio), i tumori cerebrali sono associati con un'alterata funzione BBB. Valutazione della permeabilità BBB è quindi cruciale nella valutazione della gravità della malattia neurologica e il successo delle strategie di trattamento impiegato.
Presentiamo qui un semplice eppure analisi permeabilità robusto che sono state applicate con successo a diversi mouse modelli entrambi, genetica e sperimentale. Il metodo è altamente quantitativa e oggettiva rispetto l'analisi di fluorescenza di tracciante da microscopia che è comunemente applicata. In questo metodo, i topi sono iniettati intraperitonealmente con un mix di traccianti fluorescenti inerti acquosi seguita da anestetizzare i topi. Aspersione cardiaca degli animali viene eseguita prima della raccolta del cervello, i reni o altri organi. Gli organi sono omogeneizzati e centrifugati seguiti dalla misura di fluorescenza dal surnatante. Disegnata dalla puntura cardiaca appena prima l'aspersione del sangue serve per scopo di normalizzazione per il compartimento vascolare. La fluorescenza del tessuto è normalizzata per la fluorescenza del siero e peso bagnata per ottenere un quantitativo indice di permeabilità del tracciante. Per ulteriore conferma, controlaterale hemi-cervello conservato per immunohistochemistry può essere utilizzato per scopi di visualizzazione dell'elemento tracciante di fluorescenza.

Abbiamo recentemente dimostrato che l'angiopoietina-2 (Ang-2) guadagno di funzione (GOF) topi hanno maggiore permeabilità vascolare cerebrale rispetto ai topi di controllo in condizioni sane10. In topi indotti da ictus, è stato anche spettacoli che i topi GOF avevano dimensioni maggiori di infarto e una maggiore permeabilità rispetto i littermates di controllo. Questi risultati indicano un ruolo critico di Ang-2 nella permeabilità alle BBB. Il protocollo pertanto u...

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la permeabilità della vascolarizzazione cerebrale nei topi utilizzando traccianti marcati in fluorescenza per valutare la disfunzione della barriera emato-encefalica in modelli animali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della barriera emato-encefalica relative alla permeabilità neuro-vascolare nelle malattie e al suo recupero dopo la terapia. Il vantaggio principale di questo metodo è che è semplice e quantitativo.Offre la possibilità di valutare contemporaneamente la permeabilità mediante fluorimetria, che è quantitativa, e anche la microscopia a fluorescenza per le difese regionali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e alla terapia di diversi disturbi neurologici, tra cui i tumori cerebrali, l'ictus e il morbo di Alzheimer, perché queste malattie sono associate a un edema cerebrale pericoloso per la vita e al miglioramento della funzione BBD come obiettivo terapeutico chiave. A dimostrare parte della procedura sarà la signorina Jadranka Macas, responsabile della tecnologia scientifica presso l'istituto.Iniettare intraperitonealmente nei topi 100 microlitri di soluzione tracciante da due millimolari. Scegli traccianti fissabili con lisina, come il dextrans marcato con FITC e TMR con spettri di emissione di eccitazione distinti per un'interferenza minima tra i coloranti. Se si combinano traccianti, iniettare 200 microlitri di soluzione tracciante combinata per via intraperitoneale.Includere iniezioni solo su veicolo che fungano da controlli fittizi per la sottrazione di fondo in autofluorescenza. Dopo ogni iniezione, attendere cinque minuti prima di anestetizzare profondamente i topi secondo i protocolli istituzionali approvati. Preparare gli animali per la perfusione cardiaca 10 minuti dopo la somministrazione dell'anestetico.Controllare l'assenza di risposta alla contrazione della zampa per assicurarsi che il topo abbia raggiunto un piano chirurgico di anestesia. Appoggiare il topo da perfondere sulla schiena e applicare etanolo all'80% sulla pelle della zona addominale. Dopo aver usato piccole forbici per creare un'incisione di due centimetri nella parete addominale, separare il fegato dal diaframma, quindi tagliare lentamente il diaframma, esponendo la cavità plurale.Tagliare la gabbia toracica bilateralmente e fissare lo sterno tagliato per esporre il ventricolo sinistro. Inserire un ago a farfalla calibro 21 collegato a un sistema di perfusione peristaltica nella parte posteriore del ventricolo sinistro. Forare l'atrio destro e quindi utilizzare un puntale per pipetta da un millilitro con l'estremità tagliata per raccogliere rapidamente i 200-300 microlitri di sangue rilasciato e trasferirli in una provetta per la raccolta del siero.Conserva il sangue raccolto sul ghiaccio. Non appena il sangue viene raccolto, accendere il sistema di perfusione e perfondere l'animale per tre minuti con PBS privo di ioni di calcio e magnesio a temperatura ambiente. Valutare la qualità della perfusione notando il colore del fegato e dei reni, che appaiono pallidi dopo la perfusione.Dopo aver prelevato il cervello, verificare che non ci sia sangue visibile nei vasi delle meningi. Il campione deve essere escluso dall'analisi di permeabilità se la qualità della perfusione è scarsa. Usa un bisturi per separare il cervello in due emi-cervelli.Quindi sezionare il cervelletto e il lobo olfattivo da un emi-cervello e trasferire l'emi-cervello in un tubo da due millilitri. Metti un rene raccolto in un altro tubo da due millilitri. Posizionare immediatamente i campioni su ghiaccio secco.Incorporare nativamente il rene e l'emicervello rimanenti con il cervelletto e i lobi olfattivi intatti nel composto per la temperatura di taglio ottimale TissueTech e metterlo su ghiaccio secco. Infine, dopo aver centrifugato i campioni di sangue a 10.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire i surnatanti di siero in provette da 1,5 millilitri e metterli nel contenitore del ghiaccio secco. Trasferire i campioni nel congelatore a meno 80 gradi Celsius poiché l'efficienza di omogeneizzazione aumenta dopo il congelamento-scongelamento.Posizionare i campioni di emi-cervello e rene su ghiaccio per scongelarli, quindi pesare i tubi contenenti gli organi. Da questi pesi, sottrarre il valore medio di circa 20 provette vuote per ottenere il peso del tessuto. Aggiungere 300 microlitri di PBS freddo al tubo contenente il rene e 200 microlitri ai tubi contenenti l'emi-cervello.Omogeneizzare ogni campione nella provetta originale per microfughe con un pestello in PTFE collegato a un agitatore elettrico ad asta, utilizzando circa 15 colpi. Conservare i campioni omogeneizzati su ghiaccio, al riparo dalla luce. Sciacquare il pestello con PBS tra un campione e l'altro e asciugarlo prima di procedere al campione successivo.Quando tutti i campioni sono stati omogeneizzati, centrifugare per 20 minuti a 15.000 G e quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire i surnatanti in nuove provette da 1,5 millilitri su ghiaccio prima di procedere alla misurazione e alla quantificazione della fluorescenza. Trasferire il surnatante in una piastra a 384 pozzetti e inserire la piastra nel lettore a fluorescenza.Assicurarsi che siano incluse le giuste lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per il tracciante e impostare il guadagno su Ottimale. Avviare la misurazione ed esportare i dati come foglio di calcolo per eseguire i calcoli come descritto nel protocollo. Il giorno della colorazione, scongelare sezioni di criostato da 10 micron montate su vetrini a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi, fissare le sezioni con il 4% di paraformaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio rapido in PBS. Permeabilizzare e bloccare il legame aspecifico nelle sezioni incubando in PBS sterile contenente l'1% di PSA e lo 0,5% di Triton X-100 per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il blocco, incubare i vetrini con una diluizione da uno a 100 dell'anticorpo primario CD31 per 1,5 ore a temperatura ambiente.Dopo il lavaggio con PBS tre volte per cinque minuti ciascuna, eseguire l'incubazione secondaria degli anticorpi per un'ora a temperatura ambiente con anticorpi marcati in fluorescenza specie-specifici. Montare le sezioni colorate con Aqua-Poly/Mount e lasciare riposare per una notte a temperatura ambiente al buio. Infine, acquisisci le immagini utilizzando un sistema di microscopio a scansione laser confocale per imaging spettrale.Al fine di stabilire il tempo di circolazione del tracciante per il test di permeabilità, un tempo di circolazione lungo di due ore viene confrontato con un breve tempo di circolazione di 15 minuti dopo l'iniezione del tracciante. Il tempo di circolazione più lungo, pari a due ore, porta a un basso accumulo di traccianti nel rene rispetto a un breve tempo di circolazione di 15 minuti, potenzialmente dovuto a un destrano FITC ad alta clearance mostrato in verde dal compartimento vascolare. Questo effetto è ancora più drammatico nel cervello a causa della stretta barriera emato-encefalica.La colorazione CD31 osservata nel canale rosso ha confermato la presenza di vasi nel rene in entrambi i punti temporali esaminati e nel cervello. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro cinque o sei ore per 10 topi con due scienziati che lavorano in tandem. Durante la sperimentazione di questa tecnica, è importante ricordare di utilizzare traccianti con il giusto peso molecolare, grafico e caratteristiche di fluorescenza per rispondere alle domande riguardanti la permeabilità della barriera emato-encefalica.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica per la BBD e il riempimento della malattia sui fattori per rispondere a ulteriori domande, come la gravità e la localizzazione del sito della malattia.

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Questo video descrive un test di permeabilità per valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica in vitro utilizzando molecole di fluoresceina di sodio.

Saggio di permeabilità mimica della barriera emato-encefalica: un test in vitro per valutare la permeabilità della BBB che imita le molecole traccianti

Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Viene descritto e convalidato un metodo per stabilire un modello in vitro di barriera emato-encefalica basato su una co-coltura di cellule endoteliali microvascolari di ratto e astrociti. Questo sistema si è rivelato un valido strumento per studiare l'effetto della nanoformulazione sulla permeazione trans-barriera di molecole fluorescenti.

In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole

In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue - cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.

Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Drug targeting per tumori del sistema nervoso centrale è una sfida importante. Qui descriviamo un protocollo per produrre un mimo in vitro del tumore-barriera emato-encefalica utilizzando cellule murine e/o umane e discutere la loro rilevanza per la prevedibilità del sistema nervoso centrale targeting tumorale in vivo.

Fornitura di payload predicting In Vivo utilizzando una tumore-barriera emato-encefalica in un piatto

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

Nel presente studio, il destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) viene somministrato ai topi tramite sonda gastrica orale per valutare la permeabilità intestinale sia in vivo che in campioni plasmatici e fecali. Poiché la funzione di barriera intestinale è influenzata in molti processi patologici, questo test diretto e quantitativo può essere utilizzato in diverse aree di ricerca.

Valutazione dell'integrità della barriera intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato

È stato sviluppato un metodo per visualizzare lo stravaso di colorante dovuto alla rottura della barriera emato-encefalica (BEE) somministrando due coloranti fluorescenti ai topi in momenti diversi. L'uso del glicerolo come crioprotettore ha facilitato l'immunoistochimica sullo stesso campione.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) nel modello adulto di pesce zebra (Danio rerio) utilizzando la valutazione basata sul colorante blu di Evan, consentendo un'analisi sia qualitativa che quantitativa dell'interruzione neurovascolare.

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

Impara a valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica nei topi utilizzando traccianti fluorescenti. Questo metodo quantitativo combina fluorimetria e microscopia per studiare disfunzioni vascolari cerebrali.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

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