Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Poiché gli organoidi ricapitolano l'organizzazione strutturale nativa, così come molte caratteristiche molecolari dell'epitelio intestinale in vivo, questa tecnica ci consente di studiare la biologia normale e gli stati delle malattie in laboratorio. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di ingegnerizzarsi geneticamente organoidi utilizzando un approccio di trasduzione molto efficiente con bassa citotossicità, consentendo così studi funzionali di questi organoidi geneticamente manipolati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia per la malattia intestinale perché possiamo esporre organoidi intestinali a farmaci e altri agenti o interventi.

Questo metodo può essere applicato per studiare processi di sviluppo e patologici in altri sistemi suscettibili a colture organoidi, come i tessuti mammari o per le cellule che crescono in condizioni 2D standard. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno successo con la trasduzione in organoidi difficili da progettare o altre cellule. Abbiamo avuto l'idea per la prima volta di questo metodo quando abbiamo incontrato difficoltà nel trasdurre i nostri organoidi e le nostre cellule staminali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la perdita strutturale degli organoidi può verificarsi se i campioni non vengono trattati correttamente durante il processo di incorporamento nella matrice del seminterrato per la criosezione. Per coltivare organoidi per la trasduzione virale, seminare colture cellulari organoidi con 200 microlitri di mezzo di trasduzione per pozzo in una piastra da 48 po 'e incubare in un incubatore standard di coltura tissutale. Scongelare flaconcini di virus per la trasduzione, consentendo circa 50 microlitri di virus concentrato per la trasduzione di ogni pozzo in piastre da 48 pozzi.

In un tubo da 1,5 millilitri, mescolare il virus con 12 microlitri di una soluzione di nanoparticelle magnetiche e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, aggiungere la soluzione magnetica di nanoparticelle e la miscela di virus alle cellule da trasdurre. Posizionare la piastra di 48 po 'su una piastra magnetica e incubare in un incubatore standard di coltura tissutale per almeno due ore.

Quando la trasfezione virale è completa, trasferire gli ammassi di cellule organoidi infetti e il mezzo di trasduzione da ogni pozzo in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifuga a 500 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante con aspirazione delicata e raffreddare i tubi contenenti il pellet sul ghiaccio per cinque minuti.

Aggiungere 120 microlitri di matrice di membrana basale a ciascun tubo e rimescolare il pellet tubazione lentamente su e giù. Semina 30 gocce di microliter della miscela matrice-cella in una nuova piastra da 48 pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-15 minuti fino a quando la matrice non si solidifica.

Aggiungere il mezzo di trasduzione a ciascun pozzo e incubare in un incubatore standard di coltura tissutale per tre o quattro giorni. Dopo tre o quattro giorni, ispezionare le colture al microscopio leggero con ingrandimento 10x per garantire l'organizzazione dei cluster cellulari in strutture organoidi. Sostituire delicatamente il mezzo di trasduzione in ogni pozzo con 250 microlitri di coltura organoide ENR medium.

Riportare la piastra all'incubatore. Iniziare questa procedura rimuovendo il mezzo ENR per aspirazione delicata, facendo attenzione a non perturbo la matrice della membrana basale. Lavare delicatamente con 500 microlitri di PBS.

Fissare gli organoidi aggiungendo un microlitro di soluzione di paraformaldeide al 4% per pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere la soluzione di paraformaldeide per aspirazione. Aggiungere delicatamente un microlitro di PBS per pozzetto, quindi rimuovere il PBS per aspirazione delicata.

In questo modo, lavare due volte con PBS. Rimuovere il PBS dal secondo lavaggio e aggiungere un microliter del 30% di tampone di saccarosio a ciascun campione. Incubare gli organoidi fissi in saccarosio per un'ora a quattro gradi Celsius per disidratare i campioni.

Rimuovere il tampone di saccarosio per aspirazione e aggiungere un composto di incorporamento sufficiente per coprire lo strato della matrice in ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, posizionare i campioni in un congelatore Celsius meno 80 gradi per 10 minuti o fino a quando il composto incorporante diventa solido e bianco.

Posizionare la piastra con composto di incorporamento congelato a temperatura ambiente per consentire una fusione minima del composto lungo i bordi. Utilizzare un bisturi o una spatola per separare il blocco dalle pareti del pozzo. Lavorare rapidamente per evitare la fusione, utilizzando le forcep per rimuovere il blocco composto di incorporamento della matrice e posizionarlo in un blocco campione.

Riempire completamente lo stampo con il composto di incorporamento. Congelare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti prima di utilizzare il blocco per il sessatura. Questo protocollo è stato ottimizzato trasducendo prima organoidi intestinali con vettori lentivirali legati alla GFP.

Il GFP è stato visualizzato in ogni fase dello sviluppo organoide, anche all'inizio quando le cellule della cripta si organizzano in strutture simili a cisti o in tempi successivi in cui gli organoidi formano gemme. Gli organoidi intestinali trasdutti con successo sono stati quindi fissati alla formalina, criosezione e analizzati mediante imaging ad immunofluorescenza. In questa immagine, i nuclei sono macchiati di blu, e il verde indica molecole di adesione delle cellule epiteliali, che delimitano i bordi delle cellule.

Il rosso indica la colorazione lisosoma per identificare le cellule di Paneth. Una volta padroneggiati, gli organoidi trasduttori possono essere eseguiti in circa tre ore e l'incorporamento della sezione di pianto degli organoidi può essere fatto in circa 2 ore e mezza. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di lavorare sul ghiaccio quando si maneggiano reagenti a matrice seminterrata.

Dopo aver completato questa procedura, l'analisi immunofluorescente e altri metodi per rilevare proteine o organelli possono essere eseguiti per valutare la localizzazione o l'abbondanza relativa. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare la biologia normale e gli stati delle malattie in vitro e anche per studi in vivo se gli organoidi o le cellule trasdotti possono essere impiantati nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come usare virus con etichetta magnetica per ingegnerizzare geneticamente organoidi per la criosezione.

Si prega di non dimenticare che lavorare con i virus può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione appropriati devono sempre essere intraprese quando si esegue questa procedura.