Name: Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri l'ingegneria genetica di organoidi intestinali murini mediante nanoparticelle magnetiche e vettori virali per la criosezionamento. Questo metodo ad alta efficienza consente studi funzionali con bassa citotossicità.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), del Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), dell'American Lung Association, della Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund e il Centro di Ricerca di Base sulle Malattie Digestive Hopkins.

Questo protocollo è stato approvato dal Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC Committee). Questo protocollo viene modificato da un metodo pubblicato in precedenza10,11,12,13.
1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare il mezzo fresco 293T con diverse ore di anticipo e riscaldare a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per almeno 10 minuti prima dell'uso (Tabella 1).</li>
	<li>Preparare il DNA plasmide2,13,14 per l'imballaggio virale. (Tabella 2).</li>
	<li>Acquisire tutti gli altri materiali necessari (Tabella dei materiali).</li>
</ol>2. Produzione di particelle di lentivirus o retrovirus
<ol><li>Rene embrionale umano (HEK) 293T semina cellulare (Giorno 1)
	<ol>
<li>Preparare un piatto di coltura di 150 mm ricoprendo lo strato con 50 g/mL poli-D-lysina disciolto in salina tampina tamponata di fosfato (PBS; 10 mL/piatto) per 1 h a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Rimuovere la salina tampone di fosfato (PBS)/poli-D-lysine e lavare il piatto rivestito due volte con 5 mL PBS.</li>
		<li>Seme 293T celle (8u201210 x 106) in 293T medio (Tabella 1) per un volume totale di 15 mL.</li>
		<li>Coltura 293T cellule durante la notte in un incubatore di coltura tissutale standard (37 , 5% DI CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>HEK 293T trasfezione cellulare (giorno 2)
	<ol>
<li>Eseguire la trasfezione una volta che le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza (di solito circa 24 h dopo il seeding 8 -u201210 x 106 cellule).</li>
		<li>Preparare la miscela di trasfezione utilizzando un approccio efficiente, come una formulazione liposoma leale cationica commerciale (Tabelle 1 -u20122, Tabella dei materiali)2.<ol>
<li>Il DNA di lentivirus diluito costruisce12 (totale 24 g di DNA plasmide, tabella 2) in 1,2 mL di mezzo di trasfezione e incubazione per 5 min a RT in tubi da 1,5 mL ( Tabelladei materiali).</li>
			<li>Diluire trasfezione (36 o L) in 1,2 mL di mezzo di trasfezione (Tabella dei materiali) e incubare in tubi da 5 mL per 5 min secondo le istruzioni del produttore.</li>
			<li>Aggiungere il reagente lentivirus (passaggio 2.2.2.1) al reagente di trasfezione (passaggio 2.2.2.2) e mescolare delicatamente con un tubo lento su e giù con un pipet da 5 mL.</li>
			<li>Incubare la miscela per 20 min a RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare delicatamente 293T cellule con 5 mL di mezzo di trasfezione e sostituire con 10 mL di mezzo di trasfezione.</li>
		<li>Aggiungere i complessi DNA-lipidici (dal passo 2.2.2.3) dropwise al mezzo di 293T cellule e mescolare attentamente i media nei piatti di coltura muovendosi in direzioni orizzontale e verticale per garantire la distribuzione equa dei complessi DNA-lipidici in ogni piatto.</li>
		<li>Incubare per 6 h in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% di CO2).</li>
		<li>Dopo l'incubazione, sostituire il supporto con 20 mL di virus fresco che raccoglie il virus medio (Tabella 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di virus (giorni 3 -u20125)
	<ol>
<li>Raccogliere i supporti antivirus in tubi da 50 mL e conservarli in un frigorifero a 4 gradi centigradi per un'ulteriore concentrazione.</li>
		<li>Sostituire 20 mL di un mezzo di raccolta di virus fresco ogni 24 ore e di coltura durante la notte (24 h). Ripetere la raccolta dei file multimediali nei 2 giorni successivi (Giorni 4 -u20125).</li>
		<li>Assicurarsi che il volume totale del supporto raccolto dopo il giorno 5 sia di 60 mL (20 mL/giorno x 3 giorni).</li>
	</ol></li>
	<li>Concentrazione dei virus (giorno 5)
	<ol>
<li>Centrifugare il supporto raccolto (60 mL) per 5 min a 400 x g. Quindi, passare il supernatante attraverso un filtro (0,45 m pori) per rimuovere eventuali detriti cellulari.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentrare il virus aggiungendo 15 mL di supporti antivirus filtrati in un'unità filtrante centrifuga (Tabella dei materiali). Centrifuga a 2.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Poiché il virus non può passare attraverso questo filtro, sarà concentrato nella camera superiore del filtro.
	<ol>
<li>Aspirare il flusso attraverso dal tubo (camera inferiore) e aggiungere altri 15 mL di raccolta virale rimanente supernatante alla stessa unità di filtro centrifuga. Centrifuga come sopra (2.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi) per concentrare il virus aggiuntivo dal sovrentrato.</li>
		<li>Ripetere il processo utilizzando lo stesso filtro per supporti da 60 mL da una singola piastra transdotta fino a raggiungere la concentrazione desiderata (100 volte). Nota: In genere concentriamo 60 mL di supporti per la raccolta dei virus su 600 dollari.</li>
		<li>Rimuovere il virus concentrato dalla camera superiore del filtro utilizzando un pipet da 1 mL, quindi conservare in tubi da 1,5 mL (50-u201260 l/tubo) a -80 gradi centigradi per un uso successivo. Conservare le particelle concentrate per un massimo di 6 mesi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolare le cripte
<ol><li>Topi eutanasi che utilizzano CO2 secondo le linee guida locali di IACUC.</li>
	<li>Posizionare l'animale eutanasia sulla schiena e lavare l'addome spruzzando con 70% etanolo.</li>
	<li>Eseguire un'incisione longitudinale della linea mediana dallo sterno all'inguine, incidendo prima la pelle e poi il tessuto sottocutaneo.</li>
	<li>Rimuovere l'intestino tenue dallo stomaco al cecum.</li>
	<li>Identificare le regioni di interesse all'interno dell'intestino tenue; cripte possono essere isolate dal duodenum, jejunum e ileum.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 10 mL, lavare l'intestino tenue isolato con tampone di dissociazione cripta (PBS pre-freddo contenente 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% penicillina /streptomicina (no Ca2 ' e Mg2)) in un piatto di 10 cm di coltura dei tessuti (Tavolo 1) )</li>
	<li>Rimuovere il tessuto adiposo periferico e aprire o "rintare" il tessuto intestinale longitudinalmente su una lastra di vetro sterile (15 cm x 15 cm).</li>
	<li>Raschiare delicatamente il villi epiteliale intestinale utilizzando un raschietto cellulare.</li>
	<li>Tagliare l'intestino tenue in sezioni di lunghezza di 2-u20123 cm.</li>
	<li>Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL contenente PBS pre-raffreddato utilizzando pinze piatte (116 mm). Lavare i frammenti di tessuto agitando vigorosamente a mano per 30 dollari (spostando il tubo in direzioni opposte 60 volte).</li>
	<li>Aggiornare il PBS e ripetere il lavaggio fino a quando il PBS diventa chiaro. Nota: In genere laviamo i frammenti 2-u20123 volte.</li>
	<li>Incubare il tessuto in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di tampone di dissociazione della cripta (Tabella 1) per 10 min a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale a velocità media una volta che il PBS è chiaro.</li>
	<li>Agitare vigorosamente il tubo a mano per 30 dollari (direzioni opposte 60 volte) e trasferire il tessuto utilizzando la forza piatta a un altro tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di tampone di dissociazione criptato. Incubare questa frazione sul ghiaccio. Non usare la prima frazione per la coltura organoide perché contiene principalmente villi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.11-u20123.13 per 3-u20124 volte, raccogliendo ogni frazione e posizionandole sul ghiaccio.</li>
	<li>Selezionare la frazione che viene arricchita con la più alta percentuale di cripte intestinali scansionando 200 campioni luna tiri provenienti da ogni frazione al microscopio invertito (4x). Identificare le cripte in base alla morfologia tipica descritta in precedenza (Figura 1A)10. NOT:</</c2> Appariranno di forma rotonda o ovale e conterranno celle del riquadro granulato. Al contrario, i villi sono strutture simili a dita prive delle celle Paneth granulari (Figura1B).</li>
	<li>Passare la frazione selezionata attraverso un colino di 40 m per ottenere cripte di dimensioni simili, se necessario. In alternativa, isolare le cellule staminali Lgr5, basate sulla citometria di flusso per la proteina fluorescente verde (GFP), se i topi vengono incrociati sullo sfondo di EGFP-Lgr5 o su un altro modello adatto che consente l'identificazione delle cellule Lgr52.</li>
	<li>Contare il numero totale di cripte nella frazione selezionata come segue.
	<ol>
<li>Pipetta 50 -L della frazione selezionata in un emocitometro e contare il numero di cripte utilizzando un microscopio luminoso invertito (4x). Mettere 100 cripte per pozzo quando si utilizza una piastra di 48 pozzetti per consentire gli esperimenti di trasduzione in cui i pozzi 3 -u20126 saranno trasdotti per condizione sperimentale per il silenziamento genico o la sovraespressione.</li>
		<li>In base al numero di cripte per 50 gradi, calcolare il volume del buffer di dissociazione della cripta necessario e trasferire il volume in un tubo da 1,5 mL. Nota: Per 300 cripte sono necessarie 10 cripte per 50 gradi l, per 300 cripte sono necessarie 6 x 50 l o 300 L.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugare le cripte nei tubi da 1,5 mL a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Scartare con attenzione il supernatante pipettando delicatamente dallo strato liquido superiore e risospende nuovamente il pellet in 100 - L di fattore di crescita ridotto matrice della membrana seminterrato sul ghiaccio (Tavolo dei materiali).</li>
	<li>Semina le cripte che contengono la matrice in una piastra preriscaldata da 37 gradi centigradi (30 gradi l/pozzetto, cripte/pozzo da 100 dollari). Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura tissutale standard per 5-u201215 min per consentire la gelazione a matrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).</li>
	<li>Sovrapporre ogni gel con un mezzo di colturaorganoide (ENR) di 250 l (ENR) e riporre le lastre di 48 pozze in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% CO2). Controllare le culture per l'organizzazione cripta in piccole, rotonde, forme citiche dopo 24 ore; le gemme si formeranno dopo 2 giorni 2-u20125.</li>
	<li>Sostituire delicatamente i supporti ENR ogni 3 giorni. Rimuovere i vecchi supporti ENR con aspirazione delicata, facendo attenzione a non toccare la matrice durante la sostituzione dei supporti.</li>
	<li>Colture organoidi di passaggio ogni 4 -u20127 giorni come descritto in precedenza11.</li>
</ol>4. Preparazione del frammento organoide
<ol><li>Gli organoidi trasduceciati una volta che si formano (entro 1-u20122 settimane) o dopo essere stati passaggi. Per un singolo esperimento di trasduzione, preparate 2-u20123 pozzi di organoidi coltivati in una piastra di 48 pozzetti per condizione con organoidi/bene da 100,u201200 o da organoidi per condizione di trasduzione sperimentale.</li>
	<li>Scambiare ENR con 250 supportidi trasduzione (Tabella 1) e coltura nei mezzi di trasduzione per 3 o più giorni o fino a quando gli organoidi adottano una morfologia cistica. Includere sia Wnt3a che l'inibitore ROCK (Y27632) nel mezzo di trasduzione per aumentare il numero di cellule staminali e di Paneth; La nicotinamide (Nic) migliora l'efficienza della coltura (vedi mezzo di trasduzione nella tabella 1).</li>
	<li>Rompono meccanicamente la struttura a matrice a membrana del seminterrato simile a una cupola con supporti e una punta pipetta utilizzando un pipet da 1 mL.</li>
	<li>Trasferire gli organoidi e i supporti in un tubo sterile da 1,5 mL.</li>
	<li>Interrompere meccanicamente la matrice con il pipettaggio con un pipet da 200 dollari.</li>
	<li>Centrifugare i frammenti organoidi a RT a 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare attentamente il supernatante utilizzando una pipetta e sospendere nuovamente il pellet in 1 mL di media DMEM/F12 (tabella1).</li>
	<li>Aggiungere Dispase I (6 a 10 mg/mL) e DNase I (2,5 l a 10 mg/mL). Mescolare bene pipettando delicatamente con un pipet da 1 mL.</li>
	<li>Incubare organoidi a 37 gradi centigradi per 20 min nel tubo da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 500 -L di supporto ENR per terminare la reazione di dissociazione; il siero nel ENR termina la reazione.</li>
	<li>Passare le cellule organoidi attraverso un colino cellulare di 20 m e centrifugare i frammenti organoidi a 400 x g per 5 min.</li>
	<li>Risospendere i frammenti organoidi con un mezzo di trasduzione di 150 gradi (tabella1).</li>
</ol>5. Ingegneria genetica degli organoidi o delle cellule della cripta mediante trasduzione virale
 NOT:</</c0> Vedere la Figura 2.
<ol><li>Cluster di cellule organoidi di semi con un mezzo/bene di trasduzione di 200 gradi in una piastra di 48 pozze e incubare in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% CO2). In alternativa, inserire celle di cripto appena isolate (1.000 cripte) in 200 .</li>
	<li>Scongelare le fiale di virus per la trasduzione consentendo 50 dollari di virus concentrato per la trasduzione di ogni pozzo in lastre di 48 pozzetti o 100 dollari di virus concentrato per pozzo in piastre di 24 pozzetti.</li>
	<li>Incubare il virus con 12 l di soluzione magnetica nanoparticella per 15 min a RT in un tubo da 1,5 mL (Tabella 3).</li>
	<li>Aggiungere la miscela di soluzione/virus delle nanoparticelle magnetiche alle cellule da trasdure.</li>
	<li>Posizionare la piastra di coltura cellulare su una piastra magnetica e incubare per almeno 2 h (e fino a 6 h) in un'incubatrice a coltura di tessuto standard (37 , 5% CO2).</li>
</ol>6. Seeding di frammenti organoidi infetti
<ol><li>Trasferire gli ammassi di cellule organoidi infette e i supporti di trasduzione da ciascun pozzo in un tubo da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Scartare il supernatante con un'aspirazione delicata e raffreddare il tubo contenente il pellet sul ghiaccio per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 120 -L di matrice di membrana del seminterrato e risospendere il pellet pipetting lentamente su e giù.</li>
	<li>Seme 30 gocce di miscela matrice-cellula in una nuova piastra di 48 pozze.</li>
	<li>Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5,u201215 min fino a quando la matrice si solidifica.</li>
	<li>Aggiungete il mezzo di trasduzione ad ogni pozzo e incubate in un'incubatrice di coltura tissutale standard per 3 giorni (37 gradi centigradi, 5% CO2).</li>
	<li>Dopo 3-u20124 giorni, ispezionare le colture al microscopio luminoso (10x) per garantire l'organizzazione di ammassi cellulari in strutture organoidi. Quindi, sostituire delicatamente i supporti di trasduzione con un supporto ENR da 250.</li>
	<li>Sostituire i supporti ogni 3 giorni u20124.</li>
</ol>7. Selezione (se applicabile)
<ol><li>Dopo 2-u20123 giorni, aggiungere gli antibiotici o gli ormoni pertinenti per la selezione al mezzo di trasduzione, se appropriato. NOT:</</c0> Abbiamo usato la puromicina (2 g/mL) per la selezione della trasduzione lentivriale perché i plasmidi ospitavano un gene di resistenza puromycina2,14.</li>
</ol>8. Conferma della trasduzione e dell'espressione genica di successo o del silenziamento
<ol><li>Se si utilizza la lentivirus FUGW2,14, stimare l'efficienza della trasduzione misurando i segnali GFP al microscopio fluorescente o alla citometria di flusso.</li>
	<li>Convalidare la sovraespressione genica o il silenziamento utilizzando la reazione a catena di polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (RT-PCR) per il confronto quantitativo dell'mRNA nelle colture di controllo e organoide sperimentali.</li>
	<li>Confermare i livelli proteici per l'espressione o il silenziamento genico codificante di proteine da Western Blot o immunostaining2.</li>
</ol>9. Criosezione organoide nella matrice della membrana del seminterrato
 NOT:</</c0> Vedere la Figura 3.
<ol><li>Rimuovere il mezzo ENR con aspirazione delicata, facendo attenzione a non perturbare la matrice della membrana del seminterrato e lavare delicatamente una volta con 500 .</li>
	<li>Fissare gli organoidi con 1,0 mL del 4% di paraformaldeide (PFA) soluzione (Tabella dei materiali) a RT per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere la PFA per aspirazione e lavare delicatamente due volte con 1 mL PBS.</li>
	<li>Rimuovere PBS per aspirazione e aggiungere 1,0 mL di 30% buffer di saccarosio a ogni campione. Incubare organoidi fissi nel saccarosio per 1 h a 4 gradi centigradi in una cella frigorifera, in frigorifero o sul ghiaccio per disidratare i campioni.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di sucrosi per aspirazione e aggiungere abbastanza composto di incorporamento (Tabella dei materiali) per coprire il livello della matrice (300 dollari l/po) in ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Mettete i campioni in un congelatore a -80 gradi centigradi per 10 min, o fino a quando il composto di incorporamento diventa solido e bianco.</li>
	<li>Posizionare il piatto con composto di incorporamento congelato a RT per consentire la fusione minima del composto lungo i bordi. Utilizzare un bisturi per separare il blocco dalle pareti del pozzo.</li>
	<li>Rimuovere il blocco composto che incorpora la matrice utilizzando la pinpe e posizionarlo in un blocco campione (ad esempio criomuffarsi), lavorando rapidamente per evitare la fusione.</li>
	<li>Riempire completamente lo stampo con l'incorporamento composto e congelare a -80 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Utilizzare il blocco è per sezionamento o stoccaggio in -80 gradi congelatore per un ulteriore utilizzo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

La coltura primaria dell'epitelio intestinale adulto come organoidi fornisce un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella funzione delle cellule staminali, l'omeostasi epiteliale intestinale e la patologia1,2,3, 4. Anche se la tecnologia CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per ingegnerizzare geneticamente gli organoidi9, è limitata dalla neces...

La capacità di coltura delle cellule di certera umana o di topo come organoidi tridimensionali (3D) dall'intestino tenue o dal colon per periodi di tempo prolungati ha fornito un importante passo avanti perché queste culture mostrano caratteristiche distintive dell'epitelio intestinale in vivo 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3. Gli organidi derivati dalle cripte primarie sono in grado di auto-rinnovamento e di auto-organizzazione, che esibiscono funzioni cellulari simili ai loro tessuti di origine. Infatti, gli organoidi riassumono non solo l'organizzazione strutturale delle cripte in vivo, ma anche molte caratteristiche molecolari, fornendo così strumenti utili per studiare i normali stati di biologia e malattia. Per illustrare, studi organoidi hanno rivelato nuovi percorsi molecolari coinvolti nella rigenerazione dei tessuti1,2,3,4,5 così come farmaci che potrebbero migliorare la funzione nelle impostazioni patologiche6,7.
Lo studio delle cellule staminali intestinali è di particolare interesse perché il rivestimento intestinale è tra i tessuti mammiferi più altamente rigenerativi, rinnovandosi ogni 3-5 giorni per proteggere l'organismo da batteri, tossine e altri agenti patogeni all'interno del lumen intestinali. Le cellule staminali intestinali (ISC) sono responsabili di questa notevole capacità rigenerativa e forniscono così un paradigma unico per studiare la funzione delle cellule staminali adulte1,2. Gli esperimenti di tracciamento del lignaggio nei topi hanno dimostrato che le cellule staminali isolate lgr5-positive possono essere coltivate per generare organoidi 3D o "mini-guts" in vitro dove rispecchiano da vicino le loro controparti in vivo. Le colture organoidi possono anche essere derivate da isolati di cellule crittogiformi intestinali costituiti da progenitori, ISC e cellule di Paneth, quest'ultima delle quali costituiscono le cellule di nicchia epiteliali in vivo. Infatti, la coltura organoide dalle cellule primarie della cripta intestinale si è evoluta in una tecnica relativamente di routine che è facile da implementare nella maggior parte dei laboratori utilizzando reagenti ampiamente disponibili. Questo modello è anche suscettibile di analisi quantitativa dell'espressione genica mediante RNA-sequencing (RNA-Seq) e proteine per spettrometria di massa, immunohistochimica o colorazione immunofluorescente2,4,8. Inoltre, la genetica funzionale può essere studiata utilizzando il guadagno di funzione (sopraespressione genica o espressione di un gene mutante attivatore) o la perdita di funzione (silenziamento genico o espressione di un mutante di perdita di funzione) si avvicina2.
È importante sottolineare che la bassa efficienza e l'elevata tossicità del DNA plasmide standard o dei protocolli di trasduzione virale con polibrene rimangono un ostacolo importante nel campo. Sebbene la tecnologia CRISPR/Cas9 consenta un editing preciso del genoma, questo approccio richiede una selezione che richiede molto tempo seguita dalla convalida della sequenza9. Qui presentiamo un protocollo di trasduzione virale per organoidi intestinali primari che ottimizza la consegna di particelle virali mediante coniugazione a nanoparticelle magnetiche e l'applicazione di un campo magnetico. Vengono fornite modifiche chiave ai protocolli precedenti4,5,10,11,12,13 e sono disponibili raccomandazioni per migliorare l'efficienza. Descriviamo anche un approccio per generare sezioni congelate da organoidi intatti coltivati in matrigel 3D (d'ora in poi indicato come matrice della membrana seminterrato o matrice) per ulteriori analisi con immunohistochimica o colorazione immunofluorescente.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Terreno base per cellule 293T</td></tr><tr><td>DMEM/F12+</td><td>Thermo Fisher Scientific 12634010</td><td></td><td>Terreno base per terreno di coltura di organoidi e tampone di digestione per organoidi</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific 11058021</td><td></td><td>Terreno di trasfezione di plasmidi virali</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>Componente del terreno di raccolta del virus e del terreno 293T</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi e del tampone di dissociazione della cripta</td></tr><tr><td>PBS (senza Ca2+, Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Un tampone di lavaggio e un componente del tampone di dissociazione della cripta</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi</td></tr><tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific 35050061</td><td></td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific 15630080</td><td></td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>Componente del terreno di coltura di organoidi</td></tr><tr><td>R-spondina</td><td>R& D</td><td>7150-RS-025/CF</td><td>Componente del terreno di coltura dell'organoide</td></tr><tr><td>Insulina ricombinante umana</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>Componente del terreno di coltura dell'organoide</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>Componente del terreno di trasduzione</td></tr><tr><td>Wnt3A</td><td>R& D</td><td>5036-WN-010</td><td>Componente del mezzo di trasduzione</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>Componente del mezzo di trasduzione</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Componente del tampone di dissociazione Crypts</td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitolo)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Componente del tampone di dissociazione</td></tr><tr><td>Crypts Dispase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>Componente del tampone per la digestione degli organoidi</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Componente del tampone per la digestione degli organoidi</td></tr><tr><td>matrigel (fattore di crescita ridotto)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Utilizzato come matrice per incorporare organoidi</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Medium per la trasfezione nella produzione virale</td></tr><tr><td>ViralMag R/L</td><td>Oz Biosiences</td><td>RL40200</td><td>Particelle magnetiche di trasduzione virale</td></tr><tr><td>Piastra</td><td>magnetica Oz Biosiences</td><td>MF10000</td><td>Piastra magnetica per facilitare la trasduzione virale</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Agente di trasfezione nella produzione virale</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>Rivestimento per piastre prima della semina delle cellule 293T</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 4%</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>Soluzione per fissare organoidi</td></tr><tr><td>O.C.T</td> composto incorporante <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>Per l'inclusione degli organoidi</td></tr><tr><td>5 mL Provette Falcon in polistirene</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Microscop invertito CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>per la scansione e il conteggio delle cripte</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 a fluorescenza invertita</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>per la visualizzazione della fluorescenza nelle cripte</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifugo con membrana Ultracel-100</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>Per la concentrazione di virus</td></tr><tr><td>pluriFiltro 20 &micro; m (Cell Strainer)</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>Per la preparazione di frammenti di organoidi</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>Per la preparazione di cyrpt di dimensioni simili dopo l'isolamento della cripta</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; piastre di coltura multipozzetto 48 pozzetti (TC trattato con coperchio)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>ForD2:D37+D16:D37g frammenti di organoidi</td></tr><tr><td>Ceppo animale: C57BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>Per la coltura di organoidi</td></tr></tbody></table>

ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Le colture organoidi intestinali offrono un'opportunità unica per studiare la biologia delle cellule staminali intestinali e della crittografia in vitro, anche se approcci efficienti per manipolare l'espressione genica negli organoidi hanno fatto progressi limitati in questo campo. Mentre la tecnologia CRISPR/Cas9 consente una precisa modifica del genoma delle cellule per la generazione di organiidi, questa strategia richiede un'ampia selezione e screening per analisi di sequenza, che richiede tempo e denaro. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per una trasduzione virale efficiente degli organoidi intestinali. Questo approccio è rapido e altamente efficiente, riducendo così il tempo e le spese inerenti alla tecnologia CRISPR/Cas9. Presentiamo anche un protocollo per generare sezioni congelate da colture organoidi intatte per ulteriori analisi con colorazione immunohistochimica o immunofluorescente, che può essere utilizzata per confermare l'espressione genica o il silenziamento. Dopo aver raggiunto una trasduzione di vettori virali per l'espressione genica o il silenziamento, la funzione delle cellule staminali intestinali e della cripta può essere rapidamente valutata. Anche se la maggior parte degli studi organoidi impiega saggi in vitro, gli organoidi possono anche essere consegnati ai topi per analisi funzionali in vivo. Inoltre, i nostri approcci sono vantaggiosi per prevedere le risposte terapeutiche ai farmaci perché le terapie attualmente disponibili generalmente funzionano modulando l'espressione genica o la funzione proteica piuttosto che alterando il genoma.

Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione rapida e altamente efficiente che sfrutta le nanoparticelle magnetiche esposte a un campo magnetico per fornire lentivirus alle cellule di interesse. Con gli strumenti prontamente disponibili, abbiamo applicato questo approccio non solo per trasdurre le celle di cripta appena isolate (Figura 1A), ma anche per gli organoidi (Figura 2) e altre cellule che sono refrattarie ad approcci di t...

Descriviamo istruzioni passo-passo a: 1) ingegnerizzare in modo efficiente gli organoidi intestinali utilizzando nanoparticelle magnetiche per la trasduzione lentile o retrovirale e, 2) generare sezioni congelate da organoidi ingegnerizzati. Questo approccio fornisce un potente strumento per modificare in modo efficiente l'espressione genica negli organoidi per lo studio degli effetti a valle.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Poiché gli organoidi ricapitolano l'organizzazione strutturale nativa, così come molte caratteristiche molecolari dell'epitelio intestinale in vivo, questa tecnica ci consente di studiare la biologia normale e gli stati delle malattie in laboratorio. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di ingegnerizzarsi geneticamente organoidi utilizzando un approccio di trasduzione molto efficiente con bassa citotossicità, consentendo così studi funzionali di questi organoidi geneticamente manipolati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia per la malattia intestinale perché possiamo esporre organoidi intestinali a farmaci e altri agenti o interventi.Questo metodo può essere applicato per studiare processi di sviluppo e patologici in altri sistemi suscettibili a colture organoidi, come i tessuti mammari o per le cellule che crescono in condizioni 2D standard. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno successo con la trasduzione in organoidi difficili da progettare o altre cellule. Abbiamo avuto l'idea per la prima volta di questo metodo quando abbiamo incontrato difficoltà nel trasdurre i nostri organoidi e le nostre cellule staminali.La

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.

L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Fonte: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocollo per la trasduzione lentivirale e l'analisi successiva di organoidi intestinali. J. Vis. Exp. (2015)Questo video descrive la trasduzione lentivirale di organoidi intestinali di topo a partire da una struttura simile a un cripto che contiene una sospensione. Utilizzando una matrice della membrana basale come impalcatura e mezzi supplementati con fattori di crescita, vengono introdotti vettori lentivirali per consentire l'integrazione stabile del...

Trasferimento genico in organoidi intestinali di topo mediante vettori lentivirali

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Un metodo semplice per determinare primario murino organoide tumore colon è descritto. Questo metodo utilizza la funzione che le cellule tumorali del colon sopravvivere e crescere in organoidi in terreni contenenti fattori di crescita limitate, mentre colon normale epiteliale non lo fanno.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica   sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Questo protocollo descrive i passaggi per la clonazione di singoli RNA guidati singoli in un unico concetto di RNA concatenatore di guida, che è di particolare utilità nella creazione di knockouts multi-gene usando la tecnologia CRISPR / Cas9. La generazione di doppie bocce in organoidi intestinali viene mostrata come possibile applicazione di questo metodo.

Un protocollo per il knockout dei geni multipli nei piccoli organoidi intestinali del mouse usando un concatemer CRISPR

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

Descriviamo pipeline di imaging confocale e tracciamento applicati a due strategie di reporter: organoidi mosaici per risolvere il comportamento delle singole cellule e organoidi fate reporter per il monitoraggio delle transizioni cellulari in organoidi intestinali umani e murini.

Imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini

Scopri l'ingegneria genetica di organoidi intestinali murini mediante nanoparticelle magnetiche e vettori virali per la criosezionamento. Questo metodo ad alta efficienza consente studi funzionali con bassa citotossicità.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato (Video) | JoVE Journal

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

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