Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

L'obiettivo generale di questo modello tridimensionale di fette di polmone umano tagliate con precisione è quello di valutare la citotossicità e gli effetti immunomodulatori in un modello ex vivo utilizzando tessuto umano. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della farmacologia e della tossicologia al fine di valutare la sicurezza e aiutare a valutare la risposta fisiologica alle sostanze nell'ambiente umano nativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di imitare le malattie respiratorie umane per quanto riguarda la citotossicità o gli effetti immunomodulatori, grazie all'utilizzo di tessuto umano fresco e vitale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni, la fisiologia e il patomeccanismo cellula-cellula umana, nelle malattie respiratorie, può essere utilizzato anche per altre applicazioni e per altre specie. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con l'organizzazione della valutazione dei tessuti umani e la creazione di un'infrastruttura affidabile. Inoltre, il processo di riempimento richiede molta formazione ed esperienza, a causa dell'eterogeneità dei polmoni.

Per iniziare questa procedura, incannulare la trachea inserendo il tubo di silicone e fissandolo con una pinza parallela al tubo in modo che la pinza stringa il tessuto insieme al tubo di silicone senza pizzicarlo. Chiudere tutti gli altri bronchi, vasi sanguigni e lesioni con le pinze in modo che l'agarosio non possa fuoriuscire durante la procedura di riempimento. Per incannulare il bronco principale è necessaria una buona abilità anatomica.

I polmoni non devono essere dilatati troppo, altrimenti il tessuto si distrarrà e, se il tessuto non è riempito abbastanza, sarà impossibile fare qualsiasi PCLS perché il tessuto è troppo morbido. Quindi, mescolare un volume equivalente di agarosio a basso gelificamento al 3% con il terreno di coltura in un becher. Instillare la miscela nel polmone utilizzando una siringa da 15 millilitri.

Prima di riempire nuovamente la siringa con il fluido, chiudere il catetere con le dita o con una pinza per evitare bolle d'aria e reflusso di agarosio. Tagliare il tessuto polmonare in lastre da tre a cinque centimetri. Riempire l'affettatrice con 400 millilitri di EBSS ghiacciato.

Tagliare immediatamente i nuclei cilindrici di tessuto dalle lastre polmonari, utilizzando un cacciavite semiautomatico con uno strumento di carotaggio. Successivamente, trasferire i nuclei di tessuto nel supporto per fazzoletti dell'affettatrice. Posiziona il peso sopra il nucleo del tessuto e inizia a tagliare il nucleo del tessuto in PCLS.

Il terreno deve essere drenato dall'affettatrice in un bicchiere, aprendo la fascetta del cilindro di vetro. Quindi, trasferire le fette da un becher alla piastra di Petri con terreno di coltura. Successivamente, posizionare la capsula di Petri in un'incubatrice e lasciare che il terreno si riscaldi prima delle fasi di lavaggio.

Quindi, trasferire con cura le fette di polmone in una piastra di coltura a 24 pozzetti con un minimo di 500 microlitri di terreno di coltura per due fette per pozzetto. Per preparare una miscela master della soluzione di lavoro, diluire 25 microlitri di reagente WST-1 e 225 microlitri di terreno per ogni pozzetto. Successivamente, pipettare 250 microlitri della soluzione di lavoro master mix di WST-1 per ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Assicurarsi che i PCLS siano completamente coperti dal reagente WST-1 durante l'incubazione. Successivamente, posizionare la piastra su un agitatore orbitale a 200 giri/min e agitare accuratamente per 30 secondi per garantire una miscelazione accurata del reagente WST-1. Quindi, pipettare 100 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti in duplicati.

Misurare l'assorbimento di ciascun pozzetto a 450 nanometri, utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre il riferimento di assorbimento a 630 nanometri da quello a 450 nanometri. Dopo aver incubato il PCLS con o senza agenti di prova, trasferire 50 microlitri di surnatante in duplicati in una nuova piastra da 96 pozzetti. Questo genera duplicati da ogni pozzetto trattato di una piastra a 24 pozzetti.

Immediatamente prima del saggio, preparare una miscela master della soluzione di lavoro dell'agente privo di LDH, mescolando accuratamente 125 microlitri di soluzione catalizzatrice con 6,25 millilitri di soluzione colorante per una piastra a 96 pozzetti. Quindi, pipettare 50 microlitri della soluzione di lavoro della miscela master in ogni pozzetto che contiene già 50 microlitri di surnatante. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.

Successivamente, misurare l'assorbimento di ciascun pozzetto a 492 nanometri, utilizzando un lettore di micropiastre, e sottrarre il riferimento di assorbimento a 630 nanometri da quello a 492 nanometri. Per la valutazione microscopica, eseguire almeno due Z-stack distribuiti in modo casuale, con il cLSM. Fai clic sulla scheda Oculare per scegliere un obiettivo da 10 volte.

Fare clic su Online per utilizzare il cLSM come microscopio ottico standard per trovare la superficie di PCLS. Quindi, fare clic su Offline per uscire dall'impostazione oculare. Successivamente, fare clic sulla scheda Acquisizione e attivare i laser appropriati per i fluorofori.

Fare clic su Percorso luce nella scheda Acquisizione e impostare i filtri e gli specchi necessari per l'esperimento. Premi il pulsante live per vedere una visualizzazione live del livello corrispondente sullo schermo. Sposta la messa a fuoco verso l'alto o verso il basso per trovare la superficie del PCLS con un segnale acuto.

Successivamente, impostare il foro stenopeico per il canale dell'omodimero di etidio rosso-1 su un'unità d'aria per il miglior compromesso tra l'efficienza della raccolta della luce e il sezionamento ottico e regolare il canale della calceina di conseguenza. Aumenta il segnale rilevato del guadagno. Aumentare o diminuire l'offset digitale per regolare lo sfondo in modo che appaia in blu nell'immagine dal vivo con la tabella di blocco del colore del canale attivata.

Selezionare la casella Z-stacks per impostare i limiti superiore e inferiore per il volume microscopico. Spostare lentamente la messa a fuoco verso l'alto o verso il basso fino a raggiungere l'intervallo di 30 micrometri e premere Imposta ultimo per salvare. Quindi, fai nuovamente clic su Live per disattivare l'immagine live e premi su Avvia esperimento per avviare l'imaging.

Qui sono mostrate le immagini microscopiche di vitalità del PCLS, che dimostrano la reattività del tessuto umano al detergente come sostanza tossica efficace. Gli effetti tossici sono valutati visivamente mediante la valutazione del tessuto positivo alla calceina rispetto ai nuclei cellulari positivi all'omodimero di etiodimero-1. Anche se la vitalità del tessuto polmonare umano varia da un donatore all'altro, il numero di nuclei di cellule morte rispetto al tessuto vitale non deve superare il 15% del controllo tissutale.

Questa figura mostra i dati rappresentativi dell'effetto immunomodulatore dell'esacloroplatinato di ammonio, un SLS sul tessuto polmonare umano. L'IL-1 alfa e il TNF-alfa extracellulari e intracellulari sono stati determinati mediante ELISA e normalizzati al contenuto proteico totale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia e della scienza di base per esplorare le risposte fisiologiche all'interno del tessuto polmonare umano vitale.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri endpoint come la costrizione delle vie aeree per rispondere a ulteriori domande, come l'efficacia dei farmaci broncodilatatori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione generale su come generare ed elaborare fette di polmone umane tagliate con precisione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro sei-otto ore e i primi risultati sono disponibili entro le prime 24 ore, se eseguita correttamente.

Tuttavia, non dimenticare che lavorare con materiale umano non fissato può essere molto infettivo e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre indossate precauzioni, come indumenti protettivi. Inoltre, è importante ricordarsi di lavorare il più possibile in condizioni sterili.