Name: Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dellangiogenesi In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Scopri l'analisi cinetica della vasculogenesi per studiare la formazione dei vasi sanguigni in vitro con cellule endoteliali. Questo metodo quantitativo consente di valutare la cinetica della vasculogenesi in diverse condizioni sperimentali.

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Gli autori riconoscono Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass ed Emily Sims (Angio BioCore presso l'Indiana University Simon Cancer Center) per ottima assistenza tecnica nel derivare i campioni ECFC. Gli autori riconoscono anche d. ssa Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder e Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) per discussione accademica così come Janice pareti (Indiana University School of Medicine) per supporto amministrativo. Tutti imaging è stata eseguita presso il centro Indiana per microscopia biologica, Indiana University School of Medicine. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 e U10 HD063094) e Fondazione per bambini di Riley. Inoltre, questa pubblicazione è stato reso possibile con supporto parziale dal National Heart, Lung e sangue Istituto di The National Institutes of Health sotto Premio # T32 HL007910.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

KAV consente la valutazione di grandi insiemi di dati con più punti di tempo Tradizionalmente, la quantificazione di vasculogenesi in vitro ha consistito di un singolo, o alcune misurazioni del punto di tempo. Questo approccio statico è semplicemente inadeguato per catturare e quantificare un processo dinamico e complesso. Pertanto, questo nuovo metodo è stato sviluppato per consentire efficiente analisi della cinetica di formazione di rete per ottenere informazioni sulle potenziali meccanismi molecolari coinvolti nel processo dinamico di vasculogenesi. Efficienza e automazione sono componenti importanti nello sviluppo di nuove tecniche per generare e analizzare grandi quantità di dati di imaging. KAV è stato sviluppato specificamente per analizzare gli stack di grande immagine composto da centinaia di immagini per diminuire il tempo e la manodopera necessaria per ricavare conclusioni biologicamente significative da insiemi di dati time-lapse. D'importanza, KAV conduce elaborazione delle immagini e generazione di dati in una manciata di secondi per i piccoli (meno di 100 immagini) immagine pile e minuti per più grande (maggiore di 100 immagini) pile, con conseguente efficienza impareggiabile di immagine. Organizzazione dei dati in fogli di calcolo di tempo e parametri misurati consente inoltre la rapida generazione di presentazione grafica e analisi statistica.
Sfide in applicazione di successo di questo approccio Anche se questo test include miglioramenti di analisi e acquisizione di immagini, alcune sfide possono ostacolare la corretta implementazione. I quattro principali ostacoli sono la umidità stabilità, precisione di temporizzazione di cromatura per acquisizione di immagini, software e affidabilità hardware e la gestione di grandi insiemi di dati generati per ogni esperimento. Formazione immagine stabile di cellule vive sopra parecchie ore può essere impegnativa. In particolare, umidificazione appropriata e coerenza è richiesta per le camere a imaging. L'angiogenesi diapositive vengono utilizzati in questo test, che sono progettati per la parallelizzazione di saggi di angiogenesi basato su matrice. Loro volume basso, circa 50 µ l, rende evaporazione e condensazione considerazioni rilevanti per le condizioni di coltura estesa. Per combattere questo problema sperimentale, è necessario utilizzare un'incubatrice che regola l'umidità. Tuttavia, è possibile anche richiesto di aumentare questo regolamento se eccessivo essiccamento della camera imaging si verifica nel corso del tempo. Abbiamo trovato che l'approccio più semplice per aumentare l'umidità è quello di aumentare la superficie dell'acqua nella camera. Per raggiungere questo obiettivo, il nostro protocollo suggerisce le seguenti tre fonti di acqua: una seconda diapositiva chambered riempito d'acqua, che è anche dove viene misurata la temperatura dell'incubatore, acqua nella zona circostante i pozzi sulle diapositive e carta da filtro bagnata o salviette. Al contrario, la condensazione si verifica quando la temperatura dell'aria in camera si raffredda la parte inferiore della diapositiva e l'umidità all'interno della camera condensa sulle diapositive e i pozzi. Questa complicazione può portare ad una diluizione dei media delle cellule e un effetto lente che interferisce con il contrasto di fase. In questi studi, la condensazione è stato minimizzato attraverso l'applicazione di aria riscaldata (39-42 ° C) sulla parte inferiore della diapositiva.
Una considerazione fondamentale per qualsiasi studio time-lapse è coerenza tra esperimento iniziazione e imaging. I tempi di avvio di imaging sono critico per l'interpretazione degli eventi a valle. Per garantire la precisione di temporizzazione di questo test, il tempo tra placcatura iniziale e il primo punto di tempo imaged deve essere controllato attentamente. In pratica, questo "tempo morto" può essere ridotto al minimo, ma ancora più importante, deve essere coerente per consentire esperimenti in giorni diversi da confrontare. Per esempio, in questo protocollo ci aspettiamo un tempo morto di circa 30 min. Questo può essere facilitato dalla vicinanza della preparazione sperimentale e strutture di formazione immagine.
Che cosa potrebbe sembrare banali dettagli a prima vista sono importanti per la gestione dei dati, stabilità dell'hardware e software. Il software e i driver hardware associato, ambiente di rete e software automatizzato Aggiorna tutti influenzano la stabilità del software. Vale la pena di test questo protocollo in una "prova generale" per identificare i colli di bottiglia e potenziali fonti di problemi nell'acquisizione immagine; per esempio, controllare per installazione inaffidabile cellule vive, fase, otturatore e fotocamera affidabilità e le politiche di tecnologia di informazioni istituzionali sulla automatizzato sistema operativo e gli aggiornamenti software.
Gestione dei dati è una preoccupazione costante di ogni esperimento imaging che genera centinaia di migliaia di immagini. Fortunatamente, software commerciale spesso controlla lo spazio disponibile prima di iniziare un esperimento di formazione immagine. Tuttavia, questo test include anche l'elaborazione delle immagini post-acquisizione e analisi che possono aggiungere l'onere di spazio di disco rigido e interferire con imaging esperimenti, se lo spazio disponibile è limitato. Ulteriormente, la sicurezza e la stabilità del computer non può essere garantite, anche con soluzioni hardware come ad esempio una matrice ridondante di dischi identici. Così, una strategia di gestione dei dati per garantire spazio sul hard disk del computer per esperimenti in corso e un robusto l'archiviazione remota, ad esempio con una risorsa di archiviazione istituzionale, è necessaria.
Strategie per ottimizzare la qualità dell'immagine Anche se la capacità di discernere con precisione ECFCs dallo sfondo matrix KAV è robusta, la sensibilità del test dipende dalla qualità dell'immagine. Ad esempio, se l'immagine ha un contrasto basso, il software rileverà le reti delle cellule con meno precisione (Figura 2B). La qualità del contrasto di fase è influenzata da diversi fattori, tra cui le impostazioni del microscopio utilizzato per acquisizione di immagini, caricamento della matrice e il supporto di sospensione cellulare durante la preparazione di test e mantenimento dei livelli di media all'interno dei pozzetti nel corso di formazione immagine. Per ottimizzare il contrasto di fase per queste analisi, sono stati effettuati adeguamenti minori per allineamento di anello di fase nel microscopio per migliorare il contrasto. Inoltre, preparazione del campione è stato rigorosamente testata per garantire il caricamento media uguale e coerente. Se la quantità di matrice e/o supporto caricato nei pozzetti è sotto o sopra il range ottimale, un menisco può formare leader a contrasto di fase alterata. Infine, data la bassa quantità di liquido nei pozzetti, è fondamentale per mantenere i livelli di supporto riducendo evaporazione e condensazione, come indicato in precedenza. Nel complesso, ottimizzazione del dosaggio è fondamentale per generare immagini di contrasto di alta qualità per l'analisi.
Oltre alla qualità di contrasto di fase, altri fattori possono avere un impatto anche risultati di analisi compreso contaminazione media, imperfezioni nella matrice e le particelle o detriti nella matrice o media. La contaminazione è un pericolo di questo test poiché coinvolge live cell imaging sopra parecchie ore in una camera di microscopia. Per ridurre il rischio di contaminazione, le sospensioni delle cellule e matrice vengono caricate sulla diapositiva in una cappa sterile. Inoltre, ogni campione è in genere placcato in doppio o triplice copia per un esperimento per ridurre al minimo il rischio di perdita di dati a causa di problemi imprevisti come detriti o particelle l'analisi di confondimento.
Bisogno di esempio eterogeneità unità per una maggiore sensibilità Eterogeneità è stato osservato e segnalato in precedenti studi di ECFCs esposti a GDM13. Un alto livello di eterogeneità nella funzione delle cellule osservata in questi campioni è speculato per essere attribuibile a parecchi fattori compreso la gravità della malattia materna, durata di malattia e di stile di gestione utilizzato per regolare i livelli di glucosio del sangue. Cosa importante, questo approccio analitico acquisisce la gamma dinamica di ECFC vasculogenesi, rendendo così possibile identificare differenze fenotipiche dovuto eterogeneità funzionale in campioni da gravidanze GDM. Nel complesso, l'uso di campioni primari, come quelli utilizzati in questi studi, può introdurre maggiore variabilità rispetto ad una linea cellulare. Come maggiore enfasi è posta sulla traslazionale studi condotti su campioni multipli di animale o umani primari con variabilità funzionale, sensibilità del test è essenziale per il rilevamento e la derivazione delle misurazioni biologicamente significativi e conclusioni. Di conseguenza, lo sviluppo di approcci come KAV migliorerà la quantità e la qualità dei dati generato di angiogenesi e vasculogenesi in vitro saggi per abilitare più robusto osservazioni e conclusioni. Inoltre, questi dati agevolerà futuri indagine dei meccanismi molecolari che contribuiscono alla alterata ECFC vasculogenesi, seguendo l'esposizione intrauterina GDM.
Applicazioni future di questo approccio Anche se questo metodo è stato applicato per valutare fetale ECFC vasculogenesi in vitro in questi studi, le potenziali applicazioni di questo approccio sono numerose. Questa tecnica può essere facilmente implementata per studiare qualsiasi popolazione di cellule che partecipa nel processo di vasculogenesi o l'angiogenesi. In particolare, può essere utilizzato per lo studio di popolazioni di cellule individuali, come è stato dimostrato in questo studio, ma potrebbe essere applicato anche ai sistemi di co-coltura. In futuro, sarebbe utile espandere questo approccio oltre l'analisi bidimensionale in vitro per valutare modelli tridimensionali (3D). Anche se la versione corrente di KAV sarebbe insufficiente per la quantificazione dei dati di imaging 3D, un approccio analitico time-lapse, multi-parametrico similmente progettato specificamente per i modelli 3D o in vivo informerebbe se le osservazioni fatte in due dimensioni in vitro sono rappresentativi della funzione delle cellule in un ambiente più biologicamente rilevante.

La capacità delle cellule progenitrici endoteliali di subire vasculogenesi, o de novo formazione del vaso, è fondamentale nella creazione di sistema vascolare embrionale durante sviluppo1. Inoltre, ulteriore formazione del vaso e la maturazione dei vasi pre-esistenti, che è conosciuto come l'angiogenesi, è anche un processo chiave nello sviluppo e nella vita postnatale per mantenere il flusso sanguigno e l'omeostasi in tutto il corpo2. Ogni organo del corpo dipende dal sistema vascolare per la consegna di ossigeno e nutrienti e per la rimozione dei rifiuti3. Se non viene mantenuta l'omeostasi vascolare, tale che la riparazione e la formazione del vaso sanguigno sono insufficienti o in eccesso, le malattie vascolari possono provocare4. Di conseguenza, adattamento e formazione vascolare sono comunemente studiati, come essi sono essenziali per il mantenimento della salute dell'organo e sono implicati nello sviluppo di numerosi stati patologici.
A causa di una maggiore comprensione del coinvolgimento del sistema vascolare in sviluppo, come pure nella progressione e nella manifestazione di malattia, le analisi sono state sviluppate per modello vasculogenesi e dell'angiogenesi in vitro e in vivo5 ,6,7. Formazione del vaso di modellazione coinvolge cellule vascolari, quali le cellule endoteliali, nella matrice della membrana basale che promuove l'organizzazione delle cellule e formazione di reti di nave8,9,10di placcatura. In genere, segue una notte di incubazione, immagini della cella reti vengono acquisiti presso un unico punto di tempo, risultante in un piccolo numero di immagini per analisi11,12,13. Di conseguenza, approcci analitici sono stati in gran parte sviluppati e ottimizzati per singola volta punto valutazioni10,14. Tuttavia, analisi statiche sono semplicemente insufficienti a catturare il processo dinamico di formazione del vaso e forniscono approfondimenti limitato di potenziali meccanismi coinvolti. Anche se l'aumento di frequenza imaging sarebbe probabilmente fornire i dati necessari per identificare la cinetica di formazione, applicazione di analitica precedentemente sviluppata ad un punto multi-time imaging approccio sarebbe inefficiente e labor intensive14. Inoltre, nonostante lo sviluppo di analisi commercialmente disponibili, a pagamento pay-per-immagine rende questa opzione costo proibitivo per studi cinetici in cui migliaia di immagini è generate15. Di conseguenza, c'è un'esigenza di un approccio agile ed efficiente catturare e quantificare vasculogenesi in vitro, compresa la possibilità di analizzare set di grande immagine generati da microscopia time-lapse cellule vive nel campo.
Per superare queste limitazioni, un nuovo approccio è stato sviluppato con lo scopo di unico punto di tempo formazione immagine per consentire la valutazione dinamica della vasculogenesi con immagini acquisite ogni 15 min16in espansione. Mediante l'acquisizione di più punti di tempo sopra parecchie ore, questo approccio fornisce una rappresentazione più dettagliata del processo di vasculogenesi, come pure la comprensione nei meccanismi possibili che contribuiscono alla formazione e manutenzione di reti di nave. Oltre a migliorare la frequenza e la qualità di acquisizione delle immagini, questo approccio incorpora nuovi software sotto forma di un plug-in open source17. Il software, definite come Kinetic Analysis di vasculogenesi (KAV), è un'applicazione semplificata che incorpora immagine elaborazione ed analisi in particolare per i set di grande immagine generati dal punto multi-time acquisizioni. KAV analizza le immagini di contrasto di fase attraverso la segmentazione di immagine seguita da scheletrizzazione18. Dieci parametri della struttura di rete sono quantificati da KAV tra cui: rami, reti chiuse, nodi, aree di rete, strutture di rete, triple-ramificati nodi, nodi quad-ramificati, lunghezza totale ramo, lunghezza del ramo medio e il ramo al rapporto di nodo (Vedi schema in Figura 1)16. Applicazione dell'approccio KAV include un fenotipo novello, calcolato di in vitro vasculogenesi, indicato come il ramo al rapporto di nodo. Il nostro lavoro recente ha dimostrato che questo rapporto è indicativo della connettività di rete e può essere associato con altri processi cellulari coinvolti nella formazione della rete, ad esempio motilità16.
Anche se in questi studi è stata valutata fetale colonie endoteliali del cellulare (ECFC) vasculogenesi, questo approccio di acquisizione e analisi di immagine può essere applicato facilmente per valutare qualsiasi tipi di cellule che subiscono la vasculogenesi o angiogenesi. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per identificare la funzione vascolare alterata risultante da una varietà di stati patologici, quali il diabete mellito gestazionale, come illustrato in questi studi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere adattato per valutare la formazione della rete e ramificazione, che sono importanti per altri processi biologicamente rilevanti. Così, l'impatto potenziale dell'applicazione di questo approccio novello a sistemi biologici unici è ancora da determinare.

<table><tbody><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 100 mm</td><td>Fisher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Fisher</td><td>1495949B</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesi Micro-vetrini a 15 pozzetti</td><td>Ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC3162</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>PSA Antimiocitico, antibiotico</td><td>Fisher</td><td>MT30004C1</td><td>Aggiunto 5 ml per flacone da 500 ml di terreno EGM2.</td></tr><tr><td>0,5% tripsina/0,53 nM EDTA in HBSS</td><td>Fisher (Corning)</td><td>MT25052CI</td><td></td></tr><tr><td>tipo 1 Collagen</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354226</td><td>100 mg di liquido, intervallo di concentrazione 3-4 mg/mL. Diluire in acido acetico 20 nM in ddH2O da utilizzare a una concentrazione finale di 0,05 mg/mL.</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>Utilizzato in soluzione di collagene di tipo 1 ad una concentrazione finale di 20 nM.</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino a camera</td><td>Ibidi</td><td>80296</td><td>Questo vetrino può essere riempito con acqua distillata per mantenere l'umidità nella camera di imaging.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher (Gibco)</td><td>20012027</td><td>1x soluzione, pH 7,2</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100 e MEF55030</td><td>TiE motorizzato con anello di fase Ph1 per il contrasto di fase con lo</td></tr><tr><td>stadio dell'obiettivo Strumenti</td><td>precedenti</td><td>ProScan II</td><td>È possibile utilizzare altri tavolini compatibili con OKOlab e Nikon Elements</td></tr><tr><td>AR Obiettivo</td><td>Nikon Instruments</td><td>93178</td><td>CFI Plan Fluor DL 10X</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td>ORCA Flash 4.0LT</td></tr><tr><td>Stage Blower</td><td>Controlli di precisione</td><td>N/A</td><td>Questo articolo è fuori produzione, le alternative includono Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W) da World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Stage-top Incubator&nbsp;</td><td>OKOLabs</td><td>H301</td><td>BoldLine include un supporto per diapositive a due posizioni</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Hewlett-Packard</td><td>Z620 o processore</td><td>Intel Xeon 4 core equivalente, >32 GB di RAM, >2 TB RAID 10, scheda grafica nVidia Quadro&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Elements Software</td><td>Nikon Instruments</td><td>AR v 4.20</td><td>ND Acquisition è uno strumento di configurazione multidimensionale utilizzato per configurare il software Elements.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ) Software</td><td>N/A</td><td>N/A Software</td><td>gratuito e open source scaricato online al seguente URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>KAV Plug-In</td><td>N/A</td><td>N/A Software</td><td>gratuito e open source scaricato online al seguente URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td></tr></tbody></table>

analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi in vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesi sono un processo complesso che cellule staminali e progenitrici endoteliali sottoporsi a formazione del vaso de novo . Valutazione quantitativa di vasculogenesi è diventata una lettura centrale di funzionalità delle cellule progenitrici endoteliali, e di conseguenza, parecchi tentativi sono stati fatti per migliorare sia in vitro che in vivo modelli di vasculogenesi. Tuttavia, i metodi standard sono limitati nell'ambito, con misurazioni statiche non riuscendo a catturare molti aspetti di questo processo altamente dinamico. Pertanto, l'obiettivo di sviluppare questo protocollo romanzo era di valutare la cinetica di vasculogenesi in vitro al fine di quantificare i tassi di formazione della rete e di stabilizzazione, nonché a fornire la comprensione nei meccanismi potenziali vascolare disfunzione. Applicazione del presente protocollo è dimostrata utilizzando cellule (ECFCs) esposte a mellito di diabete materno di formazione di colonie endoteliali fetali. ECFCs fetale sono stati derivati da sangue di cordone ombelicale dopo la nascita, coltivate e placcato in diapositive contenenti matrici della membrana dello scantinato, dove hanno subito la vasculogenesi. Immagini dei pozzi intera diapositiva sono stati acquisiti mediante microscopia di contrasto di fase time-lapse oltre 15 ore. Immagini sono stati analizzati per la derivazione dei dati quantitativi utilizzando un software di analisi chiamato analisi cinetica di vasculogenesi (KAV). KAV utilizza la segmentazione di immagini seguita da scheletrizzazione per analizzare i componenti di rete da pile di immagini di contrasto di fase punto multi-time derivare i dieci parametri (9 misurato 1 calcolato) della struttura di rete, tra cui: reti, rete aree, chiuse nodi, rami, lunghezza totale ramo, lunghezza del ramo medio, triple-ramificati nodi, nodi quad-ramificati, strutture di rete e il ramo al rapporto di nodo. Applicazione del presente protocollo identificato alterato tassi di vasculogenesi in ECFCs ottenuti da gravidanze complicate da diabete mellito. Tuttavia, questa tecnica ha vaste implicazioni oltre l'ambito segnalato qui. Implementazione di questo approccio meccanicistico valutazione di aumenterà e migliorerà funzionale letture di vasculogenesi e altri processi di ramificazione biologicamente importante in numerosi tipi cellulari o Stati di malattia.

KAV produce rappresentazioni visive della struttura di rete Il contrasto tra il ECFCs e lo sfondo di matrice nelle immagini di contrasto di fase consente KAV identificare strutture cellula-specifico. Reti ECFC identificati da KAV sono rappresentati pittoricamente come rappresentazioni da scheletro e maschera per illustrare la struttura usata dal software per la quantificazione (Figura 2A). Soprattutto, valutazione qualitativa delle copie trasformate scheletro e maschera consente la rapida identificazione di KAV sensibilità e precisione, che può essere utile nel determinare le impostazioni di soglia ottimale e interpretare i risultati di analisi. Quando la qualità delle immagini di contrasto di fase è alta e si ottiene un contrasto sufficiente, KAV individua con precisione le reti ECFC come indicato dalla somiglianza tra l'immagine di contrasto di fase e il KAV-generato scheletro e maschera rendition (Figura 2 A e Video 1).
In alternativa, se immagini di contrasto di fase non si devono ad alto contrasto e/o manufatti di imaging, come si verificano gridding, precisione di rilevamento di rete è ridotto e i risultati diventano ambigue (Figura 2B). Inoltre, formazione di bolle d'aria all'interno della media delle cellule può anche oscurare la precisione di rilevamento (Figura 2). Tuttavia, problemi con la qualità dell'immagine spesso possono essere superati attraverso la selezione dei metodi di soglia diversi inclusi nel software KAV. Ad esempio, l'immagine di contrasto di fase in Figura 2B è stata analizzata utilizzando le impostazioni di elaborazione di immagine identica ad eccezione del metodo di soglia. Dalle consegne di scheletro e maschera, si evince che la soglia di Otsu ha provocato una maggiore accuratezza nel rilevamento delle reti ECFC mostrato nell'immagine di contrasto di fase (Figura 2B). Di conseguenza, la qualità dell'immagine è fondamentale per raggiungere risultati precisi e significativi in questo test. Tuttavia, metodi di soglia diversi inclusi nell'interfaccia utente di KAV permettono la regolazione di analisi di immagine basata sulla qualità delle immagini in ingresso.
Time-lapse microscopia identifica le differenze qualitative e quantitative nella vasculogenesi ECFC dopo l'esposizione intrauterina diabete mellito gestazionale Recentemente, l'approccio analitico di KAV è stata applicata per valutare la funzione ECFC fetale dopo esposizione materna tipo 2 mellitus del diabete (T2DM) nell'utero16. Usando KAV, alterata cinetica di vasculogenesi sono stati identificati in fetale ECFCs esposti di T2DM. Tuttavia, oltre a T2DM l'esposizione, che si verifica durante la gestazione intera, diabete mellito gestazionale (GDM) o lo sviluppo di intolleranza al glucosio comunemente nel terzo acetonide della gravidanza, altera anche ECFC funzione13. Di conseguenza, KAV è stato applicato per determinare se esposti a GDM ECFCs visualizzare anche alterata cinetica di formazione di rete ECFC. Fase 1 (0-5 h) e fase 2 (5 + h) sono stati valutati usando tempo microscopia lasso accoppiato con analisi KAV (Figura 3). Immagini di contrasto di fase rappresentativa ha acquisito all'inizio dell'acquisizione di immagini (h 0,50) e nel corso del tempo (5.00 e 10.00 h) raffigurano la formazione della rete ECFC nei quattro campioni testati da una singola giornata sperimentale (Figura 3 e Video 1 ). Nonostante equivalente cella di carico, come osservato nelle immagini di contrasto di fase nelle ore 0,50, differenze qualitative nella struttura di rete sono evidenti nei punti di tempo 5,00 e 10,00 ore. ECFCs dalla gravidanza senza complicazioni (UC) formano una rete complessa e intricata 5 ore post-placcatura, simili a nostri dati precedentemente pubblicati16. Al contrario, ECFCs da GDM 1 (GDM1) modulo, che molto poche strutture che non sono interconnessi di rete di esempio. Tuttavia, questo modello non si riflette in tutti i campioni ECFC ottenuti dalle gravidanze GDM, indicative di eterogeneità tra i campioni. GDM2 campioni e GDM3 visualizzare una maggiore formazione di rete rispetto alle GDM1, anche se i modelli di connettività appaiono alterati rispetto al campione di UC. D'importanza, KAV misura diversi componenti strutturali delle reti ECFC di individuare fenotipi sia ovvi e sottili.
Oltre a generare copie trasformate di scheletro e maschera della struttura di rete, KAV quantitates dieci metriche della struttura di rete, incluso il numero di strutture di rete individuali, nodi, nodi triple-ramificati, Quadrupla-ramificati nodi, rami, totale lunghezza del ramo, lunghezza del ramo medio, reti di filiali a rapporto di nodo, totale chiuso e rete zona16. KAV compila i dati per ciascun campione in un'unica tabella di valori per tutte le immagini del corso di tempo. La tabella 1 include dati rappresentativi crudi da uno studio di imaging per un campione ECFC. Parametri della struttura di rete misurata da KAV sono organizzati in colonne, e i dati per immagini sequenziali acquisite nel corso del tempo sono organizzati in righe. Per esempio, nei nostri studi, immagine 1 è stata ottenuta il post-placcatura 30 min con le immagini successive essere raccolti ogni 15 min. Raw valori generati da KAV può quindi essere rappresentati graficamente o ulteriormente analizzati utilizzando più complesso statistica si avvicina a16.
Cinque grafici raffiguranti i valori medi della struttura di rete da tre esperimenti separati sono indicati per un singolo campione semplice (UC) ed i tre campioni GDM (Figura 4). Il campione di UC in questi esperimenti effettuato similmente ai precedentemente analizzato UC campioni16. In precedenza, è stato identificato che ECFC vasculogenesi in vitro è bi-fasico, che consiste della fase 1 (0 - 5 h) e fase 2 (5-10 h)16. Questo modello è costante negli studi attuali, come evidenziato dal grafico raffigurante dati rete chiusa (Figura 4). Il campione UC formato un maggior numero di reti chiuse rispetto a tutti e tre i campioni GDM. È interessante notare che, tre dei quattro campioni sembrano avere un momento simile al numero massimo di reti chiuse, che si verifica tra 2,5 e 3 ore. Tuttavia, il campione di GDM2 era più lento raggiungere massimale reti chiuse, che si sono verificati 5 ore post-placcatura. E, nonostante l'esempio GDM2 formando reti massimale meno rispetto al campione di UC, le reti di che forma sono state mantenute allo stesso modo al campione UC nel corso del tempo. Al contrario, GDM1 e GDM3, che formano reti meno rispetto al campione di UC, inoltre hanno esibito una riduzione globale della rete numero nel corso del tempo. Nel complesso, dal grafico che raffigura il numero di rete chiusa, è evidente che tutti i campioni di ECFC visualizzato un modello bi-fasico di formazione della rete, tuttavia il numero massimo delle reti raggiunto il tasso di formazione varia con i campioni.
Area di rete rappresenta l'area medio all'interno delle reti chiuse formata dalle ECFCs. Di conseguenza, maggiore numero rete chiusa, il più piccolo le aree di rete. Questo modello si riflette nei grafici di zona di rete dove il campione UC, che ha formato un numero maggiore di reti chiuse, ha avuto più piccole zone di rete nel tempo rispetto ai tre campioni GDM (Figura 4). GDM2, che ha raggiunto il massimi reti chiuse più lentamente, ha esibito la zona alta rete inizialmente, tuttavia l'area stabilizzata nel tempo e questo era più simile al campione UC a 15 ore. Nel corso del tempo, la superficie media della rete in tutti i campioni aumentata dovuto de-stabilizzazione rete. Tuttavia, alcuni campioni, come GDM1 e GDM3, hanno esibito un aumento più rapido nell'area di rete, che è probabilmente indicativo di stabilità in diminuzione rispetto ad altri campioni che esibiscono un aumento più graduale.
GDM-esposti ECFCs esibiscono stabilità di rete ridotto Il rapporto dei rami ai nodi è un fenotipo novello calcolato di KAV e identificato nei nostri studi precedenti, e questo è indicativo di connettività di rete16. Nello studio corrente, il campione UC ha avuto un rapporto basso, che ha rappresentato un alto livello di connettività di rete che è stata mantenuta nel tempo (Figura 4). Per contro, i tre campioni GDM ha avuto un più alto rapporto dei rami ai nodi, soprattutto nella fase 2 di formazione della rete. Questa osservazione dimostra de-stabilizzazione di strutture di rete e connettività ridotta.
Nel complesso, GDM1 formato meno nodi e rami rispetto ad altri esempi, con la riduzione mantenuta nel corso dell'esperimento. GDM2 e GDM3 formato e mantenuto un maggior numero di rami rispetto al campione di UC, soprattutto tra 5-15 h. I numeri dei nodi rilevati nelle reti GDM2 e GDM3 erano più simili al numero di nodi nel campione UC, soprattutto tra 10-15 h. Un maggior numero di rami, ma un simile numero di nodi, ha potuto rappresentare il ramo maggiore rapporto tra nodo evidente intervalli di tempo successivi nei campioni di GDM. D'importanza, modifiche simultanee nel ramo e nodo numero possono essere difficili da interpretare in grafici separati. Tuttavia, il romanzo ramo al rapporto di nodo offre un modo per valutare come i cambiamenti, tra cui lievi modifiche difficile da rilevare nei grafici singoli, di ramo e il nodo numero, provocare connettività di rete alterata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg"> Figura 1 : Disegno schematico che illustra 10 parametri quantificati da analisi cinetica di vasculogenesi (KAV). KAV quantitates dieci parametri distinti della struttura di rete. Tutti i parametri sono codificati per colore e descritta nello schema numerico (1-10). I parametri includono il numero di reti di filiali (verde, 1), chiusi (blu, 2) e nodi (rosso, 3), media di rete (arancione, 4), il numero di strutture di rete (nero, 5), triple-ramificati nodi (giallo, 6) e quad-ramificati (viola, 7), così come il totale (9) e media lunghezza del ramo (10) e il rapporto tra il numero di rami per il numero di nodi (10). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg"> Figura 2 : Analisi cinetica di vasculogenesi (KAV) quantitates struttura rete. (A) scheletro e maschera interpretazioni delle strutture di rete identificate da KAV utilizzando fase contrasto immagini forniscono una rappresentazione visiva delle strutture di rete individuati e quantificati da KAV. Barra della scala = 500 µm. (B) un'immagine di contrasto di fase rappresentativa della post-placcatura di ECFC reti 10 h con basso contrasto e griglia segna da cuciture singole immagini insieme. Metodi di soglia diversi, come media o Otsu, selezionabili nel KAV plug-in per migliorare l'accuratezza di quantificazione, se immagini di contrasto di fase hanno un basso contrasto o gridding si verifica. Rappresentazioni di scheletro e maschera dell'immagine di contrasto di fase sono mostrati per metodi di soglia media sia Otsu. Immagini di contrasto di fase sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo 10x. Barra della scala = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg"> Figura 3 : L'esposizione intrauterina GDM altera la formazione del reticolo ECFC. Immagini di formazione della rete ECFC furono catturati a intervalli di 15 min per 15 h di microscopia di contrasto di fase. Immagini di contrasto di fase rappresentativa con incrementi di 5 h, a partire dal momento di placcatura (0,5 h), sono indicati per il UC e tre campioni di GDM. Immagini di contrasto di fase sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo 10x. Barra della scala = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg"> Figura 4 : ECFCs esposto alla cinetica di formazione rete di intrauterina GDM espositivo alterato. ECFCs sono stati ottenuti da una gravidanza semplice (UC, nero) e tre gravidanze complicate da diabete mellito gestazionale (rosso di 1-3, GDM). Immagini di contrasto di fase vennero catturati a 15 min intervalli per 15 h. software di analisi cinetica di vasculogenesi (KAV) quantificato chiusi reti, rete aree, rami, nodi e il rapporto dei rami ai nodi. I dati illustrati rappresentano la media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti separati per ciascun campione. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg"> Video 1: L'esposizione intrauterina GDM altera la cinetica di formazione di rete ECFC. Immagini di formazione della rete ECFC furono catturati a intervalli di 15 min per 15 h di microscopia di contrasto di fase. Immagini di contrasto di fase sono indicati per il UC e tre campioni di GDM oltre 15 h a partire da 0,5 h. La barra della scala rappresenta 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Immagine</td>
			<td>Totale ramo reti</td>
			<td>Nodi</td>
			<td>Triple</td>
			<td>Quadruple</td>
			<td>Rami</td>
			<td>Lunghezza totale ramo *</td>
			<td>Ramo di medio lunghezza *</td>
			<td>Ramo di nodo rapporto</td>
			<td>Reti chiuse</td>
			<td>Zona di rete * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2.72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1.94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>55V</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1,86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="11">* arrotondato al più vicino micron, * * arrotondato al più vicino micron ^ 2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Rappresentante dati grezzi da formazione immagine di uno studiano per un campione ECFC.

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di time-lapse e analisi di vasculogenesi in vitro usando accoppiata con il software open source, analisi cinetica di vasculogenesi di microscopia di contrasto di fase. Questo protocollo può essere applicato per valutare quantitativamente il potenziale vasculogenic di numerosi tipi cellulari o condizioni sperimentali che modellano la malattia vascolare.

Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è quello di visualizzare e quantificare il processo dinamico della vasculogenesi nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'angiogenesi e della vasculogenesi sui tassi di formazione dei vasi e sulle differenze tra i modelli strutturali di rete formati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione di un gran numero di punti temporali della vasculogenesi, fornendo l'opportunità di valutare la cinetica del processo vasculogenico.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi popolazione cellulare o stato patologico che influisce sui processi di vasculogenesi o angiogenesi per lo studio di singole popolazioni cellulari o sistemi di co-coltura. Circa una o due ore prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare un incubatore per microscopio a 37 gradi Celsius e impostare l'anidride carbonica al 5% e l'umidità all'85%Riempire il serbatoio di umidità dell'incubatore se è vuoto. Posizionare la camera delle cellule vive sul microscopio, quindi posizionare un vetrino vuoto in una delle due posizioni aperte all'interno della camera delle cellule vive.Riempire il vetrino con acqua distillata e impostare un ventilatore secondario a 39-42 gradi Celsius per riscaldare i vetrini dal basso e ridurre al minimo la condensa. Mantenere la temperatura e l'umidità adeguate all'interno della camera di imaging delle cellule vive è fondamentale per il successo dell'esperimento. Aggiungere una seconda diapositiva come spazio vuoto fino a quando non è possibile aggiungere la diapositiva sperimentale.Quindi, aggiungere acqua ai serbatoi che circondano i pozzi sul secondo vetrino per imitare le condizioni durante l'esperimento di imaging. Per caricare il vetrino della camera sperimentale con la matrice della membrana basamentale, caricare prima una pipetta da 20 microlitri con una punta fredda da 20 microlitri e utilizzare le forbici per tagliare a circa un centimetro dall'estremità della punta. Impostare il volume della pipetta su un valore leggermente superiore a 10 microlitri e aspirare lentamente la matrice nel puntale della pipetta modificato.Posizionare immediatamente la punta della pipetta al centro di un pozzetto, toccando delicatamente la punta con il fondo del pozzetto, e premere lentamente lo stantuffo per spingere la matrice verso l'esterno. Dopo aver aggiunto la matrice a tutti i 15 pozzetti, spingere il coperchio fino in fondo sul vetrino. Il pipettaggio accurato e coerente dei volumi Matrigel in ciascun pozzetto è fondamentale per ottenere immagini a contrasto di fase di alta qualità.Quindi, posizionare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti accanto a un tappo conico da 50 millilitri riempito con due o tre millilitri di PBS per ridurre la disidratazione della matrice. Quando la matrice si è solidificata, rimuovere il surnatante da una coltura cellulare endoteliale che forma colonie endoteliali coltivata durante la notte e lavare le cellule con sette millilitri di PBS. Aspirare il lavaggio PBS e staccare le cellule con due o tre millilitri di tripsina a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti.Quindi, risospendere le cellule dissociate in tre millilitri di Endothelial Growth Medium-2 per rompere eventuali grumi di cellule e trasferire la sospensione cellulare risultante in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo che tutti i campioni di cellule formanti colonie endoteliali sono stati risospesi, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in uno o due millilitri di terreno di crescita endoteliale fresco. Contare il numero di cellule vitali in ciascun campione e aggiungere un numero sufficiente di cellule formanti colonie endoteliali in una nuova provetta da 1,5 millilitri per consentire la diluizione delle cellule a 1,4 volte 10 per le quarte cellule per 175 microlitri di media concentrazione.Quindi, miscelare ogni master mix con un pipettaggio delicato. Rimuovere il coperchio del vetrino e versare 50 microlitri di ciascuna miscela master per pozzetto in triplice copia sul vetrino. Per visualizzare le cellule, sostituire il vetrino vuoto con un vetrino sperimentale e aggiungere acqua ai serbatoi che circondano le celle sul vetrino.Scorrere ogni posizione della fase e confermare che il centro del primo pozzetto sia selezionato. Concentrati sulle celle piastrate nel pozzetto e imposta la posizione Z del palco. Quando le impostazioni sono accurate, spegnere le luci per iniziare l'esperimento di imaging.Al termine dell'imaging, ridimensionare ed esportare i file dello stack di immagini all'interno del software Image Capture, salvando le immagini come file TIFF per l'analisi. Per analizzare le immagini, trascinare il file dell'analisi cinetica della vasculogenesi dalla relativa cartella nella barra grigia nella parte inferiore della finestra del software per aprire il software e fare clic su Salva per aggiungere il software all'elenco. Fare clic su File e apri per selezionare il file immagine da aprire oppure trascinare il file immagine sulla barra grigia all'interno del software.Fare clic su Immagine, Regola e Luminosità/Contrasto per aprire la finestra Luminosità/Contrasto. Fare clic su Ripristina nella finestra Luminosità/Contrasto per visualizzare l'immagine. Quindi, fai clic su Immagine, Tipo e 8 bit per convertire le immagini in 8 bit.Selezionate Strumenti e Gestione regione di interesse, quindi utilizzate uno strumento di selezione di forma appropriata per creare una nuova area di interesse. Fare clic su Aggiungi per aggiungere la forma Regione di interesse alla finestra Gestione area di interesse e fare clic sull'etichetta Regione di interesse in Gestione area di interesse per visualizzare la regione sull'immagine. Regolare l'area di interesse in base alle esigenze.Quando l'area è in posizione, fai clic su Immagine, quindi su Ritaglia per ritagliare l'immagine. Quindi, apri il menu Modifica e seleziona Cancella esterno per eliminare i dati dell'immagine al di fuori dell'area di interesse per ogni immagine nella pila. Quindi, apri il menu Plugin e seleziona il plug-in Analizza rete.Utilizzare la freccia a discesa nella finestra popup per modificare il metodo di soglia e fare clic su OK per avviare l'elaborazione del software. Al termine dell'analisi, si aprirà una tabella di dati e una pila di immagini fuse che raffigurano le rappresentazioni di Skeleton e Mask. Fare clic su File e Salva con nome per trasferire i valori numerici in un foglio di calcolo e salvare il foglio di calcolo contenente i valori dei dati non elaborati.Fare clic sull'immagine Scheletro e Maschera fusi e salvare la pila di immagini Skeleton Mask fusa e la pila di immagini a contrasto di fase ritagliata come file TIFF. Quindi, fai clic sulla finestra Gestione regione di interesse, seleziona la regione di interesse utilizzata per ritagliare le immagini e fai clic su Altro e Salva per salvare la regione di interesse per un uso futuro. Le reti cellulari endoteliali che formano colonie, identificate mediante analisi cinetica della vasculogenesi, sono rappresentate pittoricamente come rappresentazioni di scheletro e maschera per illustrare le strutture utilizzate dal software per la quantificazione.Quando la qualità delle immagini a contrasto di fase è elevata e si ottiene un contrasto sufficiente, l'analisi cinetica della vasculogenesi identificherà accuratamente le reti cellulari che formano colonie endoteliali, come indicato dalle somiglianze osservate tra l'immagine a contrasto di fase e le rappresentazioni dello scheletro e della maschera generate dall'analisi cinetica della vasculogenesi. Se le immagini a contrasto di fase non hanno un contrasto elevato o se si verificano artefatti di imaging come il gridding, l'accuratezza del rilevamento della rete si riduce e i risultati diventano ambigui. Tuttavia, è possibile selezionare diversi metodi di soglia, come Media e Otsu, mostrati qui, prima dell'analisi nel menu a discesa del software per adattarsi alle differenze nella qualità dell'immagine.Utilizzando l'analisi cinetica della vasculogenesi per determinare se le cellule formanti colonie endoteliali esposte al diabete mellito gestazionale mostrano una cinetica alterata della formazione della rete rivela una formazione della struttura della rete eterogeneamente alterata nelle colture di diabete mellito gestazionale rispetto alle colture cellulari formanti colonie endoteliali da una gravidanza senza complicazioni. In effetti, i campioni di gravidanza non complicata formano in genere un numero maggiore di reti chiuse rispetto ai campioni di diabete mellito gestazionale. Tutti i campioni di cellule formanti colonie endoteliali, tuttavia, mostrano un modello bifasico di formazione della rete nel complesso, sebbene i tassi di formazione e il numero massimo di reti raggiunte varino tra i campioni.Seguendo questa procedura, i valori dei dati generati dall'Analisi Cinetica della Vascolarizzazione possono essere rappresentati graficamente e analizzati per determinare se le strutture di rete formate dai diversi campioni sono statisticamente diverse e, in caso affermativo, in quali punti temporali. L'analisi cinetica della vasculogenesi consente l'elaborazione efficiente di esperimenti time-lapse che coinvolgono un gran numero di immagini. Una volta padroneggiate, l'acquisizione, la post-elaborazione e l'analisi delle immagini possono essere completate in due giorni se tutti i sistemi funzionano correttamente.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Questa carta presenta una procedura completa per valutare in vitro in esistenza l'angiogenesi del tumore classico nel hemangioblastomas (HBs) e del suo ruolo in HBs. I risultati evidenziare la complessità della HB-neovascolarizzazione e suggeriscono che questa forma comune dell'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB-neovascolarizzazione.

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

L'angiogenesi da germoglio, fondamentale per lo sviluppo e la malattia, coinvolge complessi processi molecolari e meccanici. Presentiamo un versatile modello ex vivo 2.5D che analizza la germinazione cellulare dalle arterie carotidi suine, rivelando l'angiogenesi rigida-dipendente e la distinta meccanica delle cellule leader-follower. Questo modello aiuta a far progredire le strategie di ingegneria tissutale e gli approcci alla terapia del cancro.

Modello 2.5D per la caratterizzazione meccanica ex vivo dell'angiogenesi da germogliamento in tessuto vivente

Scopri l'analisi cinetica della vasculogenesi per studiare la formazione dei vasi sanguigni in vitro con cellule endoteliali. Questo metodo quantitativo consente di valutare la cinetica della vasculogenesi in diverse condizioni sperimentali.

Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

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