Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è quello di visualizzare e quantificare il processo dinamico della vasculogenesi nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'angiogenesi e della vasculogenesi sui tassi di formazione dei vasi e sulle differenze tra i modelli strutturali di rete formati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione di un gran numero di punti temporali della vasculogenesi, fornendo l'opportunità di valutare la cinetica del processo vasculogenico.

Questo metodo può essere applicato a qualsiasi popolazione cellulare o stato patologico che influisce sui processi di vasculogenesi o angiogenesi per lo studio di singole popolazioni cellulari o sistemi di co-coltura. Circa una o due ore prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare un incubatore per microscopio a 37 gradi Celsius e impostare l'anidride carbonica al 5% e l'umidità all'85%Riempire il serbatoio di umidità dell'incubatore se è vuoto. Posizionare la camera delle cellule vive sul microscopio, quindi posizionare un vetrino vuoto in una delle due posizioni aperte all'interno della camera delle cellule vive.

Riempire il vetrino con acqua distillata e impostare un ventilatore secondario a 39-42 gradi Celsius per riscaldare i vetrini dal basso e ridurre al minimo la condensa. Mantenere la temperatura e l'umidità adeguate all'interno della camera di imaging delle cellule vive è fondamentale per il successo dell'esperimento. Aggiungere una seconda diapositiva come spazio vuoto fino a quando non è possibile aggiungere la diapositiva sperimentale.

Quindi, aggiungere acqua ai serbatoi che circondano i pozzi sul secondo vetrino per imitare le condizioni durante l'esperimento di imaging. Per caricare il vetrino della camera sperimentale con la matrice della membrana basamentale, caricare prima una pipetta da 20 microlitri con una punta fredda da 20 microlitri e utilizzare le forbici per tagliare a circa un centimetro dall'estremità della punta. Impostare il volume della pipetta su un valore leggermente superiore a 10 microlitri e aspirare lentamente la matrice nel puntale della pipetta modificato.

Posizionare immediatamente la punta della pipetta al centro di un pozzetto, toccando delicatamente la punta con il fondo del pozzetto, e premere lentamente lo stantuffo per spingere la matrice verso l'esterno. Dopo aver aggiunto la matrice a tutti i 15 pozzetti, spingere il coperchio fino in fondo sul vetrino. Il pipettaggio accurato e coerente dei volumi Matrigel in ciascun pozzetto è fondamentale per ottenere immagini a contrasto di fase di alta qualità.

Quindi, posizionare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti accanto a un tappo conico da 50 millilitri riempito con due o tre millilitri di PBS per ridurre la disidratazione della matrice. Quando la matrice si è solidificata, rimuovere il surnatante da una coltura cellulare endoteliale che forma colonie endoteliali coltivata durante la notte e lavare le cellule con sette millilitri di PBS. Aspirare il lavaggio PBS e staccare le cellule con due o tre millilitri di tripsina a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti.

Quindi, risospendere le cellule dissociate in tre millilitri di Endothelial Growth Medium-2 per rompere eventuali grumi di cellule e trasferire la sospensione cellulare risultante in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo che tutti i campioni di cellule formanti colonie endoteliali sono stati risospesi, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in uno o due millilitri di terreno di crescita endoteliale fresco. Contare il numero di cellule vitali in ciascun campione e aggiungere un numero sufficiente di cellule formanti colonie endoteliali in una nuova provetta da 1,5 millilitri per consentire la diluizione delle cellule a 1,4 volte 10 per le quarte cellule per 175 microlitri di media concentrazione.

Quindi, miscelare ogni master mix con un pipettaggio delicato. Rimuovere il coperchio del vetrino e versare 50 microlitri di ciascuna miscela master per pozzetto in triplice copia sul vetrino. Per visualizzare le cellule, sostituire il vetrino vuoto con un vetrino sperimentale e aggiungere acqua ai serbatoi che circondano le celle sul vetrino.

Scorrere ogni posizione della fase e confermare che il centro del primo pozzetto sia selezionato. Concentrati sulle celle piastrate nel pozzetto e imposta la posizione Z del palco. Quando le impostazioni sono accurate, spegnere le luci per iniziare l'esperimento di imaging.

Al termine dell'imaging, ridimensionare ed esportare i file dello stack di immagini all'interno del software Image Capture, salvando le immagini come file TIFF per l'analisi. Per analizzare le immagini, trascinare il file dell'analisi cinetica della vasculogenesi dalla relativa cartella nella barra grigia nella parte inferiore della finestra del software per aprire il software e fare clic su Salva per aggiungere il software all'elenco. Fare clic su File e apri per selezionare il file immagine da aprire oppure trascinare il file immagine sulla barra grigia all'interno del software.

Fare clic su Immagine, Regola e Luminosità/Contrasto per aprire la finestra Luminosità/Contrasto. Fare clic su Ripristina nella finestra Luminosità/Contrasto per visualizzare l'immagine. Quindi, fai clic su Immagine, Tipo e 8 bit per convertire le immagini in 8 bit.

Selezionate Strumenti e Gestione regione di interesse, quindi utilizzate uno strumento di selezione di forma appropriata per creare una nuova area di interesse. Fare clic su Aggiungi per aggiungere la forma Regione di interesse alla finestra Gestione area di interesse e fare clic sull'etichetta Regione di interesse in Gestione area di interesse per visualizzare la regione sull'immagine. Regolare l'area di interesse in base alle esigenze.

Quando l'area è in posizione, fai clic su Immagine, quindi su Ritaglia per ritagliare l'immagine. Quindi, apri il menu Modifica e seleziona Cancella esterno per eliminare i dati dell'immagine al di fuori dell'area di interesse per ogni immagine nella pila. Quindi, apri il menu Plugin e seleziona il plug-in Analizza rete.

Utilizzare la freccia a discesa nella finestra popup per modificare il metodo di soglia e fare clic su OK per avviare l'elaborazione del software. Al termine dell'analisi, si aprirà una tabella di dati e una pila di immagini fuse che raffigurano le rappresentazioni di Skeleton e Mask. Fare clic su File e Salva con nome per trasferire i valori numerici in un foglio di calcolo e salvare il foglio di calcolo contenente i valori dei dati non elaborati.

Fare clic sull'immagine Scheletro e Maschera fusi e salvare la pila di immagini Skeleton Mask fusa e la pila di immagini a contrasto di fase ritagliata come file TIFF. Quindi, fai clic sulla finestra Gestione regione di interesse, seleziona la regione di interesse utilizzata per ritagliare le immagini e fai clic su Altro e Salva per salvare la regione di interesse per un uso futuro. Le reti cellulari endoteliali che formano colonie, identificate mediante analisi cinetica della vasculogenesi, sono rappresentate pittoricamente come rappresentazioni di scheletro e maschera per illustrare le strutture utilizzate dal software per la quantificazione.

Quando la qualità delle immagini a contrasto di fase è elevata e si ottiene un contrasto sufficiente, l'analisi cinetica della vasculogenesi identificherà accuratamente le reti cellulari che formano colonie endoteliali, come indicato dalle somiglianze osservate tra l'immagine a contrasto di fase e le rappresentazioni dello scheletro e della maschera generate dall'analisi cinetica della vasculogenesi. Se le immagini a contrasto di fase non hanno un contrasto elevato o se si verificano artefatti di imaging come il gridding, l'accuratezza del rilevamento della rete si riduce e i risultati diventano ambigui. Tuttavia, è possibile selezionare diversi metodi di soglia, come Media e Otsu, mostrati qui, prima dell'analisi nel menu a discesa del software per adattarsi alle differenze nella qualità dell'immagine.

Utilizzando l'analisi cinetica della vasculogenesi per determinare se le cellule formanti colonie endoteliali esposte al diabete mellito gestazionale mostrano una cinetica alterata della formazione della rete rivela una formazione della struttura della rete eterogeneamente alterata nelle colture di diabete mellito gestazionale rispetto alle colture cellulari formanti colonie endoteliali da una gravidanza senza complicazioni. In effetti, i campioni di gravidanza non complicata formano in genere un numero maggiore di reti chiuse rispetto ai campioni di diabete mellito gestazionale. Tutti i campioni di cellule formanti colonie endoteliali, tuttavia, mostrano un modello bifasico di formazione della rete nel complesso, sebbene i tassi di formazione e il numero massimo di reti raggiunte varino tra i campioni.

Seguendo questa procedura, i valori dei dati generati dall'Analisi Cinetica della Vascolarizzazione possono essere rappresentati graficamente e analizzati per determinare se le strutture di rete formate dai diversi campioni sono statisticamente diverse e, in caso affermativo, in quali punti temporali. L'analisi cinetica della vasculogenesi consente l'elaborazione efficiente di esperimenti time-lapse che coinvolgono un gran numero di immagini. Una volta padroneggiate, l'acquisizione, la post-elaborazione e l'analisi delle immagini possono essere completate in due giorni se tutti i sistemi funzionano correttamente.