Name: Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri come identificare connessioni monosinaptiche in Drosophila utilizzando canali di sodio resistenti alla tetrodotossina. Questo metodo elettrofisiologico rivela la natura chimica delle sinapsi nel lobo antennale.

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Vorremmo ringraziare Joshua Singer, Jonathan Schenk, come pure gli ospiti premurosi per i commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Ben White e Harold Zakon per discussioni sulla tecnica. Jonathan Schenk ha fornito i dati per la Figura 3A. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Whitehall e un R21 NIH al QG.

1. preparare mosche e identificare GAL4 promotore linee
<ol><li>Selezionare una linea di promotore GAL4 e attraversarlo con mosche che trasportano il transgene UAS-NaChBac sia un transgene optogenetica per l'attivazione. Nota: UAS-CsChrimson11 è selezionata a causa della sua alta conduttanza e la facilità con cui si attiva NaChBac-mediata dei potenziali di azione. UAS-NaChBac sia UAS-CsChrimson sono disponibili dal Repository di scorte di Bloomington.</li>
	<li>Preparare tutto-trans retinico come una soluzione in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a-20 ° C.</li>
	<li>µ L di mix 28 di questo stock in circa 5 mL di patata reidratata fiocco cibo e aggiungere questa miscela alla parte superiore di una fiala di convenzionale media della drosofila .</li>
	<li>Sollevare le mosche adulte esprimendo csChrimson sul cibo contenente 0,2 mM all-trans-retinale per 1 – 3 giorni11.</li>
</ol>2. preparare il brodo di TTX
<ol><li>Creare una soluzione di riserva di 1mm TTX in acqua distillata o deionizzata. Conservare questa soluzione in un frigorifero di laboratorio per diversi mesi. Controllare le politiche di istituzioni per quanto riguarda lo stoccaggio di TTX come molte istituzioni classificano TTX come una sostanza pericolosa o controllata.</li>
</ol>3. preparare mosche per elettrofisiologia
<ol><li>Raccogliere 1 – 3 giorni adulto anziano mosche che vengono generati sul cibo con all-trans-retinale. Nota: Consultare Murthy e Turner nel 2013 per una descrizione dettagliata della patch di bloccaggio della drosofila neuroni12,13.</li>
	<li>Mettere le mosche in una fialetta di scintillazione. Posizionare la fiala sul ghiaccio per 1 min immobilizzare le mosche.</li>
	<li>Utilizzare pinze grossolane per inserire una Mosca in una camera di registrazione su misura. La camera è costituito da un 3 ½" cerchio taglio laser da 1/16" acrilico. Taglio un foro ¾" è il centro cui è collegato un foglio personalizzato con epossidica a 2 componenti. La pellicola contiene un triangolare a forma di speranza che viene inserito al volo.</li>
	<li>Applicare cera o resina epossidica curabile UV intorno all'animale di fissare saldamente all'interno della camera di registrazione.</li>
	<li>Illuminare la preparazione con una fibra ottica a collo di cigno per la visualizzazione sotto un microscopio stereoscopico. Impostare le fibre a collo di cigno per illuminazione obliqua regolandoli in modo che essi illuminano al volo direttamente dal lato.</li>
	<li>Regolare il livello di luce al più basso possibile che ancora permette la chiara visualizzazione della Mosca. Questa intensità luminosa varierà da singoli esperimenti. Nota bene: Questo protocollo può essere adattato utilizzando un in situ cervello explant metodo14.</li>
	<li>Recuperare la registrazione esterna salino. La soluzione salina contiene in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (idrossimetil) metil-2-aminoethane-solfonici, 8 trealosio, glucosio 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2e 4 MgCl2 (regolata a mΩ 270 – 275). La soluzione salina viene fatto gorgogliare con 95% O25% CO2 (carbogen) e ha un pH regolato a 7,315.</li>
	<li>Posto 4-6 gocce di soluzione fisiologica registrazione extracellulare sopra la preparazione vola. A questo punto, aumentare il livello di luce al microscopio di dissezione per una migliore visibilità.</li>
	<li>Affilare un filo di tungsteno mediante elettrolisi. Per rendere il filo, preparare una soluzione satura di KNO3 e applicare circa 20 V di AC corrente mentre la punta del filo nella soluzione 20 volte per 100 ms ogni di immersione fino a quando la punta è nitida. Utilizzare il filo di tungsteno affilata per rimuovere la cuticola sulla testa al volo ed esponendo così il cervello.</li>
	<li>Inoltre espone il cervello rimuovendo la trachea e corpi grassi che lo circondano. Se l'accesso ai lobi antennali, utilizzare un filo di tungsteno piegato o un attrezzo simile per infilare delicatamente antenne sotto il foglio di registrazione camera per aumentare la visibilità. Utilizzare pinze taglienti per strappare delicatamente la guaina glial che copre l'area di interesse in cui verranno effettuate registrazioni.</li>
	<li>Trasferire la camera di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Immediatamente inizio perfusione con soluzione fisiologica registrazione esterna gorgogliare con carbogen per preservare il cervello. Il serbatoio di soluzione salina è posizionato sopra il tavolino del microscopio e gravità-è alimentato alla preparazione. Utilizzare una linea del vuoto e un matraccio di Erlenmeyer 2L per raccogliere le saline dei rifiuti.</li>
</ol>4. ottenere cellule intere registrazione
<ol><li>Tirare pipette patch un estrattore commerciale pipetta. Consultare il manuale per le impostazioni ottenere un'appropriato pipetta con una resistenza di punta vicino a 7 mΩ.</li>
	<li>Aggiungere 4 µ l di soluzione di registrazione interna in una pipetta patch. La soluzione salina interna è costituito da 140 potassio aspartato, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl in mM.</li>
	<li>Impostare il patch clamp amplificatore per registrazione di cellule intere. Zero offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Qui, viene utilizzato un amplificatore del morsetto di Patch dei sistemi AM 2.400.</li>
	<li>Applicare pressione positiva attraverso la pipetta e avvicinarsi alla cella. Utilizzare un micromanipolatore per indirizzare la pipetta e contattare la cella. Rilascio di pressione positiva. Insieme il potenziale della holding della membrana a -60 mV. La pipetta deve formare un sigillo gigaohm con membrana delle cellule come evidenziato da un sub-picoamp bassa corrente di tenuta. Nota: Se usando GFP guidato delle cellule il targeting, tenta di ridurre al minimo utilizzo della luce epifluorescente per impedire l'attivazione ChR2 e potenziale depressione sinaptica. Attendere alcuni minuti prima di applicare il passaggio 5.</li>
	<li>Impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova da -50 mV a -60 mV. Questa impostazione è standard su amplificatori di patch-clamp. Impulsi di prova rivelerà un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per ricaricare la pipetta di patch. Rimuovere capacitivi transitori regolando le manopole di compensazione di capacità su AM 2400 o simili amplificatore.</li>
	<li>Applicare brevi impulsi di pressione negativa a rottura della membrana cellulare e ottenere la configurazione di cellule intere. Nota: Una configurazione di cellule intere è osservata quando c'è un grande aumento nei transienti capacitivi che mostra la capacità del neurone. Un piccolo aumento della corrente di mantenimento (baseline) sarà probabilmente anche osservato. Impostare l'amplificatore corrente morsetto modalità e regolare il potenziale della cella a -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. Verifica della connettività sinaptica
<ol><li>Configurare il sistema di acquisizione dati per attivare un driver LED per generare impulsi di luce. Qui, un sistema DAQ di National Instruments è usato con Matlab per fornire un segnale analogico a un driver LED. L'intensità del LED è regolato tramite il segnale analogico per il driver. Il LED è una lunghezza d'onda di 620-630 nm LED.</li>
	<li>Posizionare il LED rosso ad alta potenza direttamente sotto la preparazione. Regolare l'intensità della luce in modo che 0,238 mW/mm2 raggiunge al volo.</li>
	<li>Attivare i neuroni presinaptici durante la registrazione dalla cellula postsinaptica di interesse. Raggiungere la cella attivazione optogenetically, pharmacogentically, o tramite la stimolazione del nervo. Qui, vengono applicati csChrimson e brevi impulsi di luce rossa. Nota: Connessioni sinaptiche possono essere monitorate sia in tensione oppure morsetto corrente come EPSPs come EPSC. Una connessione sinaptica dovrebbe essere visibile prima di applicare TTX in risposta ad un impulso di luce di 40 ms. Se nessuna connessione è osservata, è improbabile che i neuroni sono sinapticamente connessi sia mono - o polysynaptically. L'azienda potenziale può essere regolata per sottolineare le connessioni eccitatori o inibitori di conseguenza.</li>
	<li>Se una connessione è osservata in salino normale, aggiungere TTX per il sistema di perfusione per ottenere una concentrazione finale di 1 µM. utilizzare una pompa di ricircolo per acquisire e riutilizzare la soluzione fisiologica per conservare TTX. La pompa peristaltica sarà disegnare la soluzione salina dalla vasca e restituirlo al serbatoio salino.</li>
	<li>Regolare la velocità della pompa per fornire un forte vuoto costante che non consente tale livello salino nel bagno a salire e scendere. Nota: L'applicazione di TTX dovrebbe comportare la cessazione di chiodare l'attività nel neurone che viene monitorato in cellule intere. Questo conferma che abbastanza TTX è stato aggiunto per la soluzione fisiologica.</li>
	<li>Applicare di nuovo brevi impulsi di luce rossa (40 ms per ogni impulso). A questo punto, qualsiasi connessione sinaptica che rimane è probabile monosinaptica. Aggiungere farmacologici antagonisti per le saline a ricircolo per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche che rimangono in TTX. Nota: Quando si combinano optogenetica e targeting fluorescente dei neuroni, può essere importante non attivare con insistenza la popolazione presinaptica dei neuroni durante il tentativo di ottenere una registrazione. Questo può portare alla depressione sinaptica e rende difficile vedere le connessioni. Perché csChrimson ha una banda di eccitazione lunga che si estende in linea di massima nella gamma della proteina fluorescente verde, un fluoroforo rosso può essere utilizzato per visualizzare i neuroni e channel2rhodopsin (Ch2R) possono essere usati per eccitare le popolazioni delle cellule. Questa operazione richiede specifica genetica e un cubo di filtro personalizzato. Per generare mosche adatti, è possibile rendere mosche che esprimono il fluoroforo rosso (RFP o mCherry) nell'ambito dei sistemi di espressione binaria sistema LexA o Q. Questi dovranno essere incrociate con le mosche che esprimono un promotore Gal4 e geni effettori UAS-Ch2R e UAS-NaChBac. Il cubo di filtro ottimale per epifluorescenza avrà una gamma stretta di eccitazione per eccitare il fluoroforo rosso, ma non eccitare Ch2R. Inoltre, il set di filtri deve includere un filtro di emissione di passaggio lungo per raccogliere più luce emessa. Abbiamo usato un filtro personalizzato impostato da Chroma che comprendeva parte numeri et580/25 x e t600lpxr (dal set 49306), ma con un filtro di barriera/emissione di et610lp.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Analisi TERPS complimenti attuale tecniche utilizzate per circuito cracking attivando il rilevamento delle sinapsi tra neuroni identificati. In particolare, l'approccio rivela connessioni monosinaptica largamente silenziamento potenziali di azione con TTX durante il ripristino di eccitabilità in una popolazione di seleziona dei neuroni con il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac. Rilascio sinaptico è tratta da stimolo optogenetica mentre eventi postsinaptici sono monitorati con cellule intere registrazioni. TERPS si ...

Degli obiettivi principali delle neuroscienze è quello di mappare le connessioni tra i neuroni a comprendere il fluiscono di informazioni attraverso circuiti. Numerosi approcci e risorse sono diventati disponibili per testare la connettività funzionale tra neuroni in una gamma di sistemi modello1,2. Per generare gli schemi di collegamento più precisi utilizzando elettrofisiologia, è importante risolvere se osservate connessioni tra due cellule sono diretti e monosinaptica versus indiretto e polisinaptici. Un gold standard per fare questa distinzione nei neuroni dei mammiferi è di misurare la latenza tra singolo action potentials nelle cellule presinaptiche e l'insorgenza di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) nel secondo neurone. Monosinaptica connessioni dovrebbero avere brevi latenze di pochi millisecondi e bassa variabilità3. Questo approccio può essere complicato in neuroni invertebrati poiché sinapsi possono verificarsi nel loro dendriti lontano dal sito di registrazione somatico, causando ritardi nel rilevamento a causa di distanze lungo elettrotoniche tra conduttanze postsinaptiche e la registrazione elettrodo. Tali ritardi possono introdurre ambiguità riguardo poli-versus monosinaptici contributi. Inoltre, piccoli eventi sinaptici può decadere prima di raggiungere il sito di registrazioni somatiche e guidano l'attività presinaptica più forte, è probabili reclutare polisinaptici eventi.
Varie tecniche sono state sviluppate per verificare le connessioni monosinaptica negli invertebrati. Un approccio utilizza soluzioni alta catione bivalente (Hi-Di) che contengono in eccesso Mg ++ e Ca+ +. Questa soluzione blocca le connessioni polisinaptici di riduzione probabilità di rilascio e crescente potenziale di azione soglia per favorire il rilevamento di monosinaptica ingresso4,5. Determinare il rapporto preciso di Mg Ca ++ ++ necessaria, tuttavia, non è banale e polisinaptici contributi possono persistere per stimolazione anche modesto6. Un approccio alternativo chiamato GFP ricostituzione attraverso partner sinaptica (stretta) sfrutta la vicinanza tra membrane pre- e postsinaptiche trovato alle sinapsi di dedurre una connessione monosinaptica 7. Qui, un componente della proteina fluorescente verde (GFP) è espresso in un neurone, e il frammento complementare della molecola è espressa in un presunto partner postsinaptico. La presenza di fluorescenza indica che i due neuroni sono nelle vicinanze per consentire la ricostituzione della molecola GFP e implica l'esistenza di una sinapsi. STRETTA può segnalare sinapsi falsamente, però, se due cellule strettamente hanno apposto membrane, come in un nervo o fascicolo. Varianti di impugnare eliminano tali falsi positivi tramite il tethering il frammento presinaptico della GFP direttamente alla sinaptobrevina, permettendo così la ricostituzione solo alle sinapsi attivo8. Mentre stretta e le sue varianti sono stati strumentali nel determinare la connettività funzionale in Drosophila CNS, alcuni collegamenti potrebbero non essere reso visibili da afferrare se le distanze tra i partner di pre- e postsinaptici è relativamente grande. Questo è particolarmente pertinente nella valutazione della trasmissione volume associato neuromodulation9 o di inibizione GABAergica10.
Qui, una tecnica complementare e romanzo è dimostrata per test connessioni dirette monosinaptica in Drosophila CNS. Questo metodo, chiamato tetrodotossina Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS), opera di co-espressione di tetrodotossina (TTX)-canale del sodio resistente, NaChBac e un attivatore di optogenetica in una cellula presinaptica durante la registrazione da presunti postsinaptica partner9. In presenza di TTX, tutte le attività di potenziale di azione-mediata è soppressa in cellule diverse da quelle che esprimono NaChBac. Il canale di NaChBac Ripristina selettivamente eccitabilità nelle celle presinaptiche mirate, permettendo la trasmissione sinaptica luce-evocati. Questo metodo consente la forte attivazione dei neuroni presinaptici, tale che le connessioni possono essere risolti postsynaptically registrando somatico, riducendo la probabilità di reclutamento circuiti polisinaptici. D'importanza, questa tecnica permette lo studio della trasmissione di volume e rivela la diffusione del trasmettitore liberato da un singolo neurone in tutto un circuito. Inoltre, TERPS può rivelare la natura chimica della connessione attraverso farmacologia convenzionale. TERPS è adatto ad uso in qualsiasi sistema di modello che permette l'espressione transgenica dei canali del sodio TTX-insensibile.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Utilizzato come attivatore neurale</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores eccitabilità nelle cellule in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotossina</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Potrebbe essere necessaria un'autorizzazione speciale per l'acquisto di TTX in quanto è una sostanza controllata</td></tr><tr><td>tutta trans-retinica</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Richiede co-fattore per la canalrodopsina</td></tr><tr><td>Acciaio inossidabile 321 saldabile&nbsp; Foglio,&nbsp; 0,002"&nbsp; Spesso,&nbsp; 10"&nbsp; </td><td>Largo McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Utilizzato per realizzare portamosche personalizzato. La pellicola personalizzata può essere tagliata al laser a pololu.com dal file PDF fornito</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Utilizzato per la dissezione della preparazione</td></tr><tr><td>Cera</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Utilizzato durante la dissezione per fissare la mosca in lamina</td></tr><tr><td>Cera di paraffina</td><td>Joann</td><td></td><td>4917217 Utilizzato con la</td></tr><tr><td>ceratrice Numero 5 pinze</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>#5CO</td><td>Utilizzato per la dissezione e la guaina</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>15001-08</td><td>Utilizzato per rimuovere parti della cuticola durante la dissezione</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Utilizzare con l'elettrolisi per realizzare aghi affilati per la dissezione</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica circolante</td><td>Pompe semplicemente (Amazon)</td> <td>PM200S</td><td>per il ricircolo TTX</td></tr><tr><td>Regolatore di velocità per pompa peristaltica</td><td>Zitrades (Amazon)</td> <td>N / A</td> Controller dimmer <td>PWM per luci a LED o nastro, 12 Volt 8 Amp, interruttore luce a luminosità regolabile Dimmer Controller DC12V 8A 96W per striscia luminosa a led B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; Regolatore di aria compressa di precisione</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Per l'applicazione di una pressione positiva durante il patching</td></tr><tr><td>Capilari in vetro</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Per pipette per patch</td></tr><tr><td>Manometro multiuso</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Manometro per regolatore</td></tr><tr><td>di pressione Elettrofisiologia Camera</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Qualsiasi telecamera che funzioni nella gamma IR (850 nm) funzionerà. Non si desidera utilizzare l'illuminazione rossa in quanto ciò può attivare csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>Per fibra ottica di illuminazione obliqua</td></tr><tr><td>per IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Coppie a IR</td></tr><tr><td>LED Obiettivo lente&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Può essere utilizzato sulla maggior parte delle microscienze e funziona bene per la visualizzazione dei neuroni delle mosche.</td></tr><tr><td>LED ambra</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>Per la visualizzazione di RFP e</td></tr><tr><td>mCherry Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Per la visualizzazione del</td>set di filtri GFP</tr><tr><td></td><td>GFP Chroma</td><td>49011</td><td>Per la visualizzazione di GFP o la stimolazione del canale2rodopsina</td></tr><tr><td>Set di filtri mCherry personalizzato</td><td>Chroma</td><td>&nbsp; ET580/25X e T600LPXR (dal set 49306) ma con un'ottica di barriera/emissione ET610LP</td><td>Utilizzare solo se si desidera applicare patch ai neuroni identificati con channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic per combinare LED ambra e blu</td><td>Thorlabs DMLP550R</td><td></td><td>Utilizzare solo il cerotto sotto mCherry ed eccitare channel2rhodopsin con luce blu.</td></tr><tr>LED <td>rossi</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Utilizzato per pilotare csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Utilizzato per pilotare LED per stimolazione optogenetica</td></tr><tr><td>Manipolatore</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Utilizzato per posizionare la pipetta durante le registrazioni</td></tr><tr><td>Amplificatore Patchclamp</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 2400</td><td>È adatto</td></tr> <tr>un amplificatore equivalente<td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Filtro ausiliario utilizzato per filtrare la traccia di corrente all'oscilloscopio durante il patching.</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>Utilizzato per registrare dati dall'amplificatore al computer</td></tr><tr><td>Blocco connettore - Terminale BNC BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Utilizzato per collegare l'amplificatore alla scheda DAQ.</td></tr><tr><td>Lamina d'acciaio&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Lamina d'acciaio per camera di registrazione personalizzata</td></tr><tr><td>Magneti</td><td>K& J Magnetics</td><td>D42</td><td>Per fissare la camera di registrazione al supporto ad anello</td></tr><tr><td>1/16" Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Utilizzato per realizzare una camera di registrazione personalizzata. L'acrilico può essere tagliato al laser con pololu.com dal file PDF fornito</td></tr></tbody></table>

esaminando monosinaptica connessioni in drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Qui, una nuova tecnica chiamata Tetrotoxin (TTX) Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS) viene applicata per verificare monosinaptica connessioni tra i neuroni bersaglio. Il metodo si basa sulla co-espressione di un attivatore transgenico con il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac, in un neurone presinaptico specifico. Connessioni con presunto partner post-sinaptico sono determinate dalle cellule intere registrazioni in presenza di TTX, che blocca l'attività elettrica nei neuroni che non esprimono NaChBac. Questo approccio può essere modificato per funzionare con qualsiasi attivatore o l'imaging del calcio come un reporter di connessioni. TERPS aggiunge il set crescente di strumenti disponibili per determinare la connettività all'interno di reti. Tuttavia, TERPS è unico in quanto segnala anche attendibilmente massa o volume trasmissione e trasmissione di spillover.

TERPS è utilizzato per distinguere tra mono - e polisinaptici contributi in connessioni sinaptiche tra i neuroni. Mentre la stimolazione debole di una cella può essere utilizzata per verificare le connessioni dirette, guidando una maggiore attività presinaptiche spesso reclute polisinaptici connessioni (Figura 1A). TERPS funziona cheesprimono il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac e un attivatore di optogenetica e test delle connessioni in presenza di TT...

Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.

Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è identificare elettrofisiologicamente le connessioni monosinaptiche nella drosofila utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina. I principali vantaggi di questa tecnica è che è semplice e può rivelare la natura chimica delle sinapsi. È adatto anche per lo studio del volume o della trasmissione di massa.Generalmente, nei video nuovi a questo metodo, facciamo fatica a causa della difficoltà della dissezione. Comprendendo semplicemente il metodo, tuttavia, la logica è facilmente trasferibile ad altri sistemi modello come i topi. Per le registrazioni, avere pipette patch per la resistenza vicino a sette megaohm.Inoltre, avere una soluzione salina di registrazione esterna con un pH di 7,3 o inferiore aerata continuamente con carbogeno contenente il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Per i soggetti, avere un ceppo mosca che esprime csChrimson, propagante su alimenti contenenti 0,2 millimolari di tutti i trans-retinici. Per le registrazioni, selezionare adulti di età compresa tra uno e tre giorni.Caricali in una fiala di vetro a scintillazione e immobilizzala utilizzando un'esposizione di un minuto a condizioni di ghiaccio freddo. Quindi, abbassare il livello di luce sul cannocchiale da dissezione e sulle pinze grossolane per caricare una mosca anestetizzata nella camera di registrazione su misura. Fissare la mosca alla camera circondandola con cera o resina epossidica polimerizzabile UV.Posizionalo con il lato dorsale rivolto verso l'alto con la lamina all'incirca a metà del torace. La chiave per ottenere un'ottima preparazione è avere il foro tagliato nella lamina per essere della giusta dimensione, in modo che la mosca non venga schiacciata né possa cadere. Illumina la preparazione con luci a fibra ottica da entrambi i lati e mantienile il più deboli possibile.Quindi, coprire la preparazione con quattro o sei gocce di soluzione salina per registrazione. Quindi, affilare il filo o il filamento di tungsteno per la dissezione. Applicare circa 20 volt di corrente alternata a una soluzione satura di nitrato di potassio e immergere ripetutamente la punta del filo molto rapidamente nella soluzione.Dopo 20 immersioni, la punta sarà affilata. Ora, regola le luci in modo da fornire una visibilità sufficiente per utilizzare il filo affilato per esporre il cervello rimuovendo la cuticola, seguita dalla trachea e dai corpi adiposi. Per accedere ai lobi dell'antenna, utilizzare un filo di tungsteno piegato per infilare delicatamente l'antenna sotto la protezione in alluminio.Quindi utilizzare una pinza affilata per strappare delicatamente la guaina gliale che copre l'area di interesse. Ora trasferisci la preparazione sul rig di elettrofisiologia per effettuare le registrazioni. Al rig, iniziare immediatamente a perfondere la preparazione con soluzione fisiologica, bollata con carbogena.Utilizzare un serbatoio di soluzione salina alimentato a gravità posizionato sopra il tavolino del microscopio. Per raccogliere la soluzione salina di scarto, utilizzare una linea sottovuoto e un pallone da 2 litri. Quindi, caricare la pipetta per cerotti con 4 microlitri di soluzione di registrazione interna e collegare la pipetta a un micromanipolatore.Quindi, azzerare l'offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Quindi, regolare l'illuminazione obliqua IR per ottenere una visione chiara del cervello. Ora, mentre si applica una pressione positiva alla pipetta, avvicinarsi alla cella con la pipetta.Quando si entra in contatto con la cellula, rilasciare la pressione positiva per sigillare la pipetta alla membrana. Quindi, impostare il potenziale di tenuta della membrana a meno 60 millivolt. E la pipetta dovrebbe formare un sigillo gigaohm con la membrana cellulare.La corrente di mantenimento dovrebbe scendere a un livello inferiore di sub-picoamp. Per ottenere sigilli gigaohm costanti, assicurarsi di mantenere pulita la pipetta mantenendo una pressione positiva ed evitare di colpire i tessuti o avvicinarsi alle cellule. Per procedere, impostare l'amplificatore in modo che fornisca impulsi di prova da meno 50 a meno 60 millivolt.Gli impulsi di prova riveleranno un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per caricare la pipetta patch. Per rimuovere la transitorietà capacitiva, regolare le manopole di compensazione della capacità sull'amplificatore. Ora, applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e ottenere l'intera configurazione cellulare.Un forte aumento della transitorietà capacitiva indica il successo. Va osservato anche un piccolo aumento della corrente di mantenimento. Quindi, impostare l'amplificatore in modalità pinza amperometrica.E regolare il potenziale della cella tra meno 50 e meno 60 millivolt. In preparazione, configurare il sistema di acquisizione dati come indicato nel protocollo tecnico. Il sistema richiede un LED rosso ad alta potenza posizionato sotto il preparato, posizionato per illuminare la mosca a 0,238 milliwatt per millimetro quadrato.Ora, attiva i neuroni presinaptici optogeneticamente, utilizzando la luce rossa pulsata nell'espressione di csChrimson. Possono essere utilizzati anche altri metodi. Prima di applicare la tetrodotossina, dovrebbe essere visibile una connessione sinaptica in risposta a un impulso luminoso di 40 millisecondi.Nessuna risposta significa che una connessione è improbabile. Il potenziale di tenuta può essere regolato per enfatizzare le connessioni eccitatorie o inibitorie, di conseguenza. Una volta verificata la connessione, impostare la profusione salina per il ricircolo presso la soluzione salina.Impostare la pompa in modo che il livello di soluzione salina nella vasca rimanga stabile. Quindi, aggiungere abbastanza tetrodotossina al sistema per una concentrazione finale di un micromolare. Questo dovrebbe fermare l'attività di spiking del neurone rattoppato.In caso contrario, aggiungere altra tetrodotossina al sistema. Ora, applica brevi impulsi di luce rossa per attivare quella che probabilmente sarà una connessione monosinaptica. Quindi, procedere con l'aggiunta di antagonisti farmacologici alla soluzione salina ricircolante per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche.L'espressione transgenica della tetrodotossina nella tacca sensibile del canale del sodio ripristina l'eccitabilità nei neuroni e si traduce in un ampio potenziale di plateau. Gli interneuroni nel lobo antennale rispondono agli odori. Tuttavia, le correnti post-sinaptiche eccitatorie non sono facilmente risolvibili al soma.Quindi, le risposte derivano direttamente dall'input dei neuroni del recettore olfattivo? L'uso dei tERP rivela che i neuroni del recettore olfattivo creano connessioni dirette con gli interneuroni locali. La stimolazione dei neuroni serotoninergici nel lobo antennale provoca una miscela di eccitazione e inibizione negli interneuroni locali.L'applicazione di metisergide, un ampio antagonista del recettore 5HT, ha bloccato una lenta iperpolarizzazione, ma non ha avuto alcun effetto sulla depolarizzazione, mentre la mecamilamina blocca la rapida depolarizzazione. Ciò suggerisce che la stimolazione è colinergica. Il tERPs è stato utilizzato per risolvere la trasmissione del volume extrasinaptico che si verifica con GABA o neuromodulatori.In un esempio, l'applicazione della tetrodotossina non ha soppresso un segnale inibitorio nell'interneurone locale. Questa inibizione è stata bloccata utilizzando l'antagonista della serotonina, la metisergide, suggerendo un segnale diretto da uno specifico neurone serotoninergico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere registrazioni di intere cellule dai neuroni della drosofila e valutare la loro conduttività utilizzando i tERP.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti e praticare ripetutamente la difficile dissezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la farmacologia per rispondere a ulteriori domande come la natura della sinapsi chimica.Non dimenticare che lavorare con la tetrodotossina può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare guanti e lavorare con piccoli volumi.

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Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Questa procedura utilizza una luce blu-attivati ​​canali delle cellule algali e strumenti specifici per l'espressione genetica di evocare i potenziali sinaptici con impulsi di luce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ)...

Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

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Test di connessioni monosinaptiche utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina e alla tetrodotossina

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