Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

L'obiettivo generale di questa tecnica è identificare elettrofisiologicamente le connessioni monosinaptiche nella drosofila utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina. I principali vantaggi di questa tecnica è che è semplice e può rivelare la natura chimica delle sinapsi. È adatto anche per lo studio del volume o della trasmissione di massa.

Generalmente, nei video nuovi a questo metodo, facciamo fatica a causa della difficoltà della dissezione. Comprendendo semplicemente il metodo, tuttavia, la logica è facilmente trasferibile ad altri sistemi modello come i topi. Per le registrazioni, avere pipette patch per la resistenza vicino a sette megaohm.

Inoltre, avere una soluzione salina di registrazione esterna con un pH di 7,3 o inferiore aerata continuamente con carbogeno contenente il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Per i soggetti, avere un ceppo mosca che esprime csChrimson, propagante su alimenti contenenti 0,2 millimolari di tutti i trans-retinici. Per le registrazioni, selezionare adulti di età compresa tra uno e tre giorni.

Caricali in una fiala di vetro a scintillazione e immobilizzala utilizzando un'esposizione di un minuto a condizioni di ghiaccio freddo. Quindi, abbassare il livello di luce sul cannocchiale da dissezione e sulle pinze grossolane per caricare una mosca anestetizzata nella camera di registrazione su misura. Fissare la mosca alla camera circondandola con cera o resina epossidica polimerizzabile UV.

Posizionalo con il lato dorsale rivolto verso l'alto con la lamina all'incirca a metà del torace. La chiave per ottenere un'ottima preparazione è avere il foro tagliato nella lamina per essere della giusta dimensione, in modo che la mosca non venga schiacciata né possa cadere. Illumina la preparazione con luci a fibra ottica da entrambi i lati e mantienile il più deboli possibile.

Quindi, coprire la preparazione con quattro o sei gocce di soluzione salina per registrazione. Quindi, affilare il filo o il filamento di tungsteno per la dissezione. Applicare circa 20 volt di corrente alternata a una soluzione satura di nitrato di potassio e immergere ripetutamente la punta del filo molto rapidamente nella soluzione.

Dopo 20 immersioni, la punta sarà affilata. Ora, regola le luci in modo da fornire una visibilità sufficiente per utilizzare il filo affilato per esporre il cervello rimuovendo la cuticola, seguita dalla trachea e dai corpi adiposi. Per accedere ai lobi dell'antenna, utilizzare un filo di tungsteno piegato per infilare delicatamente l'antenna sotto la protezione in alluminio.

Quindi utilizzare una pinza affilata per strappare delicatamente la guaina gliale che copre l'area di interesse. Ora trasferisci la preparazione sul rig di elettrofisiologia per effettuare le registrazioni. Al rig, iniziare immediatamente a perfondere la preparazione con soluzione fisiologica, bollata con carbogena.

Utilizzare un serbatoio di soluzione salina alimentato a gravità posizionato sopra il tavolino del microscopio. Per raccogliere la soluzione salina di scarto, utilizzare una linea sottovuoto e un pallone da 2 litri. Quindi, caricare la pipetta per cerotti con 4 microlitri di soluzione di registrazione interna e collegare la pipetta a un micromanipolatore.

Quindi, azzerare l'offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Quindi, regolare l'illuminazione obliqua IR per ottenere una visione chiara del cervello. Ora, mentre si applica una pressione positiva alla pipetta, avvicinarsi alla cella con la pipetta.

Quando si entra in contatto con la cellula, rilasciare la pressione positiva per sigillare la pipetta alla membrana. Quindi, impostare il potenziale di tenuta della membrana a meno 60 millivolt. E la pipetta dovrebbe formare un sigillo gigaohm con la membrana cellulare.

La corrente di mantenimento dovrebbe scendere a un livello inferiore di sub-picoamp. Per ottenere sigilli gigaohm costanti, assicurarsi di mantenere pulita la pipetta mantenendo una pressione positiva ed evitare di colpire i tessuti o avvicinarsi alle cellule. Per procedere, impostare l'amplificatore in modo che fornisca impulsi di prova da meno 50 a meno 60 millivolt.

Gli impulsi di prova riveleranno un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per caricare la pipetta patch. Per rimuovere la transitorietà capacitiva, regolare le manopole di compensazione della capacità sull'amplificatore. Ora, applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e ottenere l'intera configurazione cellulare.

Un forte aumento della transitorietà capacitiva indica il successo. Va osservato anche un piccolo aumento della corrente di mantenimento. Quindi, impostare l'amplificatore in modalità pinza amperometrica.

E regolare il potenziale della cella tra meno 50 e meno 60 millivolt. In preparazione, configurare il sistema di acquisizione dati come indicato nel protocollo tecnico. Il sistema richiede un LED rosso ad alta potenza posizionato sotto il preparato, posizionato per illuminare la mosca a 0,238 milliwatt per millimetro quadrato.

Ora, attiva i neuroni presinaptici optogeneticamente, utilizzando la luce rossa pulsata nell'espressione di csChrimson. Possono essere utilizzati anche altri metodi. Prima di applicare la tetrodotossina, dovrebbe essere visibile una connessione sinaptica in risposta a un impulso luminoso di 40 millisecondi.

Nessuna risposta significa che una connessione è improbabile. Il potenziale di tenuta può essere regolato per enfatizzare le connessioni eccitatorie o inibitorie, di conseguenza. Una volta verificata la connessione, impostare la profusione salina per il ricircolo presso la soluzione salina.

Impostare la pompa in modo che il livello di soluzione salina nella vasca rimanga stabile. Quindi, aggiungere abbastanza tetrodotossina al sistema per una concentrazione finale di un micromolare. Questo dovrebbe fermare l'attività di spiking del neurone rattoppato.

In caso contrario, aggiungere altra tetrodotossina al sistema. Ora, applica brevi impulsi di luce rossa per attivare quella che probabilmente sarà una connessione monosinaptica. Quindi, procedere con l'aggiunta di antagonisti farmacologici alla soluzione salina ricircolante per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche.

L'espressione transgenica della tetrodotossina nella tacca sensibile del canale del sodio ripristina l'eccitabilità nei neuroni e si traduce in un ampio potenziale di plateau. Gli interneuroni nel lobo antennale rispondono agli odori. Tuttavia, le correnti post-sinaptiche eccitatorie non sono facilmente risolvibili al soma.

Quindi, le risposte derivano direttamente dall'input dei neuroni del recettore olfattivo? L'uso dei tERP rivela che i neuroni del recettore olfattivo creano connessioni dirette con gli interneuroni locali. La stimolazione dei neuroni serotoninergici nel lobo antennale provoca una miscela di eccitazione e inibizione negli interneuroni locali.

L'applicazione di metisergide, un ampio antagonista del recettore 5HT, ha bloccato una lenta iperpolarizzazione, ma non ha avuto alcun effetto sulla depolarizzazione, mentre la mecamilamina blocca la rapida depolarizzazione. Ciò suggerisce che la stimolazione è colinergica. Il tERPs è stato utilizzato per risolvere la trasmissione del volume extrasinaptico che si verifica con GABA o neuromodulatori.

In un esempio, l'applicazione della tetrodotossina non ha soppresso un segnale inibitorio nell'interneurone locale. Questa inibizione è stata bloccata utilizzando l'antagonista della serotonina, la metisergide, suggerendo un segnale diretto da uno specifico neurone serotoninergico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere registrazioni di intere cellule dai neuroni della drosofila e valutare la loro conduttività utilizzando i tERP.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti e praticare ripetutamente la difficile dissezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la farmacologia per rispondere a ulteriori domande come la natura della sinapsi chimica.

Non dimenticare che lavorare con la tetrodotossina può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare guanti e lavorare con piccoli volumi.