Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

L'obiettivo generale di questo approccio è quello di valutare direttamente la funzione respiratoria delle cellule beta pancreatiche, in condizioni di stimolazione insulinica. Questo può anche essere utilizzato per osservare l'effetto di diversi composti sulla funzione respiratoria delle cellule beta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia delle cellule beta pancreatiche, ad esempio se un determinato composto influisce sulla funzione delle cellule beta pancreatiche attraverso cambiamenti nella respirazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per valutare direttamente la funzione respiratoria nelle cellule beta pancreatiche, in condizioni di stimolazione basale e insulinica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione delle cellule e di utilizzo della macchina sono difficili da imparare, a causa della precisione richiesta nella preparazione delle cellule e nella misurazione della respirazione. Per iniziare, colture di cellule beta 832/13 derivate da INS-1 in RPMI 1640 integrato.

Estrarre le cellule da un pallone T75, aggiungendo due millilitri di tripsina allo 0,25% e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina aggiungendo otto millilitri di supporto RPMI 1640 completo. Diluire 100 microlitri del volume cellulare in 900 microlitri di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Quindi, piastrate le cellule a una densità di un milione di cellule per millilitro, in un piatto di 10 centimetri. Coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, prima di iniziare gli esperimenti di respirazione. Cambiare il terreno 24 ore dopo la piastratura e la coltura delle cellule 832/13 in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Quindi, trattare le cellule con veicolo di controllo o derivato dal cacao, epicatechina monomero, per una concentrazione finale di 100 nanomolari. Seguire l'aggiunta del trattamento con coltura per altre 24 ore in un incubatore umidificato, a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Quindi, lavare le cellule in 1 tampone di test a bassa secrezione di glucosio, o SAB, per cinque minuti.

Aspirare il tampone e incubare le cellule in 1x SAB a basso contenuto di glucosio per tre ore, cambiando il tampone ogni ora. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla capsula con un millilitro di tripsina allo 0,25%. Combinare le cellule di tripsina della capsula trattata con il controllo del veicolo, con quattro millilitri di SAB in una provetta conica da 15 millilitri.

Allo stesso modo, unire il piatto trattato con il composto di interesse, con un tampone. Diluire 100 microlitri del volume cellulare in 900 microlitri di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Diluire 100 microlitri del volume cellulare in 900 microlitri di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

I dati dimostrano che una concentrazione di un milione di cellule per millilitro è la più efficace. Dopo aver preparato il respirometro ad alta risoluzione come descritto nel protocollo di testo, aggiungere 2,4 millilitri di tampone SAB a basso contenuto di glucosio 1x in ciascuna camera dell'ossigrafo. Agitare continuamente il tampone utilizzando ancorette magnetiche nella camera a 750 giri/min e 37 gradi Celsius, con un intervallo di registrazione dei dati di 2,0 secondi.

A tale scopo, selezionare il pulsante F7 e aprire la scheda con l'etichetta sistemi. Spingere gli stantuffi fino in fondo e quindi ritrarli fino all'impostazione di aerazione della chiave. Lasciare equilibrare la macchina per almeno un'ora fino a ottenere un flusso di ossigeno stabile.

Quindi, imposta la macchina a 37 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento. Premi il pulsante F7 e apri la linguetta etichettata, Ossigeno O2, per impostare la tensione di polarizzazione a 800 millivolt con un guadagno di due. Equilibrare la concentrazione di ossigeno del tampone SAB per almeno 30 minuti, fino a quando la variazione della concentrazione di ossigeno è stabile.

Quindi, selezionare una regione in cui la variazione della concentrazione di ossigeno è stabile per stabilire la misurazione in background della variazione della concentrazione di ossigeno, premendo il tasto Maiusc, facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinando il mouse sulla regione selezionata. Fare clic sulla lettera associata alla regione selezionata e modificarla in R1 per ogni traccia corrispondente a ciascuna delle due camere. Fare doppio clic sulla casella di calibrazione O2 negli angoli in basso a sinistra e a destra dello schermo.

Fare clic sul pulsante Seleziona contrassegno per la calibrazione dell'aria come R1, quindi selezionare calibra e copia negli appunti per entrambe le camere. Successivamente, caricare 2,4 millilitri di campione in ciascuna camera, caricando una camera con le cellule trattate con il veicolo di controllo e una camera con le cellule trattate con composti in 1x SAB a basso contenuto di glucosio. Spingere lo stantuffo fino in fondo e aspirare il volume residuo.

Agitare continuamente le cellule durante l'esperimento a 750 giri/min e 37 gradi Celsius per tutti i passaggi successivi. Crea un segno facendo clic su F4 ed etichettando il segno come celle quando vengono caricati i campioni. Misurare i campioni per 30 minuti.

Dopo la stabilizzazione del segnale, selezionare una regione della variazione della concentrazione di ossigeno corrispondente alle condizioni di basso glucosio. Quindi, aggiungere 12,5 microlitri di una soluzione di glucosio sterile al 45% in ciascuna camera attraverso la porta di caricamento in titanio utilizzando una siringa. Fare un segno etichettato glucosio, quando viene aggiunto il trattamento.

Lasciare che il segnale si stabilizzi e registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un flusso di ossigeno stabile. A questo punto, selezionare la regione della variazione della concentrazione di ossigeno per rappresentare la lettura del glucosio di 16,7 millimolari, che corrisponde alle condizioni stimolatorie. Dopo aver raggiunto la stabilizzazione del segnale, aggiungere un microlitro di oligomicina A da cinque millimolari in ciascuna camera attraverso la porta di caricamento.

Tracciare un segno etichettato, OligoA, quando viene aggiunto il trattamento. Lasciare che il segnale si stabilizzi e registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un flusso di ossigeno stabile. Una volta raggiunto un flusso di ossigeno stabile, selezionare quest'area della curva.

L'oligomicina A inibisce l'ATP sintasi e quindi l'unico flusso di ossigeno che si verifica è attraverso la perdita di elettroni e non la fosforilazione ossidativa. Successivamente, aggiungere un millimolare FCCP con incrementi di un microlitro fino a stabilire una frequenza respiratoria massima. Questo rappresenta la massima respirazione non accoppiata.

Tra tre e quattro microlitri di FCCP sono sufficienti per indurre la massima respirazione disaccoppiata delle cellule beta 832/13 derivate da INS-1. Fai un segno etichettato, FCCP quando viene aggiunto il trattamento. Lasciare che il segnale si stabilizzi e registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un flusso di ossigeno stabile.

Quindi, selezionare quest'area della curva. FCCP è un agente disaccoppiante, che consente la misurazione della respirazione disaccoppiata. Dopo aver raggiunto la stabilizzazione del segnale, aggiungere un microlitro di antimicina A da cinque millimolari in ciascuna camera attraverso la porta di caricamento.

Tracciare un segno etichettato, AntiA, quando viene aggiunto il trattamento e ripetere la procedura di selezione della curva. Inserire il numero di cellule per millilitro utilizzate nel saggio, premendo il pulsante F3 del programma di analisi del respirometro. Cambia le unità in celle per millilitro, inserisci la concentrazione cellulare e cambia il mezzo in SAB.

Selezionare le letture di sfondo per normalizzare i dati selezionando e inserendo il modulo di calibrazione dell'ossigeno. Effettuare selezioni di letture tra 2,5 millimolari di glucosio, 16,7 millimolari di glucosio, oligomicina A, FCCP e antimicina A.All'interno del programma di analisi del respirometro, inserire la concentrazione proteica e selezionare i valori medi appropriati per ciascun trattamento durante la misurazione della respirazione. Quindi, fare clic su F2 e fare clic sulla funzione di copia negli appunti.

In questo modo vengono esportati i dati per l'utilizzo in altri programmi di analisi. Utilizzare i valori negativi della pendenza O2 per i calcoli. Compilare i dati per tre o cinque esecuzioni indipendenti di controlli trattati con veicolo e cellule trattate con composti naturali per determinare l'effetto sulla respirazione cellulare intatta delle cellule beta 832/13 derivate da INS-1.

Le cellule beta 832/13 intatte derivate da INS-1 dimostrano un aumento dell'utilizzo dell'ossigeno indotto dal glucosio. È fondamentale che venga utilizzato il numero appropriato di celle. I risultati raccolti in questo esperimento dimostrano che un milione di cellule per millilitro è la quantità ottimale.

Le cellule beta 832/13 derivate da INS-1 trattate con curcumina non mostrano alcun cambiamento nella respirazione complessiva. Al contrario, le cellule beta 832/13 derivate da INS-1 trattate con epicatechine monomeriche di cacao avevano un aumento della respirazione a 2,5 millimolari di glucosio e 16,7 millimolari di glucosio. L'aumento della respirazione si osserva anche durante lo stato di perdita, che è lo stato respiratorio basale e non fosforilante, così come la respirazione del sistema di trasporto degli elettroni o lo stato ETS, che è la respirazione massima.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare direttamente la funzione respiratoria delle cellule beta pancreatiche in condizioni di stimolazione insulinica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pretrattare le cellule con un tampone SAB a basso contenuto di glucosio e ottenere una conta cellulare accurata per il test.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a ottenere la giusta quantità di cellule per misurazioni efficaci. Con troppe celle, il segnale è difficile da valutare e con troppo poche, il segnale non è abbastanza alto per essere misurato in modo coerente. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi del diabete e di qualsiasi condizione influenzata da cambiamenti nella funzione delle cellule beta pancreatiche, perché la respirazione mitocondriale è una componente fondamentale del funzionamento della secrezione di insulina.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la secrezione di insulina stimolata dal glucosio per rispondere a ulteriori domande, ad esempio, qual è l'effetto di questi composti sulla secrezione di insulina? Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione delle cellule beta, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le analisi respiratorie muscolari, epatiche, adipose e altre analisi respiratorie mitocondriali.