Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione
3 maggio 2018
Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.
L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare i cambiamenti nella sintesi dell'RNA mediante marcatura della bromouridina e immunoprecipitazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo dell'RNA misurando se un cambiamento nei livelli di RNA è causato da cambiamenti nella sintesi dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata su qualsiasi tipo di coltura cellulare preferita e i materiali utilizzati sono facilmente accessibili.
Per iniziare il protocollo, seminare da 3,5 volte 10 al sesto HEK293T cellule in una capsula di Petri di 10 centimetri in 10 millilitri di terreno di crescita per ottenere un totale di oltre 40 microgrammi di RNA dopo l'estrazione 48 ore dopo. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2,48 ore dopo la semina, aspirare otto millilitri di terreno di crescita e lasciare due millilitri per evitare che le cellule si secchino. Aggiungere due millimoli di bromouridina e trattamento al terreno di crescita e rimuovere i due millilitri residui dalle cellule prima di riapplicare gli otto millilitri di bromouridina contenenti terreno di crescita.
Quindi, incubare le cellule per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in cinque millilitri di tampone di Hank e tripsinizzare le cellule con due millilitri di tripsina allo 0,05% per cinque minuti. Aggiungere otto millilitri di terreno di coltura per fermare la reazione, trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri e far girare le cellule per due minuti a 1.000 volte g.
Quindi, rimuovere il surnatante ed estrarre l'RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un kit di isolamento dell'RNA ed eluire l'RNA in acqua priva di RNasi. Questa tecnica è molto sensibile ed è quindi importante lavorare con RNA di alta qualità. L'estrazione dell'RNA è quindi una fase fondamentale, ma è anche facilmente eseguibile con i kit di estrazione dell'RNA di oggi.
Preparare le perle in un unico lotto per il numero di campioni da esaminare più un extra per tenere conto delle perdite durante il pipettaggio e la miscelazione a vortice. Risospendere accuratamente le microsfere magnetiche IgG anti-topo mediante miscelazione a vortice ed estrarre 20 microlitri di perle per campione in una provetta da 1,5 millilitri priva di RNasi. Posizionare il tubo da 1,5 millilitri in un supporto magnetico per 20 secondi in modo che le perline si raccolgano lateralmente.
Rimuovere il surnatante, estrarre la provetta dal supporto magnetico e risospendere le perle in 40 microlitri di tampone IP-bromouridina once once times mediante pipettaggio. Centrifugare la provetta per due secondi in una centrifuga da tavolo, riposizionarla nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Quindi, bloccare il legame non specifico alle perline usando l'eparina.
Risospendere le perle in un millilitro di bromouridina-IP una volta più un milligrammo per millilitro di tampone eparina e ruotare la provetta per 30 minuti. Quindi, lava le perline una volta. Risospendere le perle in un millilitro di tampone bromouridina-IP una volta e aggiungere 1,25 microgrammi per campione di anticorpo anti-alfa-bromodeossiuridina.
Incubare le perle per un'ora ruotandole. Dopo l'incubazione, lavare le perle tre volte. Risospendere le perle lavate in 50 microlitri per campione di tampone bromouridina-IP una tantum integrato con un millimolare di bromouridina e lasciare le perle in rotazione per 30 minuti.
Dopo la rotazione, lavare le perle tre volte e risospendere le perle in 50 microlitri per campione di tampone bromouridina-IP una tantum. Misurare le concentrazioni di RNA negli estratti di RNA utilizzando la spettrofotometria ultravioletto-visibile e diluire 40 microgrammi di RNA da ciascun campione in acqua priva di RNasi fino a un volume totale di 200 microlitri. Dopo aver denaturato l'RNA per due minuti a 80 gradi Celsius, centrifugare brevemente i campioni in una centrifuga da tavolo.
Dopo la centrifuga, aggiungere 200 microlitri di bromouridina-IP due volte più BSA, inibitore della RNasi. Quindi, aggiungere 50 microlitri di perle risospese e preparate a ciascun campione e ruotare i campioni per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare le perle quattro volte.
Risospendere le perle in 200 microlitri di tampone di eluizione per eluire l'RNA e aggiungere rapidamente 200 microlitri di fenolo a pH 6,6 per rimuovere eventuali molecole non RNA dal campione. Agitare il campione per mescolarlo e farlo girare per tre minuti a 25.000 volte g in una centrifuga da tavolo. Successivamente, aspirare la maggior parte possibile della fase superiore, circa 190 microlitri, e spostarla in una provetta con 200 microlitri di fenolo-cloroformio a pH 6,6.
Assicurarsi di aspirare la stessa quantità tra i campioni. Agitare il campione e farlo girare. Dopo la centrifuga, eseguire l'estrazione del cloroformio aspirando la fase acquosa superiore, circa 180 microlitri, e trasferirla in una provetta contenente 200 microlitri di cloroformio.
Ruotare e quindi far girare il campione. Aspirare la fase acquosa superiore, circa 170 microlitri, e trasferirla in una provetta contenente 17 microlitri di acetato di sodio a pH tre molari e sei per neutralizzare e precipitare l'RNA dalla soluzione acquosa. Successivamente, aggiungi due microlitri di glicogeno, che precipiterà con l'RNA e renderà il pellet più visibile.
Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 96% per aumentare il legame tra gli ioni salino e l'RNA e mescolare capovolgendo il tubo un paio di volte. Lasciare il tubo per una notte a meno 20 gradi Celsius o per 15 minuti su ghiaccio secco. Centrifugare il campione refrigerato, scartare il surnatante senza disturbare il pellet e lavare il pellet in 185 microlitri di etanolo al 75% per rimuovere eventuali residui di sale.
Quindi, centrifugare il campione a 25.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare completamente il surnatante senza disturbare il pellet e lasciare asciugare il pellet per cinque-10 minuti con il coperchio aperto. Risospendere il pellet in 10 microlitri di acqua priva di RNasi applicata sul lato del tubo per evitare di disturbare il pellet.
Le cellule AsPC-1 sono state trattate con bromouridina per zero, una, due e 4,5 ore, seguite dall'estrazione dell'RNA totale e dalla bromouridina-IP. GAS5 e GAPDH sono stati misurati nell'RNA bromouridina-IP, che ha dimostrato che un'ora di marcatura era sufficiente per raggiungere un cambiamento di nove e 44 volte rispetto al fondo. Due millimoli di trattamento con bromouridina non hanno indotto alcun cambiamento morfologico nelle cellule HEK293T né per un'ora né per il trattamento più lungo di quattro ore.
L'inibizione di PLK-2 ha causato un aumento dell'mRNA dell'alfa-sinucleina sia nell'input che nella bromouridina-IP, suggerendo che l'aumento dell'RNA allo stato stazionario è causato da un aumento della sintesi dell'RNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare l'RNA appena sintetizzato con la bromouridina ed eseguire una successiva immunoprecipitazione della bromouridina e dell'RNA marcato.
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Panoramica
Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi dell'RNA mediante marcatura con bromouridina e immunoprecipitazione. Aiuta a determinare se le variazioni nei livelli di RNA sono dovute a modifiche nella sintesi dell'RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Metabolismo dell'RNA
- Tecniche di coltura cellulare
- Analisi quantitativa
Sfondo
- La sintesi dell'RNA è un processo fondamentale per la funzione cellulare.
- Il bromouridina è un analogo dei nucleosidi utilizzato per l'etichettatura dell'RNA.
- L'immunoprecipitazione consente l'isolamento dell'RNA marcato.
- Questa tecnica è applicabile a diversi tipi cellulari.
Scopo dello studio
- Misurare le variazioni nella sintesi dell'RNA.
- Studiare la relazione tra i livelli di RNA e le velocità di sintesi.
- Utilizzare un metodo accessibile e adattabile a diverse colture cellulari.
Metodi Utilizzati
- Sezionare cellule HEK293T in una piastra di Petri.
- Incorporare bromouridina nel mezzo di crescita.
- Estrarre l'RNA dopo un periodo di incubazione definito.
- Eseguire l'immunoprecipitazione e analizzare l'RNA mediante PCR quantitativa.
Risultati principali
- Incorporazione con successo di bromouridina nell'RNA sintetizzato.
- Misurazione quantitativa della sintesi dell'RNA ottenuta.
- Dimostrata l'applicabilità del metodo in diversi tipi cellulari.
- Fornite informazioni sulle dinamiche del metabolismo dell'RNA.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per lo studio della sintesi dell'RNA.
- Può contribuire a chiarire i meccanismi del metabolismo dell'RNA.
- L'uso di materiali e tecniche accessibili ne aumenta l'utilità nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione diretta della sintesi dell'RNA mediante etichettatura con 5-bromouridina e immunoprecipitazione consente ai team del settore biofarmaceutico di distinguere tra produzione trascrizionale e degradazione dell'RNA, un punto critico nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico. Questo approccio supporta una previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta, chiarificando se le variazioni osservate nei livelli di RNA siano dovute a modifiche nei tassi di sintesi. La compatibilità del metodo con diversi sistemi cellulari e con analisi quantitative successive ne accresce l'applicabilità a livello di portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione diretta dell'attività trascrizionale per la validazione funzionale di bersagli.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistica distinguendo le variazioni dell'RNA guidate dalla sintesi da quelle guidate dal degrado.
- Facilita la previsione affidabile negli studi di modulazione del percorso e di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara letture di sintesi dell'RNA validate per flussi di lavoro quantitativi successivi.
- Permette la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso passaggi definiti di marcatura e immunoprecipitazione.
- Supporta lo screening su larga scala degli effetti di composti sulla produzione di RNA in diversi tipi cellulari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie consentendo la misurazione della sintesi di RNA in vari sistemi cellulari.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica supportando l'analisi quantitativa di biomarcatori.
- Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate chiarificando i meccanismi trascrizionali alla base dei cambiamenti fenotipici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un'analisi diretta della sintesi dell'RNA, sostenendo sia la verifica delle ipotesi sia l'analisi quantitativa.
- Biologia della scoperta: Chiarisce se la modulazione del bersaglio influisce sulla produzione o stabilità dell'RNA, fornendo informazioni per l'analisi del percorso.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sulla sintesi dell'RNA, adatti alla valutazione di composti.
- Analisi: Permette analisi qPCR e sequenziamento a valle per una misurazione accurata dell'RNA appena sintetizzato.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori misurando la sintesi di RNA rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro ampiamente applicabile per lo studio del metabolismo dell'RNA in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione della sintesi dell'RNA mediante reagenti e protocolli accessibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione chiarificando i meccanismi trascrizionali fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio distinguendo le variazioni dell'RNA guidate dalla sintesi da quelle guidate dalla degradazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA e nelle tecniche di immunoprecipitazione.
- Necessita dell'accesso a colture cellulari, immunoprecipitazione basata su microsferette magnetiche e piattaforme analitiche quantitative.
- Richiede un rigoroso controllo della qualità dell'RNA per garantire riproducibilità e sensibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per RNA sintetizzati lentamente o degradati rapidamente a causa delle brevi finestre di marcatura.
- I limiti pratici includono la possibile sottorappresentazione di alcune specie di RNA in base alla cinetica di sintesi e degradazione.
