Name: Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Scopri come misurare la sintesi di RNA mediante etichettatura con bromouridina e immunoprecipitazione. Questo metodo permette di determinare se le variazioni dei livelli di RNA sono dovute a cambiamenti nella sintesi.

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La Fondazione di Lundbeck, Università di Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s sostenuto questo lavoro.

Nota: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente indicato e mantenere buffer su ghiaccio o in frigo (tranne dall'eluizione di tampone contenente SDS). Il protocollo è diviso in 5 sezioni: esempi di preparazione di RNA; preparazione di perline per IP; associazione del RNA BrU-etichettati per perline; eluizione e purificazione di RNA BrU-etichettati associato di estrazione del fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi; analisi di RNA (in questo esempio usando RT-qPCR)
1. preparazione dei campioni di RNA
<ol><li>Conteggio HEK293T cellule utilizzando una cella automatizzata del contatore e seme 3.500.000 cellule in una capsula Petri 10 cm in media di crescita 10ml (Medium dell'Aquila per volta di Dulbecco supplementato con 10% siero fetale di vitello e 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina) per ottenere un totale di > 40 µ g di RNA dopo l'estrazione 48 ore più tardi. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>48 h dopo la semina, aspirare media di sviluppo di 8 mL e 2 mL si lasci alle spalle per evitare l'essiccamento fuori le cellule. Aggiungete 2 mM BrU e qualsiasi trattamento a 8 mL aspirato mezzi di sviluppo e rimuovere il residuo mL 2 dalle cellule prima di riapplicare il 8ml BrU contenenti terreni di coltura. Evitare l'uso dei mezzi freschi su richiesta del BrU, le cellule, poiché questo può indurre cambiamenti nell'espressione genica.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 h con BrU e trattamento. Lavare le cellule nel buffer di 5ml Hank e tripsinizzano le cellule con tripsina 0.05% 2 mL. Aggiungere 8 mL crescita media per fermare la reazione, trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e rotazione verso il basso le cellule per 2 min a 1.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante ed estrarre RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un isolamento di RNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro metodo preferito ed eluire privo di RNasi H2O. Store il RNA a-80 ° C fino al momento di procedere.</li>
</ol>2. preparazione di perline per IP
<ol><li>Preparare perline in lotti per il numero di campioni di essere studiato più uno extra per rappresentare perdita durante il pipettaggio e vortice di miscelazione. Risospendere le microsfere magnetiche di IgG anti-topo accuratamente mescolando il vortice e prendere 20 perle µ l per campione in una provetta da 1,5 mL RNAsi-libera. Posto la provetta da 1,5 mL in un supporto magnetico e lasciare circa 20 s per le perline per raccogliere sul lato.</li>
	<li>Eliminare il surnatante, estrarre il tubo dal supporto magnetico e risospendere in 400 µ l 1 x BrU-IP tampone pipettando. Girare il tubo molto brevemente per 2 s in una centrifuga di tavolo, inserirlo nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio una volta.</li>
	<li>Associazione aspecifici di blocco per le perle utilizzando eparina. Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL di tampone di eparina e lasciare rotante per 30 min. lavare le perle una volta, come descritto al punto 2.2. Nota: L'eparina è un polimero caricato negativamente, che si sfideranno con RNA per l'associazione. tRNA o altro RNAs irrilevante può essere utilizzato anche se l'applicazione a valle non è sequenza.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP buffer e aggiungere 1,25 anticorpo di anti-α-bromodeossiuridina µ g/campione, che riconosce anche BrU. Incubare le perline per 1 h durante la rotazione, o durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2. Risospendere le sfere in 50 µ l di campione 1 x BrU-IP buffer integrato con 1 mM BrU e lasciare a rotazione per 30 min abbassare la sensibilità dell'anticorpo associato ai talloni e con la presente il rischio di associazione non specifico durante IP.</li>
	<li>Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2 e risospendere in 50 µ l di campione 1xBrU-IP buffer.</li>
</ol>3. associazione del RNA BrU-etichettati per perline
<ol><li>Misurare le concentrazioni di RNA in RNA estratti dal passaggio 1.3 tramite spettrofotometro ultravioletto-visibile e diluire 40 µ g RNA da ogni campione in privo di RNasi H2O a un volume totale di 200 µ l.</li>
	<li>Riscaldare i campioni di RNA per 2 min a 80 ° C per denaturare il RNA e spin brevemente in una centrifuga da tavolo. Aggiungere 200 µ l 2 x inibitore BrU-IP + BSA/RNasi.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l risospese e preparato perline dal passaggio 2.6 per ogni campione e lasciare rotante 1 h. lavare le perle quattro volte come descritto al punto 2.2.</li>
</ol>4. eluizione e purificazione di RNA mediante estrazione con fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi
<ol><li>
Eluire il RNA ed eseguire estrazione del fenolo
	<ol>
<li>Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di eluizione per eluire RNA e presto da allora in poi aggiungere fenolo di 200 µ l, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota sotto passo 4.1.2) per rimuovere eventuali molecole di RNA non dal campione.</li>
		<li>Mix di vortice del campione e spin 3 min a 25.000 x g in una centrifuga da tavolo. Nota: Fenolo è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Il pH leggermente acido assicura che solo RNA e non il DNA, viene estratto. il RNA rimarrà nella fase acquosa superiore a causa della natura idrofila di cariche. I nuclei idrofobi delle proteine si legano fenolo e spostare fenolo-fase organica inferiore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire l'estrazione del fenolo-cloroformio
	<ol>
<li>Aspirare tanto superiore-fase possibile (circa 190 µ l di 200 µ l, a seconda dell'esperienza nella gestione) e spostarlo in un tubo con 200 µ l fenolo/cloroformio, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota). Assicurarsi di aspirare lo stesso importo attraverso campioni.</li>
		<li>Vortice mescolare il campione e la rotazione per 3 min a 25.000 x g. Nota: Cloroformio è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Cloroformio è aggiunto per rimuovere il fenolo, che possa influenzare l'analisi a valle delle RNA inibendo la trascrizione d'inversione della polimerasi e14 reazioni a catena15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'estrazione di cloroformio aspirando la fase acquosa superiore come prima (ora circa 180 µ l) e trasferire in una provetta contenente cloroformio di 200 µ l. Vortice mescolare il campione e spin 3 min a 25.000 x g.</li>
	<li>Aspirare la fase acquosa superiore come prima (ora circa 170 µ l) e trasferirlo in una provetta contenente 17 µ l (1/10 di volume) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Per neutralizzare e precipitare RNA dalla soluzione acquosa, aggiungere 2 glicogeno µ l (20 mg/mL), che precipita insieme a RNA e rende più visibile la pallina del RNA.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di etanolo 96% per aumentare il binding tra il sale ioni e RNA e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte. Lasciare il tubo durante la notte a-20 ° C o 15 min su ghiaccio secco.</li>
	<li>Spin il campione a 25.000 x g, 4 ° C per 30 min. Discard surnatante senza disturbare il pellet e lavare la pallina in etanolo di 75% µ l 185 per rimuovere qualsiasi residuo di sale. Spin a 25.000 x g, 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il surnatante completamente senza disturbare il pellet e lasciare il pellet a secco 5-10 minuti con un coperchio aperto. Risospendere in 10 µ l, privo di RNasi H2O applicata sul lato del tubo per evitare di disturbare il pellet.</li>
</ol>5. analisi del RNA
<ol><li>Preparare cDNA usando una trascrizione inversa di cDNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro preferito metodo utilizzando 2 µ l di campione di RNA e 1 µ g lievito RNA totale come elemento portante di RNA per la reazione di sintesi del cDNA (non utilizzata se cDNA è utilizzato per il sequenziamento di nuova generazione). Utilizzare 1 µ g di RNA senza lievito RNA per la preparazione di cDNA di ingresso corrispondente.</li>
	<li>CDNA diluito 01:25 e mix 9 µ l diluito cDNA con 10 µ l qPCR Master mix e 1 µ l fluorogenic sonda, entrambi specificati nella Tabella materiali. Nota: La diluizione di cDNA dipende dalla preparazione di cDNA e qPCR metodo utilizzato.</li>
	<li>Eseguire il seguente programma di qPCR (ad esempio, su un sistema Fast Real-Time PCR di 7500 o equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 cicli di 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
<li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra%3A+Positive+and+negative+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li>
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<li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li>
<li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li>
<li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose%3F+How+to+evaluate+its+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li>
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<li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Alkynyl-2%27-deoxyuridines%3A+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li>
<li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive l'uso di BrU-IP per determinazione della produzione di RNA mediante etichettatura di recente prodotte RNA per 1 h con BrU, seguita da estrazione di RNA immediata e immunoprecipitazione di RNA BrU-etichettati. Questo metodo precedentemente è stato descritto nel riferimento16, e in questo articolo include alcuni passaggi aggiuntivi per aumentare la specificità IP e purezza RNA, dai branelli di pre-trattamento con basse concentrazioni di BrU, nonché una fase di purificazion...

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitazione (IP) permette lo studio della produzione di RNA nelle cellule con no o molto limitati effetti su cellule fisiologia durante il breve periodo1,2di etichettatura. Il metodo si basa di incorporazione del derivato sintetico uridina BrU in RNA recentemente sintetizzato seguita da IP di RNA etichettato usando gli anticorpi anti-BrU (Figura 1).
È stato conosciuto per decenni quella sintesi della proteina possono essere regolata trascrizionalmente e l'esistenza di fattori di trascrizione è stata supposta più di 50 anni fa3. Oggi, è noto che molte malattie sono causate da disregolazione della trascrizione e della stabilità del RNA (complementare figura S1 in riferimento4), e la capacità di misurare le variazioni nella produzione di RNA è di grande importanza nella malattia di comprensione sviluppo.
D'altra parte, strumenti per regolare la produzione di RNA offrono nuove possibilità per il trattamento di malattie causate da troppo o troppo poco l'espressione della proteina, o accumulo di proteine come nella malattia di Parkinson (PD). La proteina predominante accumulando aggregati come insolubili nel PD è α-synuclein, e il livello di α-synuclein è direttamente legato alla malattia, come la moltiplicazione del gene del gene α-synuclein causa familiare PD5. Inoltre, α-synuclein aggrega in un modo dipendente dalla concentrazione. Downregulation dei livelli di mRNA di α-synuclein è quindi un'interessante strategia terapeutica, che è stato raggiunto con successo usando l'interferenza del RNA per ridurre la perdita di un neurone delle cellule nel PD modelli del roditore6,7.
È importante essere in grado di misurare i cambiamenti nella produzione di RNA causata da malattia o interventi terapeutici. Metodi all'avanguardia per misurazione livelli allo stato stazionario di RNA, come trascrizione d'inversione seguita da reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR), non sono in grado di distinguere tra i cambiamenti causati da regolazione trascrizionale o da alterato Stabilità del RNA. Un metodo ampiamente usato per le indagini dei tassi di decadimento di RNA è il blocco dell'apparato trascrizionale utilizzando composti come α-amanitina o actinomicina D seguita da misure del RNAs decadente. Tuttavia, ci sono alcuni problemi connessi con un blocco generale di trascrizione nelle cellule, come induzione di apoptosi8,9. Al lato degli effetti citotossici, trascrizionali inibitori presentano anche diversi problemi tecnici, come lento assorbimento cellulare di α-amanitina e mancanza di specificità di actinomicina D (rivisto in riferimento10).
Per evitare il blocco generale della trascrizione, nucleotidici sono stati utilizzati, quali 5-Etinil uridina (5-UE), 4-thiouridine (4-TU) e BrU. Questi sono prontamente presi dalle cellule di mammifera e integrare nel RNA recentemente sintetizzato, Abilitazione impulso-etichettatura di RNA entro un lasso di tempo specifico. BrU è meno tossico che 5-UE e 4-TU, che lo rende il preferito analogo scelta11,12.
BrU-IP può essere utilizzato per indagare sia il tasso di sintesi di RNA e di stabilità e così distinguere tra le cause alla base dei cambiamenti nel RNA totale. Questo articolo si concentrerà sulla misurazione della sintesi del RNA e si riferisce per fare riferimento a2 per i dettagli sull'indagine di stabilità del RNA. Per studiare la sintesi del RNA, cellule brevemente sono etichettate con BrU ad es. per 1 h seguita da BrU-IP1 (Figura 1). Questo permette di eseguire misure di RNA sintetizzati entro il breve tempo di etichettatura e cambiamenti osservati verranno darà una stima migliore dei regolamenti nella sintesi di RNA che misurando i cambiamenti in RNA totale da RT-qPCR. Va ricordato, tuttavia, che anche se la data di etichettatura è, ad esempio, solo 1 h, degradazione può ancora avere un'influenza sui livelli di RNA osservata.
RNA da esperimenti di BrU-IP sono adatte per analisi a valle sia RT-qPCR1 o di prossima generazione sequenziamento2,13. Altri metodi di rilevamento standard di RNA, come Macchiarsi nordico o analisi della protezione della ribonucleasi, possono anche essere applicabile per certo RNAs.

<table><tbody><tr><td>Inibitore della Rnasi di Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 IgG di pecora anti-topo Life</td><td>Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bromodeoxyuridine anticorpo di topo</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Spettrofotometria ultravioletto-visibile</td></tr><tr><td>Fenolo saturo d'acqua pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio:IAA 25:24:1 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Sonde RNA Taqman</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Sonde flurogeniche</td></tr><tr><td>7500 Sistema di PCR veloce in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T linea cellulare</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza media dell'aquila modificata di Dulbecco</td><td></td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> di Hank <td>5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 e 136,8 mM NaCl pH 6,77, sterilizzato in autoclave.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0,1% dietilpirocarbonato trattato H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP tampone</td><td></td><td></td><td>40 mM Tris-HCl pH 7,5 e 500 mM NaCl in DEPC H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAsi inibitore</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tampone integrato con 1 &mu; g/&mu; L BSA e 80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+, 1 mg/mL di eparina</td><td></td><td></td>, <td>2xBrU-IP, tampone diluito 1:1, DEPC-H2O e integrato con 1 mg/mL di eparina,</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td>, <td>2xBrU-IP, tampone diluito 1:1 in DEPC-H2O e integrato con 0,5 &mu; g/&mu; L BSA e 20 U/mL</td></tr><tr><td>di tampone</td><td></td><td></td> di eluizione Ribolock <td>0,1% SDS in H2O privo di RNAsi</td></tr></tbody></table>

indagine della sintesi di rna usando 5-bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Quando livelli allo stato stazionario del RNA sono confrontati fra due condizioni, non è possibile distinguere se i cambiamenti sono causati da alterazioni nella produzione o degradazione del RNA. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione della produzione di RNA, usando 5-Bromouridine etichettatura di RNA seguito da immunoprecipitazione, che consente l'indagine di RNA sintetizzato entro un breve lasso di tempo (ad es., 1h). Il vantaggio di 5-Bromouridine-etichettatura e immunoprecipitazione sull'uso di inibitori trascrizionali tossici, come α-amanitina e actinomicina D, è che ci sono no o molto bassi effetti sulla vitalità cellulare durante l'uso a breve termine. Tuttavia, poiché 5-Bromouridine-immunoprecipitazione acquisisce solo RNA prodotta entro il breve tempo di etichettatura, lentamente prodotta così come rapidamente degradato RNA può essere difficile da misurare da questo metodo. Il RNA 5-Bromouridine-labelled catturato da 5-Bromouridine-immunoprecipitazione può essere analizzato da trascrizione d'inversione, reazione a catena della polimerasi quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. Tutti i tipi di RNA possono essere indagati, e il metodo non è limitato alla misura mRNA come è presentato in questo esempio.

I nostri test iniziale di tempo BrU-etichettatura sono state eseguite in cellule AsPC-1. Le cellule sono state trattate con BrU per 0, 1, 2 e 4,5 h, seguita da estrazione di RNA totale e BrU-IP. GAS5 e GAPDH sono stati misurati in BrU-IP RNA, che ha dimostrato che l'etichettatura 1h era sufficiente per raggiungere un circa 9 e 44 volte cambiamento rispetto allo sfondo (0h) per GAPDH e GAS5, rispettivamente.
BrU-IP e l'analisi so...

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare i cambiamenti nella sintesi dell'RNA mediante marcatura della bromouridina e immunoprecipitazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo dell'RNA misurando se un cambiamento nei livelli di RNA è causato da cambiamenti nella sintesi dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata su qualsiasi tipo di coltura cellulare preferita e i materiali utilizzati sono facilmente accessibili.Per iniziare il protocollo, seminare da 3,5 volte 10 al sesto HEK293T cellule in una capsula di Petri di 10 centimetri in 10 millilitri di terreno di crescita per ottenere un totale di oltre 40 microgrammi di RNA dopo l'estrazione 48 ore dopo. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2,48 ore dopo la semina, aspirare otto millilitri di terreno di crescita e lasciare due millilitri per evitare che le cellule si secchino. Aggiungere due millimoli di bromouridina e trattamento al terreno di crescita e rimuovere i due millilitri residui dalle cellule prima di riapplicare gli otto millilitri di bromouridina contenenti terreno di crescita.Quindi, incubare le cellule per un'

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A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Descriviamo una tecnica per l'analisi della sintesi dell'RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell'RNA globale.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

L'uso di uracil tiolato per purificare in modo sensibile e specifico l'RNA appena trascritto dal lievito Saccharomyces cerevisiae.

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

Scopri come misurare la sintesi di RNA mediante etichettatura con bromouridina e immunoprecipitazione. Questo metodo permette di determinare se le variazioni dei livelli di RNA sono dovute a cambiamenti nella sintesi.

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

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