Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

In questo lavoro, dimostreremo un protocollo facile per produrre proteine acetilate omogeneamente in siti specifici utilizzando E.coli come ospite di espressione. L'acetilazione reversibile della lisina delle proteine è una delle modificazioni post-traduzionali più abbondanti in natura. Svolge un ruolo importante in un'ampia gamma di processi biologici, tra cui la trascrizione genica, la risposta allo stress, la differenziazione cellulare e il metabolismo.

La generazione di proteine puramente acetilate nelle posizioni di progetto è molto utile per studiare l'acetilazione delle proteine. Tuttavia, è difficile per la maggior parte dei metodi classici. Questa sfida è stata risolta con la tecnica di espansione del codice genetico.

Utilizza una variante ingegnerizzata della pirrolisil-tRNA sintetasi per caricare il tRNA-Pyl con acetillisina, quindi utilizza il macchinario traduzionale dell'ospite per sopprimere il codone di stop UAG nell'mRNA e dirige l'incorporazione dell'acetillisina nella posizione di progetto della proteina bersaglio. In primo luogo, il codone di stop ambrato deve essere introdotto nella posizione corrispondente nel gene bersaglio mediante mutagenesi sito-specifica. Amplificare il plasmide stampo contenente il gene delle proteine wild-type e inserire la mutazione del codone di stop dai primer mediante la reazione PCR.

Dopo la PCR, il materiale amplificato viene aggiunto direttamente alla miscela enzimatica chinasi-ligasi-Dpn1 per un'ora a temperatura ambiente per la circolarizzazione e la rimozione del modello. Aggiungere cinque microlitri della miscela al tubo di 25 microlitri di cellule di E.coli competenti scongelate. Muovi con cura il tubo per mescolare e metti il composto sul ghiaccio per 30 minuti.

Scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi e metterla in ghiaccio per altri cinque minuti. Pipettare 600 microlitri di terreno SOC a temperatura ambiente nella miscela. Incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti agitando.

Distribuire 100 microlitri sulla piastra con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Il plasmide della singola colonia viene inviato per il sequenziamento. Il secondo passo consiste nell'esprimere e purificare la proteina acetilata sito-specifica.

Prelevare una singola colonia dalla piastra, che contiene il gene bersaglio mutato contenente TAG e il sistema di incorporazione dell'acetillisina. Inoculare in 15 millilitri di terreno LB fresco con antibiotici corrispondenti per una notte a 37 gradi Celsius. Trasferire la coltura notturna da 15 millilitri in un terreno LB fresco da 300 millilitri con antibiotici e incubare a 37 gradi Celsius.

Aggiungere l'acetillisina da cinque millimolari e la nicotinamide da 20 millimolari come concentrazioni finali nei mezzi di crescita quando l'assorbanza raggiunge 5 a 600 nanometri. Coltiva le cellule per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere l'induttore per l'espressione proteica e far crescere le cellule a 25 gradi Celsius durante la notte.

Raccogliere le cellule centrifugando a 3.000 g per 15 minuti. Scartare il surnatante e conservare i pellet cellulari a una temperatura negativa di 80 gradi. Scongelare i pellet cellulari congelati su ghiaccio e risospendere con 15 millilitri di tampone di lisi, cinque microlitri di beta-mercaptoetanolo e un microlitro di nucleasi.

Le cellule vengono rotte dalla sonicazione. Centrifugare l'estratto grezzo a 20.000 g per 25 minuti a quattro gradi. Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 45 micrometri.

Caricare il campione filtrato su una colonna contenente un millilitro di resina di nichel NTA, bilanciata con 20 millilitri di tampone di lisi. Lavare la colonna con 20 millilitri di tampone di lavaggio. La proteina bersaglio viene elusa con due millilitri di tampone di eluizione.

La proteina purificata viene desalinizzata dalla colonna PD-10 aggiungendo un campione da 2,5 millilitri e raccoglie il campione dissalato con un tampone di desalinizzazione da 3,5 millilitri. Il passo successivo è quello di caratterizzare biochimicamente la proteina acetilata purificata. Denaturare le proteine con il tampone campione SDS a una temperatura superiore a 100 gradi per cinque minuti.

Centrifugare la miscela, caricarla sul gel SDS-PAGE e farla funzionare a 200 volt per 30 minuti. Lavare il gel con acqua distillata e agitare delicatamente. Per realizzare il sandwich per il western blotting, dal catodo all'anodo è una spugna, carta da filtro, tampone di trasferimento, gel SDS-PAGE imbevuto, membrana PVDF attivata con metanolo, un'altra carta da filtro, rimuovere le bolle nel sandwich e un'altra spugna.

Mettere la pila nel serbatoio di trasferimento. Funziona a una corrente costante di 350 milliampere per 45 minuti. Lavare la membrana in PVDF con tampone TBST da 25 millilitri per cinque minuti agitando delicatamente.

Bloccare la membrana con il 5% di BSA e il tampone TBST per un'ora a temperatura ambiente. Incubare la membrana con l'anticorpo acetillisina coniugato HRP diluito a temperatura ambiente per un'ora o quattro gradi durante la notte agitando delicatamente. Lavare la membrana con 20 millilitri di tampone TBST per cinque minuti agitando delicatamente.

Ripeti questo passaggio quattro volte. Applicare il substrato di chemiluminescenza sulla membrana per un minuto. Cattura il segnale con un imager di base della telecamera CCD.

Gli stessi volumi di frazioni di eluizione e purificazione delle proteine sono stati caricati sul gel SDS-PAGE. La resa della proteina acetilata è circa la metà della proteina wild-type, che è altamente efficiente, e lo stesso ceppo di espressione senza acetillisina e mezzi di crescita non può produrre proteine con quantità rilevabile, indicando un'elevata purezza della proteina acetilata poiché non ci sono amminoacidi canonici incorporati in questa posizione specifica. Il western blotting ha mostrato che non vi è acetilazione rilevabile nella proteina wild-type, indicando il basso background di acetilazione non specifica di questo sistema di espressione, mentre la proteina acetilata aveva una banda chiara.

La spettrometria di massa tandem ha confermato che l'acetilazione avviene nel sito corretto la cui posizione corrispondente nel gene è stata mutata nel codone di stop. Per ottenere buone rese e purezza delle proteine acetilate, è necessario utilizzare il sistema di incorporazione dell'acetillisina ottimizzato per garantire sia un'elevata efficienza che un'elevata purezza. Le celle BL21(DE3) devono essere utilizzate per un basso fondo e un'acetilazione aspecifica per aumentare la purezza.

Il sistema di incorporazione genetica potrebbe essere utilizzato nei sistemi eucariotici per applicazioni più ampie.