Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la funzione delle vescicole extracellulari rilasciate dai globuli rossi infettati dal parassita della malaria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malaria, come ad esempio il modo in cui i parassiti regolano la comunicazione parassita-ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è la visualizzazione dell'arbitaggio vescicolare da parte delle cellule indoterote in fase di studio della funzione regolatoria dell'RNA vescicolare da parte delle cellule indoterote.

A dimostrare la procedura saranno Mya Alondez, Smartin Bagu e Bayo Babatunde, tutti studenti laureati del mio laboratorio. In una provetta da microcentrifuga aggiungere 100 microgrammi di vescicole extracellulari e un millilitro di soluzione fisiologica tamponata con fosfato. Quindi centrifugare le vescicole extracellulari a una velocità massima di 20.000 volte g per sette minuti per formare un pellet.

Una volta terminata la centrifugazione, scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi sciogliere il pellet di vescicola extracellulare in 100 microlitri di dilumato C.To garantire una miscelazione completa, pipettarlo più volte. Successivamente, in una nuova provetta per microcentrifuga, aggiungere quattro microlitri della soluzione di colorante etanolico PKH67 a 100 microlitri di dilmant C.Quindi agitare bene la miscela.

Preparare la soluzione colorante 2XPKH67 da 40 micromolari appena prima del processo di colorazione. Quindi combinare rapidamente 100 microlitri di due sospensioni vescicolari extracellulari con un volume uguale della soluzione di colorante etanolico PKH67. Quindi pipettare la miscela 10 volte per garantire una miscelazione corretta.

Dopo la completa miscelazione, incubare la soluzione vescicolare extracellulare e la soluzione di colorante etanolico PKH67 per cinque minuti lontano dalla luce. Nel corso dell'incubazione, continua a agitare la miscela tre o quattro volte. Per fermare la reazione di colorazione, aggiungere 200 microlitri di siero alla miscela e incubare per un minuto affinché il colorante in eccesso si leghi.

Quindi, lavare tre volte le vescicole extracellulari con soluzione salina tamponata con fosfato. Dopo il lavaggio, centrifugare il campione a 20.000 volte g per cinque minuti. Quindi sciogliere il pellet vescicolare extracellulare in 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per raggiungere una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro.

Trasferire le cellule endoteliali in un millilitro di terreno di crescita delle cellule endoteliali complete in un vetrino coprioggetti rivestito di poli-elitene. Lasciare che le cellule crescano in un monostrato sul vetrino coprioggetto. Dopo che il monostrato si è formato, rimuovere con cura il terreno e aggiungere un millilitro di terreno fresco per lavare le celle due volte.

Quindi aggiungere 50 microgrammi di vescicole extracellulari colorate con PKH67 al vetrino coprioggetti e incubare per quattro ore. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno. Per rimuovere tutte le vescicole extracellulari non legate, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.

È necessario prestare molta attenzione durante la manipolazione della colorazione dei vetrini coprioggetto utilizzando pinze sottili per evitare la perdita di cellule e la rottura del vetrino coprioggetti. Dopo il lavaggio, utilizzare il tre percento di soluzione di paraformaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato per fissare le cellule per 15 minuti. Anche in questo caso, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 250 microlitri di tritan allo 0,1% x 100 in soluzione salina tamponata con fosfato per permeare le cellule e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 400 microlitri di tampone bloccante alle cellule. Quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per trenta minuti per evitare legami aspecifici. Dopo il blocco, lavare una volta le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi diluire cinque microlitri di soluzione madre di falloide in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato con l'uno per cento di albumina sierica bovina per preparare la soluzione colorante per ogni vetrino coprioggetto. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Una volta terminata l'incubazione, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi utilizzare la concentrazione finale di due microgrammi per millilitro di 3342 uncinato in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per controcolorare il DNA per 30 secondi. Dopo la colorazione, aggiungere 400 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato per lavare due volte il vetrino coprioggetti. Quindi sollevare con cautela il vetrino coprioggetto con l'aiuto di una pinza e capovolgerlo sulla parte superiore di una goccia di supporto di montaggio antisbiadimento su un vetrino.

Usa un fazzoletto per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso e poi sigilla l'ambiente circostante con lo smalto per unghie. Bisogna anche fare molta attenzione a non esporre le cellule a una quantità eccessiva di colorante durante la microscopia per evitare lo sbiancamento delle cellule. In un inserto per coltura tissutale a 24 pozzetti con versamento micromolare di 0,4, seminare le cellule endoteliali.

Quindi lasciare che le cellule crescano nella coltura per cinque giorni senza essere disturbate per formare un monostrato differenziato. Continua a cambiare il mezzo ogni due giorni. Una volta formato il monostrato, seminare 50 microgrammi in un millilitro di vescicole extracellulari sulla camera superiore.

Quindi aggiungere 20 milligrammi per millilitro di destrano rotomina al pozzetto superiore e incubare a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. Monitorare la migrazione del destrano fluorescente sul fondo del pozzetto misurando la missione di fluorescenza da 40 microlitri di avoquate medio. Quindi programmare la lunghezza d'onda di eccitazione a 544 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nanometri per un lettore di micropiastre multi-etichetta.

Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule. Quindi risospendere le cellule endoteliali in un terreno di coltura endoteliale completo e seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti in 100 microlitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali. Per ottenere una concentrazione da 0,1 a dieci microgrammi per millilitro, aggiungere 100 microlitri di terreno contenente antibiotici.

Monitora la vitalità delle cellule ogni due giorni utilizzando un obiettivo 20 volte al microscopio ottico. Continuare a coltivare le cellule per altri 10-14 giorni e sostituire il terreno contenente antibiotico ogni due o tre giorni, a seconda della crescita cellulare. Quindi, aggiungere 10 microlitri di reagente MTS in ogni pozzetto e mescolare il reagente.

Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo quattro ore, agitare brevemente la piastra su uno shaker. Quindi leggere gli assorbenti delle cellule trattate e non trattate utilizzando un lettore di piastre a 490 nanometri.

Un giorno prima della trasduzione lentivirale, seminare le cellule endoteliali in un millilitro di terreno completo. Attendere che le cellule raggiungano una confluenza compresa tra il 50 e l'80% per la trasduzione lentivirale Prima di aprire la provetta, centrifugare la sospensione lentivirale a 200 volte g per 30 secondi per evitare fuoriuscite. Quindi aggiungere il bromuro di esxidimetrina alle cellule per regolare a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro e agitare delicatamente la piastra.

Aggiungere il lentivirus alle cellule e agitare nuovamente la piastra delicatamente per 30 secondi per garantire una corretta miscelazione. Per aumentare l'efficienza di trasduzione lentivirale, centrifugare la miscela cellula-virus a 300 volte g per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare la miscela cellula-virus a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, scartare il terreno contenente particelle virali e sostituirlo con un terreno di coltura preriscaldato, fresco e completo. Il secondo giorno, iniziare la selezione della puromicina. Sostituire il terreno di coltura completo con un terreno contenente puromicina.

Dopo la selezione della puromicina, raccogliere le cellule. Seguendo le istruzioni del produttore, isolare l'RNA dalle cellule utilizzando un kit di isolamento dell'RNA. Utilizzare un kit di trascrizione inversa per isolare il DNA complementare con i micro-RNA selezionati.

Quindi impostare la reazione di PCR quantitativa. Per monitorare l'internalizzazione delle vescicole extracellulari da parte delle cellule endoteliali, le vescicole verdi marcate con PKH67 sono state analizzate mediante microscopia confocale. Nel test, la faloudina e l'hookst 33342, le cui colorazioni agiscono rispettivamente in rosso e blu nucleidico, vengono utilizzati per tracciare la traslocazione delle vescicole all'interno delle cellule endoteliali.

Le immagini confocali ottenute mostrano un pronto assorbimento delle vescicole da parte delle cellule endoteliali dopo quattro ore. Successivamente, per studiare la permeabilità della capacità di diffusione del monostrato delle cellule endoteliali dell'isotiosionadestrino della rodamina b. Questo test mostra che l'incubazione delle cellule endoteliali con 50 e 100 microgrammi per millilitro di vescicole extracellulari aumenta la permeabilità del monostrato endoteliale dopo due ore.

Nel grafico, l'asse x rappresenta la concentrazione delle vescicole extracellulari e l'asse y rappresenta le variazioni di piega nella permeabilità endoteliale lette a 590 nanometri. Successivamente, per determinare la sensibilità delle cellule endoteliali con il trattamento con puromicina, è stata tracciata una curva di uccisione. La curva di uccisione mostra che meno di 0,15 microgrammi per millilitro di puromicina sono sufficienti per uccidere tutte le cellule.

Inoltre, per determinare il livello di espressione del micro-RNA451a isolato dalle cellule endoteliali, è stata eseguita la PCR quantitativa in tempo reale. I grafici a barre mostrano una significativa sovraespressione del trascritto micro-RNA451a contro il gene U6 della governante. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare il ruolo delle vescicole extracellulari nell'interazione con l'ospite e nella comunicazione cellulare attraverso il trasferimento di materiale genetico. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'assorbimento delle vescicole extracellulari da parte delle cellule riceventi e di come studiare la funzione dell'RNA nella regolazione delle cellule endoteliali.

Non dimenticare che lavorare con i parassiti della malaria e il sangue umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come indossare guanti, camice da laboratorio e lavorare sotto un cappuccio sterile.