Name: Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante linfezione malarica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Scopri come isolare e visualizzare le vescicole extracellulari rilasciate da eritrociti infettati da Plasmodium falciparum. Questo metodo permette di studiare la comunicazione parassita-ospite e le funzioni regolatorie del RNA vescicolare nelle cellule endoteliali.

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente in parte dalla Fondazione Novartis per medical - ricerca biologica (a PYM), il Gottfried e Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW e PYM) e la piscina di ricerca dell'Università di Friburgo (a PYM). Ulteriori contributi comprendono le borse di eccellenza della Confederazione Svizzera per studiosi stranieri (di KAB e SM). Ringraziamo Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess per supporto tecnico.

Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).
Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. 11 perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.
1. fluorescenza etichettatura del SVE
Nota: La procedura seguente si avvale della tecnologia d'etichettatura per incorporare stabilmente un colorante fluorescente verde (PKH67) con grandi code alifatiche nella regione del lipido della membrana EV. La reazione è condotta in un volume contenente una concentrazione finale di 20 µM di PKH67 di colorazione finale 200 µ l. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente (20-25 ° C)
<ol><li>Posto 100 µ g di EVs in 1 mL di PBS in una microcentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare lo SVE in un tubo del microcentrifuge alla massima velocità (20.000 x g) per 7 min a pellet. Nota: Poiché emozoina è presente nel server virtuale di Exchange, un pellet brunastro rosso-scuro dovrebbe essere osservata. Se il supernatante è rossastro, il servizio volontario europeo è lisate.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante con attenzione, al fine di evitare la rimozione di qualsiasi server virtuale di Exchange. Nota: Ridurre al minimo la quantità di residuo buffer presenti prima risospendere EVs in diluente C al fine di aumentare l'efficienza della colorazione e riproducibilità.</li>
	<li>Risospendere il pellet di EV in 100 µ l di diluente C (2 X sospensione EV) e delicatamente pipetta per assicurare la completa dispersione.</li>
	<li>Preparare un nuovo tubo del microcentrifuge e aggiungere 4 µ l della soluzione etanolica tintura PKH67 a 100 µ l di diluente C. Vortex bene per mescolare. Preparare la soluzione di colorante 2 x (40 µM) immediatamente prima della colorazione. Nota: Per evitare macchie eterogenei, non aggiungere la soluzione di colorante etanolica PKH67 direttamente per il pellet di EV.</li>
	<li>Rapidamente, è possibile combinare i 100 µ l di sospensione di EV (passo 1.4): 2x con i 100 µ l di soluzione colorante (passo 1,5): 2x. Quindi, mescolare il campione pipettando su e giù per 10 volte.</li>
	<li>Incubare la sospensione EV/colorante dal passaggio 1.6 per 5 min, protetta da luce e mescolare nel Vortex 3 - 4 volte durante l'incubazione di 5 min. Nota: Incubando la sospensione di EV/colorante per tempi più lunghi non fornisce alcun vantaggio, perché la colorazione è così rapida.</li>
	<li>Fermare la reazione di macchiatura aggiungendo un volume uguale (200 µ l) del siero e incubare per 1 min consentire l'associazione di colorante in eccesso. Nota: Prima di arrestare la macchiatura, impoveriscono il siero da EVs mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS e spin giù a 20.000 x g per 5 min. Risospendere lo SVE in 100 µ l di PBS per raggiungere una concentrazione finale di 1 µ g / µ l.</li>
</ol>2. visualizzare l'assorbimento dello SVE mediante microscopia confocale
Nota: Il seguente protocollo descrive il tracciamento di interiorizzazione EV dalle cellule endoteliali coltivate su vetrini coprioggetti. Le cellule endoteliali sono cellule endoteliali del midollo osseo umane semi-immortalate come descritto in12.
<ol><li>Lavorare in un ambiente sterile, cappotto coprioggetti con un eccesso di 0.01% poli-L-lisina per 10 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e consentire i coprioggetti asciugare completamente.</li>
	<li>Eseguire un conteggio di cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro.</li>
	<li>Trasferire 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento per i coprioggetti rivestiti con poli-L-lisina e lasciare che le cellule crescono di un monostrato. Nota: Il supporto contiene fattori di crescita che permettono alle cellule di formare un monostrato e a formare giunzioni strette.</li>
	<li>Una volta che le cellule formano un monostrato, attentamente aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di terreno nuovo per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio una volta di più. Aggiungere 50 µ g di PKH67-labeled EVs e incubare per 4 h. Nota: Per trovare il punto di tempo ottimo per l'assorbimento, un corso a tempo può essere eseguito.</li>
	<li>Dopo 4 h, aspirare il mezzo e lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere EVs in eccesso e non associato. Fissare le cellule con soluzione di paraformaldeide 3% in PBS per 15 min. Nota: Metanolo possa interferire con l'actina durante il processo di fissazione; Pertanto, è meglio evitare qualsiasi metanolo contenente fissativi o altri fissativi a base di solvente. Si consiglia di utilizzare metanolo senza formaldeide come fissativo.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere con cautela 250 µ l di 0.1% Triton X-100 in PBS per permeabilize le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 400 µ l di tampone bloccante (5% BSA in PBS) per 30 min a RT per bloccare il legame non specifico.</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con PBS. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 5 µ l della soluzione madre falloidina in 200 µ l PBS/1% BSA per ogni vetrino coprioggetto. Dispensare 200 µ l di soluzione colorante il coprivetrino e incubare per 20 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS. Colorante di contrasto il DNA per 30 s con Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL a 200 µ l di PBS.</li>
	<li>Lavare il vetrino coprioggetto: 2x aggiungendo 400 µ l di PBS. Attentamente afferrare il coprioggetto con il forcipe e negarlo sulla cima di una goccia di antifade supporti di montaggio su un vetrino. Rimuovere delicatamente il terreno in eccesso con un fazzoletto e sigillare ogni lato con smalto.</li>
	<li>Archiviare le diapositive proteggere dalla luce a 4 ° C.</li>
	<li>Visualizzare le celle utilizzando un microscopio confocale laser eccitazioni 405, 488 e 543 nm e un 63 X, obiettivo di olio 1,3 NA con emissioni fluorescenti a 450-470 nm (blu), 505-530 nm (verde) e 620 nm. Nota: F-actina tipica colorazione risultati sono mostrati nella Figura 1.</li>
</ol>3. endothelial delle cellule permeabilità
Nota: Permeabilità delle cellule endoteliali è valutata misurando il trasferimento di Rodamina B isotiocianato-destrano (medio MW 70.000) lungo il monostrato di cellule endoteliali. Destrano fornisce un ottimo strumento per studiare la permeabilità vascolare.
<ol><li>Conta cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue 0,4% e un emocitometro.</li>
	<li>Le cellule endoteliali ad una densità di 0,6 x 105 celle alla confluenza in coltura di tessuti 24 pozzetti inserti (dimensione dei pori di 0,4 µm) e lasciare indisturbato per almeno 5 giorni formare strati monomolecolari differenziati della piastra. Aggiornare il mezzo ogni secondo giorno.</li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono un monostrato, caricare il servizio volontario europeo (50 µ g in 1 mL) sulla camera superiore. Aggiungere il rodamina-destrano al pozzo superiore ad una concentrazione finale di 20 mg/mL. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Monitorare il trasferimento del destrano fluorescente a fondo anche misurando l'emissione di fluorescenza da aliquote medie di 40 µ l. Impostare il lettore di micropiastre multi-etichetta a 544 nm eccitazione e di 590 nm emissione per misurazioni. Nota: La quantità di destrano diffusa può essere quantificata utilizzando le curve di calibrazione stabilite con la soluzione di riserva. Inoltre, esperimenti cinetici possono essere eseguiti rimuovendo piccoli campioni del mezzo alloggiamento esterno durante un corso a tempo (Figura 2). Anche senza alcun trattamento, il destrano diffonderà attraverso il monostrato cellulare.</li>
</ol>4. determinare la sensibilità con puromicina.
Nota: Prima di trasdurre le linee cellulari con lentivirus, è importante determinare la curva di uccisione di un farmaco selezionato per quella linea particolare cellula. Per determinare l'importo minimo della concentrazione di farmaco necessario uccidere tutte le cellule, è necessario effettuare un esperimento di risposta dose utilizzando dosi incrementali del farmaco selezionato. Poiché ogni linea di cellule di mammifero ha una diversa sensibilità, prima sperimentazione, la concentrazione ottimale dell'antibiotico dovrebbe essere determinata sviluppando la titolazione di curva di uccidere come dettagliato di seguito.
<ol><li>Contare le celle utilizzando l'emocitometro. Risospendere le cellule endoteliali ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento.</li>
	<li>Piastra di 1 x 104 celle in una piastra a 96 pozzetti in un volume finale di 100 µ l di Medium di crescita delle cellule endoteliali.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di terreno contenente gli antibiotici per ottenere una concentrazione di 0,1-10 µ g/mL (vedere la Figura 3).</li>
	<li>Esaminare l'attuabilità delle cellule ogni 2 giorni sotto un microscopio chiaro utilizzando un obiettivo X 20. Le cellule della coltura per 10-14 giorni e sostituire i supporti contenenti con puromicina ogni 2-3 giorni a seconda della crescita delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l/pozzetto MTS reagente in ciascun pozzetto, mix e incubare per 4 h a 37 ° C in condizioni di coltura standard.</li>
	<li>Agitare brevemente la piastra su un agitatore e misurare l'assorbanza delle cellule trattate e non trattate utilizzando un lettore di piastra a 490 nm (Figura 3).</li>
</ol>5. trasduzione delle cellule endoteliali con vettore lentivirale
<ol><li>Piastra di 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di terreno completo il giorno prima di trasduzione. Eseguire la trasduzione quando le cellule hanno raggiunto confluency di 50-80%.</li>
	<li>Scongelare il lentivirus su ghiaccio e rendere le aliquote degli stock virali per evitare cicli di gelo-disgelo. Rotazione verso il basso il materiale a 200 x g per 30 s, nei tubi prima di aprire per evitare fuoriuscita di sopra.</li>
	<li>Aggiungere bromuro di hexadimethrine le cellule ad una concentrazione finale di 8 µ g/mL. Nota: Il bromuro di Hexadimethrine aiuta l'efficienza di trasduzione, tuttavia in alcuni casi potrebbe essere tossico per le cellule. Pertanto, la concentrazione ottima deve essere determinata eseguendo una curva di uccisione prima la trasduzione.</li>
	<li>Agitare la piastra delicatamente per mescolare. Aggiungere la quantità appropriata di particelle virali (tra 0,5-2 x 106 particelle) ad una molteplicità di adatta di infezione (MOI) e agitare la piastra delicatamente per 30 s a mescolare.</li>
	<li>Centrifugare il mix di particella virale delle cellule nella centrifuga a RT per 45 min a 300 x g per aumentare l'efficienza di trasduzione. Incubare la miscela di particella virale delle cellule a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il mezzo che contengono particelle virale e scartare in modo appropriato. Sostituirlo con terreno di coltura completo fresco, pre-riscaldato.</li>
	<li>Avviare la selezione con con puromicina il secondo giorno: rimuovere il mezzo e sostituirlo con medium fresco contenente la concentrazione corretta di con puromicina come determinato in precedenza nella sezione 4 (Figura 3).</li>
	<li>Raccogliere le cellule dopo selezione con puromicina e isolare RNA usando un RNA isolando kit seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire la sintesi del cDNA con il selezionato Mirna utilizzando una trascrizione inversa kit (vedere la Tabella materiali).</li>
	<li>Impostare la reazione di qPCR secondo il citato protocollo13.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti6. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione da...

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età1. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti2. Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste piccole vescicole durante la malaria infezione3. È possibile che essi svolgono due ruoli importanti: da un lato, essi potrebbero contribuire alla patogenesi attivando i macrofagi4,5; e d'altra parte, essi potrebbero mediare la comunicazione cellulare tra parassiti e tra parassiti e host6,7. Infatti, i parassiti possono trasferire proteine o acidi nucleici tra loro tramite EVs. Ad esempio, Trypanosoma brucei rhodesiense SVE può trasferire fattore di virulenza Serum Resistance-Associated (SRA) e puoi indirizzare altri T. brucei e l'host eritrociti8. Inoltre, p. falciparum- iRBCs comunicano tra loro mediante il trasferimento di acidi nucleici all'interno di server virtuale di Exchange. In questo modo i parassiti ottimizzare e sincronizzare la sua crescita. Infatti, EVs potrebbe essere il principale regolatore di conversione gametocyte e quindi contribuire alla regolazione della trasmissione fase7.
Non solo SVE regolano i parassiti, anche mediano interazioni parassita-ospite. Abbiamo recentemente scoperto che SVE da iRBCs contengono derivati host microRNAs (miRNAs; piccole specie di RNA nella gamma di 21-25 nucleotidi9) che sono presi dalle cellule endoteliali umane. I miRNA nel server EVs formano un complesso con Ago2 stabile (un membro del RNA-induced silencing complex), che una volta consegnato il destinatario delle cellule, è in grado di specificamente silenziare l'espressione genica e che influenzano le proprietà barriera delle cellule10. Protocolli standard sono stati sviluppati per studiare la funzione del SVE. Qui, descriviamo in primo luogo un protocollo che consente l'etichettatura fluorescente di EVs per indagare il loro assorbimento dalle cellule recettive. Inoltre, utilizzando un microscopio confocale, è possibile tenere traccia di destino di EV all'interno della cellula. Diversi coloranti fluorescenti utilizzabile per tenere traccia di EVs. L'ammina-reattivo colorante, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) e fluorescenti di calceina-AM diventa una volta all'interno delle vescicole. Preferiamo utilizzare l'etichetta anfifiliche, PKH, perché dà un segnale più luminoso e uniforme. Questo approccio fornisce informazioni importanti per comprendere le interazioni tra EVs e cellule recettive. Mentre in alcuni casi EVs legarsi alla superficie delle cellule, alcune vescicole sono prese velocemente. Dopo l'assorbimento, EVs consegnare loro carichi per le cellule, in cui esercitano le loro funzioni di regolamentazione.
Qui, descriviamo un protocollo per misurare la funzione della barriera di cellule endoteliali in vitro quantificando il trasferimento di un destrano fluorescente attraverso un monostrato cellulare. Più sensibili traccianti possono essere utilizzati come marcatori radioattivi. Tuttavia, richiedono speciali precauzioni per l'uso. Altri saggi esistono per misurare la funzione di barriera in vitro come resistenza elettrica transendoteliale (TEER), che misura l'integrità stretta della giunzione. Infine visualizzare ZO-1, una proteina di giunzione stretta, dall'immunofluorescenza consente la valutazione dell'integrità di giunzione stretta come ben10. Poiché SVE sono entità complesse ed eterogenee, contenente diversi carichi con potenziale normativo caratteristica, è utile iperesprimono un RNA specifico per studiare il suo effetto sulla cellula ricevente. Di conseguenza, si definisce anche un protocollo che mira a generare linee cellulari stabili che esprimono il miRNA di interesse10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Verde Fluorescente Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluente C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>falloidina CF594</td><td>Biozio</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di rodamina B... Destrano</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Inserto con membrana in PET Falco trasparente per piastra 24 pozzetti Falcon</td><td></td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Crescita delle cellule endoteliali&nbsp; Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Kit di dosaggio colorimetrico per la proliferazione cellulare</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>esadimetrina bromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSIONE&nbsp; Lenti microRNA, umano has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, controllo negativo 1 particelle di trasduzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Kit di Trascrizione Inversa 1000 reazioni</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, con UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema di PCR in tempo reale</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.

Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo un...

In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la funzione delle vescicole extracellulari rilasciate dai globuli rossi infettati dal parassita della malaria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malaria, come ad esempio il modo in cui i parassiti regolano la comunicazione parassita-ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è la visualizzazione dell'arbitaggio vescicolare da parte delle cellule indoterote in fase di studio della funzione regolatoria dell'RNA vescicolare da parte delle cellule indoterote.A dimostrare la procedura saranno Mya Alondez, Smartin Bagu e Bayo Babatunde, tutti studenti laureati del mio laboratorio. In una provetta da microcentrifuga aggiungere 100 microgrammi di vescicole extracellulari e un millilitro di soluzione fisiologica tamponata con fosfato. Quindi centrifugare le vescicole extracellulari a una velocità massima di 20.000 volte g per sette minuti per formare un pellet.Una volta terminata la centrifugazione, scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi sciogliere il pellet di vescicola extracellulare in 100 microlitri di dilumato C.To garantire una miscelazione completa, pipettarlo più volte. Successivamente, in una nuova provetta per microcentrifuga, aggiungere quattro microlitri della soluzione di colorante etanolico PKH67 a 100 microlitri di dilmant C.Quindi agitare bene la miscela.Preparare la soluzione colorante 2XPKH67 da 40 micromolari appena prima del processo di colorazione. Quindi combinare rapidamente 100 microlitri di due sospensioni vescicolari extracellulari con un volume uguale della soluzione di colorante etanolico PKH67. Quindi pipettare la miscela 10 volte per garantire una miscelazione corretta.Dopo la completa miscelazione, incubare la soluzione vescicolare extracellulare e la soluzione di colorante etanolico PKH67 per cinque minuti lontano dalla luce. Nel corso dell'incubazione, continua a agitare la miscela tre o quattro volte. Per fermare la reazione di colorazione, aggiungere 200 microlitri di siero alla miscela e incubare per un minuto affinché il colorante in eccesso si leghi.Quindi, lavare tre volte le vescicole extracellulari con soluzione salina tamponata con fosfato. Dopo il lavaggio, centrifugare il campione a 20.000 volte g per cinque minuti. Quindi sciogliere il pellet vescicolare extracellulare in 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per raggiungere una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro.Trasferire le cellule endoteliali in un millilitro di terreno di crescita delle cellule endoteliali complete in un vetrino coprioggetti rivestito di poli-elitene. Lasciare che le cellule crescano in un monostrato sul vetrino coprioggetto. Dopo che il monostrato si è formato, rimuovere con cura il terreno e aggiungere un millilitro di terreno fresco per lavare le celle due volte.Quindi aggiungere 50 microgrammi di vescicole extracellulari colorate con PKH67 al vetrino coprioggetti e incubare per quattro ore. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno. Per rimuovere tutte le vescicole extracellulari non legate, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.È necessario prestare molta attenzione durante la manipolazione della colorazione dei vetrini coprioggetto utilizzando pinze sottili per evitare la perdita di cellule e la rottura del vetrino coprioggetti. Dopo il lavaggio, utilizzare il tre percento di soluzione di paraformaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato per fissare le cellule per 15 minuti. Anche in questo caso, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 250 microlitri di tritan allo 0,1% x 100 in soluzione salina tamponata con fosfato per permeare le cellule e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 400 microlitri di tampone bloccante alle cellule. Quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per trenta minuti per evitare legami aspecifici. Dopo il blocco, lavare una volta le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.Quindi diluire cinque microlitri di soluzione madre di falloide in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato con l'uno per cento di albumina sierica bovina per preparare la soluzione colorante per ogni vetrino coprioggetto. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Una volta terminata l'incubazione, lavare tre volte le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.Quindi utilizzare la concentrazione finale di due microgrammi per millilitro di 3342 uncinato in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per controcolorare il DNA per 30 secondi. Dopo la colorazione, aggiungere 400 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato per lavare due volte il vetrino coprioggetti. Quindi sollevare con cautela il vetrino coprioggetto con l'aiuto di una pinza e capovolgerlo sulla parte superiore di una goccia di supporto di montaggio antisbiadimento su un vetrino.Usa un fazzoletto per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso e poi sigilla l'ambiente circostante con lo smalto per unghie. Bisogna anche fare molta attenzione a non esporre le cellule a una quantità eccessiva di colorante durante la microscopia per evitare lo sbiancamento delle cellule. In un inserto per coltura tissutale a 24 pozzetti con versamento micromolare di 0,4, seminare le cellule endoteliali.Quindi lasciare che le cellule crescano nella coltura per cinque giorni senza essere disturbate per formare un monostrato differenziato. Continua a cambiare il mezzo ogni due giorni. Una volta formato il monostrato, seminare 50 microgrammi in un millilitro di vescicole extracellulari sulla camera superiore.Quindi aggiungere 20 milligrammi per millilitro di destrano rotomina al pozzetto superiore e incubare a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. Monitorare la migrazione del destrano fluorescente sul fondo del pozzetto misurando la missione di fluorescenza da 40 microlitri di avoquate medio. Quindi programmare la lunghezza d'onda di eccitazione a 544 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nanometri per un lettore di micropiastre multi-etichetta.Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule. Quindi risospendere le cellule endoteliali in un terreno di coltura endoteliale completo e seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti in 100 microlitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali. Per ottenere una concentrazione da 0,1 a dieci microgrammi per millilitro, aggiungere 100 microlitri di terreno contenente antibiotici.Monitora la vitalità delle cellule ogni due giorni utilizzando un obiettivo 20 volte al microscopio ottico. Continuare a coltivare le cellule per altri 10-14 giorni e sostituire il terreno contenente antibiotico ogni due o tre giorni, a seconda della crescita cellulare. Quindi, aggiungere 10 microlitri di reagente MTS in ogni pozzetto e mescolare il reagente.Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo quattro ore, agitare brevemente la piastra su uno shaker. Quindi leggere gli assorbenti delle cellule trattate e non trattate utilizzando un lettore di piastre a 490 nanometri.Un giorno prima della trasduzione lentivirale, seminare le cellule endoteliali in un millilitro di terreno completo. Attendere che le cellule raggiungano una confluenza compresa tra il 50 e l'80% per la trasduzione lentivirale Prima di aprire la provetta, centrifugare la sospensione lentivirale a 200 volte g per 30 secondi per evitare fuoriuscite. Quindi aggiungere il bromuro di esxidimetrina alle cellule per regolare a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro e agitare delicatamente la piastra.Aggiungere il lentivirus alle cellule e agitare nuovamente la piastra delicatamente per 30 secondi per garantire una corretta miscelazione. Per aumentare l'efficienza di trasduzione lentivirale, centrifugare la miscela cellula-virus a 300 volte g per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare la miscela cellula-virus a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, scartare il terreno contenente particelle virali e sostituirlo con un terreno di coltura preriscaldato, fresco e completo. Il secondo giorno, iniziare la selezione della puromicina. Sostituire il terreno di coltura completo con un terreno contenente puromicina.Dopo la selezione della puromicina, raccogliere le cellule. Seguendo le istruzioni del produttore, isolare l'RNA dalle cellule utilizzando un kit di isolamento dell'RNA. Utilizzare un kit di trascrizione inversa per isolare il DNA complementare con i micro-RNA selezionati.Quindi impostare la reazione di PCR quantitativa. Per monitorare l'internalizzazione delle vescicole extracellulari da parte delle cellule endoteliali, le vescicole verdi marcate con PKH67 sono state analizzate mediante microscopia confocale. Nel test, la faloudina e l'hookst 33342, le cui colorazioni agiscono rispettivamente in rosso e blu nucleidico, vengono utilizzati per tracciare la traslocazione delle vescicole all'interno delle cellule endoteliali.Le immagini confocali ottenute mostrano un pronto assorbimento delle vescicole da parte delle cellule endoteliali dopo quattro ore. Successivamente, per studiare la permeabilità della capacità di diffusione del monostrato delle cellule endoteliali dell'isotiosionadestrino della rodamina b. Questo test mostra che l'incubazione delle cellule endoteliali con 50 e 100 microgrammi per millilitro di vescicole extracellulari aumenta la permeabilità del monostrato endoteliale dopo due ore.Nel grafico, l'asse x rappresenta la concentrazione delle vescicole extracellulari e l'asse y rappresenta le variazioni di piega nella permeabilità endoteliale lette a 590 nanometri. Successivamente, per determinare la sensibilità delle cellule endoteliali con il trattamento con puromicina, è stata tracciata una curva di uccisione. La curva di uccisione mostra che meno di 0,15 microgrammi per millilitro di puromicina sono sufficienti per uccidere tutte le cellule.Inoltre, per determinare il livello di espressione del micro-RNA451a isolato dalle cellule endoteliali, è stata eseguita la PCR quantitativa in tempo reale. I grafici a barre mostrano una significativa sovraespressione del trascritto micro-RNA451a contro il gene U6 della governante. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare il ruolo delle vescicole extracellulari nell'interazione con l'ospite e nella comunicazione cellulare attraverso il trasferimento di materiale genetico. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'assorbimento delle vescicole extracellulari da parte delle cellule riceventi e di come studiare la funzione dell'RNA nella regolazione delle cellule endoteliali.Non dimenticare che lavorare con i parassiti della malaria e il sangue umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come indossare guanti, camice da laboratorio e lavorare sotto un cappuccio sterile.

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Immunologia e Infezioni

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Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).

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Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell'immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell'infezione. Questo è un test in vitro che misura l'uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.

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Scopri come isolare e visualizzare le vescicole extracellulari rilasciate da eritrociti infettati da Plasmodium falciparum. Questo metodo permette di studiare la comunicazione parassita-ospite e le funzioni regolatorie del RNA vescicolare nelle cellule endoteliali.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

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