Name: Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Scopri il metodo zFRAP per valutare la rilassatezza della cromatina negli zigoti senza comprometterne lo sviluppo a termine. Questa tecnica non invasiva aiuta a studiare la biologia dello sviluppo embrionale.

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Ringraziamo Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida per fornire supporto tecnico e commenti critici. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia programma per promuovere la riforma delle università nazionali al modus operandi; la società giapponese per la promozione della scienza (16h 02593), Asada Science Foundation e la Fondazione di scienza di Takeda a T.W. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Questo studio è stato svolto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università di Yamanashi. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell'Università di Yamanashi (permesso numero: A24-50). Tutti gli interventi sono stati eseguiti in anestesia tribromoethanol, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. Una panoramica illustrata delle procedure e l'orario sono mostrati in Figura 1 e tabella 1, rispettivamente.
1. preparazione di RNA messaggero (In Vitro trascrizione del mRNA di eGFP-H2B)
<ol><li>Linearizzare 5 µ g di DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 modello con 30 U di non ho in 50 µ l a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Raccogliere 1,5 µ l di DNA digerito per conferma se completamente digeriti mediante elettroforesi.<ol>
<li>Applicare 1,5 µ l e 3-5 µ l di DNA digerito con caricamento tintura nel pozzetto del gel di agarosio al 2%, rispettivamente e sottoposti ad elettroforesi. Nota: Se completamente digerito, si osserva una banda singola (circa 5 kb). DNA non digerito viene utilizzato come un controllo, che viene visualizzato in una posizione diversa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 151.5 µ l di ddH2O e 200 µ l di fenolo/cloroformio/isoamil alcool (25:24:1) per i restanti digerito il DNA.<ol>
<li>Mescolare energicamente dal vortice.</li>
		<li>Centrifugare a massima velocità per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 200 µ l di cloroformio.<ol>
<li>Mescolare energicamente dal vortice.</li>
		<li>Centrifugare a massima velocità per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3M e 1,5 µ l di ethachinmate.<ol>
<li>Mescolare energicamente dal vortice.</li>
		<li>550 µ l di etanolo al 100% e poi mescolare vigorosamente Vortex.</li>
		<li>Centrifugare a massima velocità per 15 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.</li>
		<li>Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sciogliere il DNA del plasmide precipitata in 8 µ l di acqua priva di nucleasi.</li>
	<li>Valutare la concentrazione di plasmide (concentrazione prevista è di circa 300-500 ng / µ l) con nanodrop seguendo le istruzioni del fabbricante.</li>
	<li>Eseguire trascrizione in vitro per mRNA codificante eGFP-H2B con 1 µ g di DNA purificato come un modello in 20 µ l di volume di reazione totale seguendo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Dopo la trascrizione in vitro , aggiungere 36 μL di acqua poi recuperare 1,5 µ l da 56 µ l di mRNA sintetizzato per l'analisi mediante elettroforesi (come senza poli A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire tailing A poli per mRNA sintetizzato in un 100 µ l di reazione seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Aggiungere 60 µ l di soluzione di precipitazione del cloruro di litio poli un mRNA munito di eGFP-H2B e poi mescolare vigorosamente.<ol>
<li>Raffreddare a-30 ° C per 30 min.</li>
		<li>Centrifugare a massima velocità per 15 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.</li>
		<li>Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva la pallina con 20 µ l di acqua priva di nucleasi di riscaldamento a 55 ° C per 30 min.</li>
	<li>Valutare la concentrazione del mRNA precipitato con nanodrop. Diluire a 500 ng / µ l con acqua priva di nucleasi e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Confermare la produzione di mRNA preferito; soggetti 1 µ l di mRNA con/senza (ottenuti in 1.8.1 e 1,12 passaggi, rispettivamente) poli una coda miscelata con 1,5 µ l di 0,1 mg/mL di bromuro di etidio e 3 µ l di colorante di caricamento del campione per l'analisi di elettroforesi. Volume applicata era 5,5 µ l. Nota: Se coda di Poly A è stata completata, la band spostata rispetto al mRNA senza poli una coda dovrebbe essere osservata (Figura 2A).</li>
</ol>2. preparazione dei topi maschii di vasectomia
<ol><li>Pesare i topi ICR maschii alle 8-12 mesi, utilizzando una scala di peso.</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare topi maschi con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL. Nota: La quantità di anestesia dipende dalle dimensioni del mouse. Ad esempio, un mouse con un peso 40 g viene iniettato con 0,8 mL di anestesia tribromoethanol.</li>
	<li>Bagnate la bacca con etanolo al 70%.</li>
	<li>Fare un piccolo taglio (3-5 mm) sulla bacca e poi fare un'incisione sulla parete muscolare con l'aiuto di forbici. Nota: Forbici e pinze devono essere pulite con etanolo al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Afferrare un rilievo grasso con forcipe ed estrarla delicatamente. Poi, il testicolo ed il dotto deferente appaiono. Nota: Vaso deferente è un tubo a forma di U e con un vaso di sangue rosso.</li>
	<li>Legare il dotto deferente in due punti con suture chirurgiche e poi tagliare la parte centrale tra i punti vincolati.</li>
	<li>Spingere delicatamente indietro il rilievo grasso e testicolo nella bacca.<ol>
<li>Ripetere l'intervento chirurgico con il testicolo rimanente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cucire la parete muscolare con due punti di sutura con sutura chirurgica.</li>
</ol>3. IVF
<ol><li>Iniettare 8 - 10 - settimana-vecchio B6D2F1 femminile (BDF1) topi intraperitonealmente con 7,5 IU gonadotropina corionica equina (eCG) e gonadotropina corionica umana (hCG) all'intervallo h 46-50.</li>
	<li>Preparare gocce di 300 µ l umano tubarica (HTF)8 mezzi fluidi per capacitazione e inseminazione 1 giorno prima della fecondazione in vitro in un piatto di 30 mm, coprire queste gocce con l'olio minerale sul banco di laboratorio e poi preincubate in un'incubatrice durante la notte.</li>
	<li>Sacrificare i topi ICR maschii stagionati di dislocazione cervicale. Sezionare cauda epididimo con un ago 27 G e raccogliere spermatozoo. Loro cultura per capacitazione a 300 µ l di media HTF per 1-2 h a 38 ° C.</li>
	<li>16 h dopo l'iniezione di hCG, sacrificare super ovulati topi femminili di dislocazione cervicale. Trasferire il ampulla ovidotto in olio minerale accanto supporto HTF e poi tirare fuori cellule del cumulo e ovociti complessi da questa ampolla ovidotto da un ago 30-G nel mezzo preincubato inseminazione-HTF. Nota: Alcuni topi femminili non mostrano spesso ovulazione malgrado il trattamento di superovulazione. Ovidotto allargata ampolla è un segno di ovulazione.</li>
	<li>Dopo capacitazione, trasferimento 2-3 µ l dello spermatozoo capacitato in media di inseminazione-HTF in cui sono stati raccolti gli ovociti ovulated.</li>
	<li>1 h dopo l'inseminazione, raccogliere gli zigoti fecondati e trattarli con ialuronidasi a 100 µ g/mL per 10 min in media9 CZB. Nota: Quando l'inseminazione viene eseguita correttamente, 1 h dopo l'inseminazione, gli zigoti fecondati con il corpo di polar 2nd sono osservati. Se lo sperma viene utilizzato meno o bassa qualità, si osservano solo poco zigoti con il corpo di polar 2nd . Inoltre, se molti spermatozoi vengono utilizzati per l'inseminazione, gamete si verifica. Corretta inseminazione conduce a zigoti con pronuclei maschile e femminile. Utilizzando questi criteri, è possibile trovare se l'inseminazione è fatto bene o no.<ol>
<li>Dopo il lavaggio nei media CZB, sottoporre gli zigoti con un secondo corpo polare a microiniezione con eGFP-H2B mRNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazione della camera e microiniezione pipette
<ol><li>Diluire il RNA codifica eGFP-H2B utilizzando acqua priva di nucleasi per ottenere una concentrazione di 250 ng / µ l.</li>
	<li>Preparare 2-3 gocce di PVP-HTF eGFP-H2B gocce mRNA e 5-6 gocce di Hepes tamponata CZB (H-CZB) gocce sul piatto da 60 mm. Coprire queste gocce con olio minerale. Nota: Queste preparazioni possono essere eseguite sul banco di laboratorio. Non c'è nessun requisito per l'utilizzo mobile di flusso d'aria laminare.</li>
	<li>Tirare in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta (ad es., P = 500, calore = 825, pull = 30, vel = 120 e tempo = 200)</li>
	<li>Dopo aver rotto la punta della pipetta, piegare la pipetta di microiniezione di vetro tirato vicino alla punta (versione 300 µm indietro) a circa 30 ° utilizzando un microforge.</li>
</ol>5. microiniezione
<ol><li>Spegnere la piastra di riscaldamento sul palco del micromanipolatore per evitare l'uccisione degli zigoti con un piezo durante l'iniezione di mRNA.</li>
	<li>Lavare e rivestire l'interno di aghi per iniezione in HEPES-tamponata-HTF contenente 10% PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>Raccogliere gli zigoti fecondati con un corpo di polar 2nd (Figura 2B) e trasferimento di zigoti di 20-25 sulla camera della fase microscopio collegata con un micromanipolatore.</li>
	<li>Riempire il mRNA diluita eGFP-H2B nei vasi capillari di vetro borosilicato dalle punte.</li>
	<li>Tenere lo zigote con una pipetta di supporto e quindi rompere la zona pellucida e la membrana citosolica con un azionamento piezoelettrico.</li>
	<li>Iniettare circa 10 pL di mRNA nel citoplasma degli zigoti. Finitura mRNA-iniezione entro 10 min per evitare danni causati da più coltura gli zigoti all'esterno dell'incubatrice. Nota: Il volume di iniezione deve essere grande quanto il corpo polare 2nd . Se la quantità di mRNA iniettato è troppo grande, è possibile causare la frazione libera eGFP-H2B, che può influenzare la frazione mobile.</li>
	<li>10 min dopo microiniezione, lavare in almeno 3 gocce e poi cultura gli zigoti iniettati in CZB a 38 ° C fino all'analisi di zFRAP.</li>
</ol>6. zFRAP analisi
<ol><li>1 h prima dell'analisi zFRAP, accendere il laser e la piastra calda associata alla fase del microscopio confocale. Impostare la temperatura a 38 ° C.</li>
	<li>Mettere 6-10 µ l di media tamponata HEPES CZB coperto con olio minerale sul piatto inferiore 60 mm vetro e caldo della stufa fino a collezione zigote.</li>
	<li>8 - 12 h dopo l'inseminazione, raccogliere 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti e trasferimento in 6-10 µ l di pre-riscaldati goccia media CZB tamponata HEPES. Nota: Per evitare la coltura più a lungo all'esterno dell'incubatrice, 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti sono stati utilizzati a ogni analisi. 5 a 10 zigoti possono essere analizzati entro 1 h.</li>
	<li>Impostare le condizioni di formazione immagine e imbianchimento secondo le istruzioni del produttore. Il caso un laser confocale a scansione microscopio (Tabella materiali) è illustrato di seguito:<ol>
<li>Uso 60 X lente di olio (60 X 60 X / 1,35 olio). Nota: Lenti con maggiore sensibilità Visualizza ingrandimento (maggiore apertura numerica).</li>
		<li>Impostare la velocità di scansione come 4,0 µs/Pixel e dimensioni come "512" su "Impostazione di acquisizione" (Supplemental figura 1).</li>
		<li>Aumentare lo zoom digitale a "5" (Supplemental figura 1). Nota: Un alto livello zoom è necessario per riconoscere se deriva lo stato attivo si verifica o non.</li>
		<li>Aprire la lista di tintura (Supplemental figura 1) e scegliere "EGFP". Impostare il tempo di osservazione come 1.6 s (intervallo è impostato come "free run" impostazione) (Supplemental figura 1) Nota: Più punti di osservazione possono causare dati più dettagliati, ma esso può anche causare la fototossicità. Nell'analisi zFRAP, un tempo di osservazione s 1,6 sembra essere sufficiente a rilevare l'asimmetria dei genitori di scioltezza della cromatina.</li>
		<li>Impostare il numero di immagini come 12 in totale (Supplemental figura 1).</li>
		<li>Avviare il pannello di "Impostazione di stimolo" e quindi fare clic su "Main" su UseScanner. Impostare la velocità come 10.0 µs/Pixel di scansione. Fare clic su "Attivazione in serie" e quindi impostare MultiOEM come "3 fotogrammi" e tempo di attivazione come "5 sec" (Supplemental figura 1).</li>
		<li>Fare clic su "Focus x 2" e impostare lo stato attivo e quindi "Stop".</li>
		<li>Impostare lo sbiancamento e potere del laser di imaging (477 nm) a 110 e 15 µW, rispettivamente, di regolazione "gage potenza del laser" (Supplemental figura 1). Nota: Sbianca molto forte può causare una più grande zona sbiancata, che provoca difficoltà di analisi quantitativa. Per misurare la potenza del laser, utilizzare un misuratore di potenza. È importante confermare la potenza del laser per evitare l'effetto di deterioramento temporale della potenza del laser.</li>
		<li>Fare clic su "Clip Rect" (Supplemental figura 1) nel pannello di impostazione di stimolo. Impostare l'area di interesse (ROI; rosso; ROI #1B) come 40 x 40 pixel (7,6 µm2). Preparare una regione di riferimento (REF; verde; ROI n. 2) e uno sfondo (BG; blu; ROI n. 3) utilizzando "copia ROI" e "Incolla ROI" (tasto destro del mouse). Nota: Dimensione dei Pixel può essere impostato tramite "Gestione ROI", che può essere chiamato cliccando il tasto destro del mouse quando il cursore è sul ROI. ROIs più grandi sono pensati per essere migliore dato che consente di standardizzare la dispersione del Punteggio zFRAP. Tuttavia, troppo grande di un ROI non può essere utilizzato per questa analisi perché rende più difficile evitare il corpo di precursore del nucleolo (NPB). eGFP-H2B in questo comparto è stato pensato per essere liberi dalla cromatina e ha mostrato notevole mobilità superiore3. ROI e REF aree devono essere separati per quanto possibile. Se queste due regioni sono vicini, lo sbiancamento può colpire anche la regione del Rif.</li>
		<li>Fare clic su "Live" sulla barra degli strumenti e quindi avviare "Live Plot" (Supplemental figura 1). Nota: Live trama indica l'intensità del segnale di fluorescenza all'interno di ogni ROI e viene utilizzato per regolare la potenza del laser utilizzando HV. Nota che se ROI non è selezionata, nessuna intensità verrebbe rilevato sul pannello Live trama.</li>
		<li>Determinazione della posizione di ROI Nota: ROI può essere spostate trascinandole nella posizione desiderata in pronuclei. (1) essere sicuri di evitare il nucleolo e (2) inserire il ROI intero il nucleoplasma. Non contengono la regione di fuori della zona della membrana nucleare (citoplasma) in ROI. La localizzazione di eGFP-H2B altamente è limitata nel nucleoplasma, in modo che è facile da trovare se ROI contiene citoplasma o non con la fluorescenza di eGFP-H2B. Pronuclei maschili tendono ad essere più grandi di quelli delle femmine, che sono spesso localizzate vicino al corpo di polar 2nd . Durante l'utilizzo di questi criteri, giudicare i pronuclei maschili o femminili.</li>
		<li>Fare clic su "Focus x 2" (Supplemental figura 1) e quindi regolare il calibro di potere HV del canale per EGFP in intensità di fluorescenza a circa 2000 (l'intensità di fluorescenza può essere visto nella finestra "stampa diretta").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic su "Time" e quindi "XY" (Supplemental figura 1) per avviare l'analisi di zFRAP. Nota: Se opportunamente è selezionato il pulsante di "Tempo", "t" viene visualizzato sul pulsante di "XY".<ol>
<li>Fare clic su "Serie fatto" (Supplemental figura 1), che compare dopo FRAP imaging vicino a pulsante"XY" e quindi ottenere dati analizzati FRAP.</li>
		<li>Salvare il file "2D immagine vista XXXXX" come un file denominato preferito (oib. formato di file) di "Salva come" (Ctrl + Maiusc + S può essere anche usato).</li>
		<li>Selezionare ROI, REF e BG e quindi fare clic su (Ctrl + A può essere usato anche) "Analisi delle serie" nella finestra "immagine 2D della vista".</li>
		<li>Ottenere i dati FRAP riga e quindi fare clic su "Salva" pulsante nella finestra del grafico dal vivo. Nota: Riga dati quantitativi FRAP viene salvati come file csv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per nessun controllo di zFRAP, mettere alcuni degli zigoti iniettati con mRNA sulla goccia, che è vicino al cerchio i fondo dei piatti di vetro per evitare l'effetto dall'osservazione in fluorescenza.</li>
</ol>7. dati calcolo
<ol><li>Durante l'utilizzo i dati quantitativi ottenuti, rendere il grafico della "curva di recupero" e "frazione mobile" di Excel, come illustrato in riferimenti3,7 con alcune modifiche (Vedi qui sotto e supplementari file excel).</li>
	<li>Calcolare l'intensità relativa sottraendo il valore di BG da quelli di ROI e REF in 12 immagini per ogni punto di tempo.</li>
	<li>Dividere il valore del ROI per che la Ref. Di conseguenza, può essere ottenuto 12 gol di intensità relativa standardizzata in ogni momento.</li>
	<li>Calcolare la media del punteggio relativo per il ROI in 3 immagini scattate prima foto lo sbiancamento.</li>
	<li>Calcolare il tasso di recupero. Dividere che i 12 ottenuti relativi punteggi per ROI nelle immagini scattate in ogni punto del tempo (ottenuto a 7.1.2.) dalla media del punteggio relativo prima foto dello sbiancamento (ottenuto a 7.1.3.). Disegnare la curva di recupero con l'utilizzo di questi punteggi (Figura 2E).</li>
	<li>Calcolare il tasso d'imbianchimento. Nota: Lo sbiancamento tasso (%) = 100 - tasso di recupero di immagine 4th .</li>
	<li>Calcolare la frazione mobile (MF) utilizzando la formula come segue10,11,12 MF (%) = 12th tasso di recupero (al punto finale) - Tasso di recupero 4th / candeggio tasso × 100.</li>
</ol>8. embriotransfer
<ol><li>Accoppiano femmine ICR stagionate in 8-12 mesi con topi ICR maschii vasectomia la notte prima di trasferire l'embrione consentendo loro di essere nella stessa gabbia durante la notte.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni che sono stati analizzati zFRAP e determinata a sviluppare alla fase due-cellula.</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare topi femminili con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL o con 0,35 - 0,45 mL di 0.75/4/5mg/kg medetomidina/midazolam/butorfanolo mista agenti prima del trasferimento dell'embrione. Nota: Il volume dell'anestesia è determinato dal peso del corpo dei topi. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g di peso corporeo; medetomidina/midazolam/butorfanolo miscelati agenti: 0,1 mL/10 g di peso corporeo.<ol>
<li>Trasferire questi embrioni in fase due-cellula in ovidotti dei topi ICR femminili pseudopregnant con un plug vaginale al coitum dell'alberino di 0,5 giorni (dpc).</li>
		<li>Dopo il trasferimento embrionario, mettere i topi femminili sul riscaldatore impostato a 37 ° C fino a quando si svegliano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al 18,5 dpc, sacrificare la madre surrogata di dislocazione cervicale e recuperare i cuccioli derivati da zigoti zFRAP-analizzati dalla sezione cesarean. Alcuni dei cuccioli recuperati sono stati consegnati per la madre adottiva e del loro peso corporeo sono stato valutato ogni settimana.</li>
</ol>

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<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come rivelato in questo studio, l'analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l'associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni<sup class="xr...

Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell'istone, modifica dell'istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli della struttura della cromatina zygotic per lunghi periodi, non sono mai stati metodi per valutare la qualità degli zigoti o per predire il loro sviluppo di termine nella fase di un cella analizzando la loro struttura della cromatina stabilito.
Nello studio precedente, si è scoperto che zigoti hanno una struttura della cromatina estremamente allentata3. Attualmente, scioltezza della cromatina o apertura è creduta per essere un fattore importante per la differenziazione cellulare potenziale di cellule staminali embrionali (ES)4. Le cellule ES non esibiscono omogeneità nella natura, ma sono piuttosto eterogenee; nelle colonie di cellule ES, alcuni transitoriamente acquisire un maggiore potenziale di differenziazione paragonabile a blastomeri degli embrioni in fase due-cellula. Durante questa transizione in due-cellula come stato, scioltezza della cromatina in ES cellule si trasforma in che cosa è paragonabile con fase bicellulare embrioni5. Così, scioltezza di cromatina sembra essere importante per potenziale di differenziazione cellulare ed è possibile che ampiamente aperto della cromatina in zigoti è utile per la valutazione del potenziale inerente allo sviluppo zygotic.
La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi in quanto questo metodo permette lo sviluppo successivo e anche pieno-termine sviluppo6. Come uno dei metodi di formazione immagine diretta, FRAP analisi sono stato utilizzato per esaminare la scioltezza della cromatina in embrioni preimpianto ed ES cellule3,4,5. Se scioltezza zygotic cromatina possa essere analizzato senza un effetto negativo sullo sviluppo di pieno-termine di FRAP analisi, può essere un valido strumento per la valutazione della qualità degli embrioni nella fase uno-cella. Tuttavia, non sono stati esaminati gli effetti sullo sviluppo di pieno-termine da questo metodo sperimentale. Recentemente, è stato sviluppato un sistema sperimentale utilizzando FRAP per valutare la scioltezza della cromatina zygotic. Perché questo era un nuovo sistema di osservazione per zigoti, esso è stato chiamato come zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP non ha colpito criticamente termine sviluppo è stato segnalato altrove7. In questo rapporto, il protocollo di questo metodo sperimentale è descritto.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 può essere utilizzato anche per l'analisi FRAP (riferimento #7)</td></tr><tr><td>Piastra termica</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manipolatore</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Micro Micromanipolatore</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>piastra di coltura da 35 mm</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>stile 35 x 100 mm; per FIV</td></tr><tr><td>piastra di coltura da 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>stile 60 x 15 mm; per coltura di embrioni</td></tr><tr><td>piastra di coltura da 50 mm</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>stile 50 x 9 mm; per la manipolazione sul tavolino</td></tr><tr><td>piastra con fondo in vetro da 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>piastra da 50 mm, 27 mm &phi; dimensione del foro; per analisi FRAP</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sostanze chimiche organiche per la spezialità</td><td>625071</td><td>Per l'analisi FRAP sulle piastre con fondo in vetro</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Per la fecondazione in vitro e la coltura di embrioni</td></tr><tr><td>capillare in vetro</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Per la manipolazione di zigoti di topo</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Per microiniezione di estrattore per</td></tr><tr><td>micropipette a mRNA</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97/IVF</td><td>Per la preparazione dell'iniezione o del neadle di tenuta (diametro esterno: 80 & micro; m, diametro interno: 10 &micro; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microforgia</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Kit di trascrizione</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Kit di coda Poly (A)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione PVP 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HTF tamponato HEPES contenente il 10%</td></tr><tr><td>di PVP Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Plasmide modello per l'mRNA di eGFP-H2B (riferimento #6)</td></tr><tr><td>Colorante di caricamento del campione NorthernMax Gly&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Per l'elettroforesi di mRNA trascritto in vitro</td></tr><tr><td>Fenolo cloroformio isamyl alcohol</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Non I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Misuratore di potenza otico</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Misuratore di potenza per</td></tr><tr><td>microscopio stereomico Olympus</td><td></td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di full-term

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D'importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.

zFRAP analisi con eGFP-H2B
Prodotto correttamente mRNA codificante eGFP-H2B, che è visto come una band spostata causato da poli una coda (Figura 2A), è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un 2 ° corpo polare a 1-3 h dopo l'inseminazione (Figura 2B). Otto a 12 h dopo l'inseminazione, zigoti con 2 pronuclei mostrando l'espressione di eGFP-H2B sono stati raccolti ...

Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.

Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

L'obiettivo generale di questo FRAP zigotico o zFRAP è quello di esaminare l'associazione tra la scioltezza della cromatina zigotica e il potenziale di sviluppo embrionale a termine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come lo sviluppo embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente allo zigote analizzato di svilupparsi a termine senza danni significativi.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi dell'analisi zFRAP sono difficili da apprendere perché l'impostazione delle condizioni sperimentali e il funzionamento di questa analisi sono molto complessi. Dopo aver preparato l'RNA eGFP-H2B secondo il protocollo di testo, utilizzare acqua priva di nucleasi per diluirlo a 250 nanogrammi per microlitro. In un piatto da 60 millimetri, posizionare due o tre gocce ciascuna di PVP-HTF, da cinque a sei gocce di CZB tamponato con Hepes e mRNA eGFP-H2B.Quindi, usa l'olio minerale per coprire le gocce. Utilizzando un estrattore per pipette, estrarre il vetro borosilicato. Dopo aver rotto la punta, utilizzare una microforgia per piegare la pipetta di vetro a circa 30 gradi.Prima della microiniezione, verificare che il riscaldatore della piastra sul tavolino del micromanipolatore sia spento per evitare di uccidere gli zigoti durante l'iniezione di mRNA. Quindi, utilizzando il 10% di PVP-HTF, lavare e rivestire l'interno degli aghi per iniezione. Successivamente, dalle punte, riempire i capillari di vetro con l'mRNA eGFP-H2B diluito.Raccogli gli zigoti fecondati con un secondo corpo polare e trasferisci da 20 a 25 di essi nella camera del tavolino del microscopio. Quindi, con una pipetta di contenimento, trattenere lo zigote e rompere la zona pellucida e la membrana citosolica con un azionamento piezoelettrico. Iniettare circa 10 picolitri di mRNA nel citoplasma di ogni zigote.Completare le iniezioni entro 10 minuti per evitare danni causati dalla coltura degli zigoti all'esterno dell'incubatrice. 10 minuti dopo la microiniezione, lavare gli zigoti in almeno tre gocce di CZB e coltivarli a 38 gradi Celsius fino all'analisi FRAP. Un'ora prima dell'analisi zFRAP, accendere il laser e la piastra riscaldante collegati al tavolino del microscopio confocale.Impostare la temperatura a 38 gradi Celsius. Su un piatto con fondo di vetro da 60 millimetri, pipettare da sei a 10 microlitri di terreno CZB tamponato con Hepes e coprirlo con olio minerale. Quindi, scaldare il piatto sul riscaldatore fino alla raccolta dello zigote.Per facilitare la ricerca dello zigote con il microscopio confocale, è importante mettere le gocce al centro del piatto. Da otto a 12 ore dopo l'inseminazione, raccogliere da cinque a 10 zigoti che esprimono eGFP-H2B e trasferirli in una goccia da sei a 10 microlitri di terreno CZB preriscaldato con tampone Hepes. Per eseguire un'analisi quantitativa precisa è importante posizionare lo zigote verso il centro delle gocce di CZB tamponate con Hepes.Impostare le condizioni di sbiancamento e imaging secondo le istruzioni del produttore. Ad esempio, in Impostazioni di acquisizione, impostare la velocità di scansione su quattro microsecondi per pixel e la dimensione su cinquecentododici. Aumentare lo zoom digitale a cinque, aprire la DyeList e scegliere eGFP, quindi impostare il tempo di osservazione su un punto di sei secondi e il numero di immagini su 12.Successivamente, avvia il pannello Impostazioni stimolo e su UsaScanner"fai clic su Principale"Imposta la velocità di scansione a 10 microsecondi per pixel. Fare clic su Attivazione in serie"Imposta preattivazione" su tre fotogrammi e sul tempo di attivazione su cinque secondi. Quindi, fai clic su Focus x2"e fai clic su Stop"Sotto il pannello delle impostazioni dello stimolo fare clic su Clip Rect"Imposta il ROI su 40 per 40 pixel.Fare clic su Tempo"e XY"Quindi, utilizzare un misuratore di potenza ottica per accedere alla potenza del laser. È importante avere le luci spente durante la misurazione del laser. Dopo aver regolato il calibro laser per impostare la potenza del laser di sbiancamento e imaging, sulla barra degli strumenti fare clic su Live"e quindi avviare Live Plot"Posizionare l'olio sulla lente dell'obiettivo.Posiziona la camera sul palco e poi trova gli zigoti nelle gocce. Dopo aver trovato gli zigoti, determinare la posizione ROI facendo clic su Focus x2" E poi nella finestra Live Plot" regolare il misuratore di potenza HV per l'intensità di fluorescenza del canale eGFP "a circa 2.000. Per avviare l'analisi zFRAP, fare clic su XY"Dopo l'analisi FRAP, fare clic su Serie completa"Ottieni i dati analizzati FRAP, quindi fare clic su Salva con nome"per salvare il file Immagine vista 2D"come file con nome preferito.Utilizzare Copia"ROI e Incolla"ROI per preparare rispettivamente una regione di riferimento e lo sfondo. Quindi, seleziona ROI, REF e BG, quindi nella finestra dell'immagine Vista 2D, fai clic su Analisi serie"Ottieni dati RoFRAP e quindi nella finestra Grafico in tempo reale fare clic sul pulsante Salva". Eseguire calcoli dei dati secondo il protocollo di testo.Da otto a 12 ore dopo l'inseminazione, sono stati raccolti zigoti con due pronuclei che mostravano l'espressione di eGFP-H2B e sottoposti all'analisi zFRAP. Dopo lo sbiancamento, l'intensità del segnale fluorescente eGFP-H2B si è leggermente ripresa a causa dell'afflusso di eGFP-H2B nella ROI dall'area non sbiancata nel nucleoplasma. Le curve di recupero rivelano che i pronuclei maschili si riprendono più rapidamente e con più frazioni mobili rispetto ai pronuclei femminili.Come dimostrato in queste immagini e nel grafico, dopo l'analisi di zFRAP, gli zigoti lavati e coltivati in terreno CZB si sono sviluppati fino allo stadio di blastocisti senza danni significativi. Per analizzare lo sviluppo a termine, gli embrioni allo stadio di due cellule sono stati trasferiti negli ovodotti di madri pseudo-gravide. Come riportato in questa tabella, il tasso di natalità degli embrioni analizzati con zFRAP era leggermente, ma significativamente inferiore, a quello degli embrioni intatti, ma era lo stesso di quello del controllo senza zFRAP.Inoltre, i cuccioli derivati dagli zigoti analizzati zFRAP sembravano sani e completamente sviluppati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di attendere l'altra espansione. Tutte le obiezioni di bilancio per evitare la deriva dell'attenzione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la scioltezza della cromatina negli zigoti.

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Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term (Video) | JoVE Journal

Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term

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