Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di migliorare il tasso di incorporazione di amminoacidi non canonici nelle cellule di mammifero per affrontare questioni biologiche in contesti cellulari vivi, tra cui la mappatura delle superfici di interazione proteina-proteina e la marcatura bioortogonale dei recettori di superficie. Utilizzando la soppressione del codone dell'ambra, vengono incorporati diversi amminoacidi non canonici con diverse efficienze. Abbiamo stabilito il saggio di fluorescenza per confrontare facilmente i tassi di incorporazione degli amminoacidi non canonici nelle cellule di mammifero in breve tempo.

L'incorporazione sistematica di amminoacidi foto-crosslinkanti non canonici attraverso le nostre superfici GPCR consente la mappatura dei siti di legame del ligando e fornisce preziose informazioni sul recettore di assunzione direttamente dalla cellula vitale. Incorporando amminoacidi non canonici di ultima generazione per la chimica bioortogonale, otteniamo una marcatura sito-specifica, super veloce e priva di catalizzatori di GPCR con fluorofori piccoli e luminosi per applicazioni di imaging di fascia alta in cellule di mammifero vivo. Innanzitutto, seminare 600.000 cellule HEK 293 in due millilitri di terreno di crescita completo per pozzetto in due piastre a sei pozzetti.

Preparare un numero di pozzetti pari al numero di campioni e due pozzetti aggiuntivi rispettivamente per l'EGFP wild type e un campione finto trasfettato. Un'ora prima della trasfezione, aggiungere la quantità appropriata di soluzione madre di amminoacidi non canonici appena preparata a tutti i pozzetti per una concentrazione finale di aminoacidi compresa tra 0,25 e 0,5 millimolari. Per trasfettare le cellule, mescolare un microgrammo di DNA plasmidico e codificare per la coppia t-RNA sintetasi da testare con un microgrammo di DNA plasmidico reporter in una provetta da microcentrifuga.

In provette separate, preparare una trasfezione identica utilizzando il riferimento wild type EGFP e una finta trasfezione. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con lattato a ciascuna provetta contenente il DNA. Dopo aver mescolato brevemente, aggiungere sei microlitri di un microgrammo per microlitro di PEI e soluzione salina tamponata con lattato a ciascuna provetta.

Agitare immediatamente, quindi incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Trasferire 400 microlitri di terreno cellulare da ciascun pozzetto alla miscela di DNA PEI per neutralizzare il pH. Quindi, gocciola la miscela di DNA sulle cellule.

Raccogliere le cellule 48 ore dopo la trasfezione aspirando il terreno e risciacquando le cellule una volta con due millilitri di PBS preriscaldato. Aggiungere 800 microlitri di PBS integrato con EDTA da 0,5 millimolari e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, staccare e sospendere le cellule pipettando su e giù.

Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga contenenti 200 microlitri di PBS integrati con cinque millimolari di cloruro di magnesio. Centrifugare i campioni per due minuti a 800 volte la gravità. Al termine, scartare il surnatante.

Ora, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi Tris ai pellet cellulari e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Per facilitare la lisi, vorticare ogni cinque minuti. Far girare i detriti cellulari per 10 minuti a quattro gradi Celsius e 14.000 volte la gravità.

Trasferire 90 microlitri di surnatante in piastre nere a 96 pozzetti. Quindi, misurare la fluorescenza di EGFP e mCherry utilizzando un lettore di piastre dotato del modulo di fluorescenza. Semina 500.000 293 cellule t in due millilitri di terreno di crescita completo per pozzetto in due piastre a sei pozzetti.

Per ogni posizione da schermare, preparare un pozzetto per ligando, più un pozzetto per il controllo del legame. Un'ora prima della trasfezione, aggiungere il fotoreticolante, p-azidofenilalanina, o Azi, a tutti i pozzetti fino a una concentrazione finale di 0,5 millimolari. Trasfettare una quantità totale di due microgrammi di DNA per pozzetto utilizzando un microgrammo di plasmide e codificante per il GPCR marcato con bandiera recante un codone di tag nella posizione desiderata e un microgrammo del plasmide e codificante per la coppia ortogonale dedicata ad Azi.

A 48 ore dalla trasfezione, preparare una soluzione madre di ligando 1.000x sciogliendo il ligando peptidico a una concentrazione di 100 micromolari in DMSO. Diluire la soluzione madre del legante da uno a 1.000 in tampone di legame. Sostituire il terreno cellulare con un millilitro della soluzione di legante e incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, irradiare le cellule per 20 minuti in un reticolante UV a 365 nanometri e cinque centimetri di distanza dalle cellule. Al termine, staccare le cellule mediante pipettaggio e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. Pellettare le celle per tre minuti a 800 volte la gravità.

Dopo aver scartato il surnatante, risospendere i pellet cellulari in 50 microlitri di tampone di dissociazione HEPES, o HDB, contenente un cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, congelare le cellule in azoto liquido. Quindi, scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30-45 secondi, quindi agitare brevemente.

Pellettare le membrane per 10 minuti a quattro gradi Celsius e 2500 volte la gravità. Al termine, scartare il surnatante che contiene la maggior parte delle proteine citosoliche. Risospendere accuratamente i pellet in 50 microlitri di tampone di lisi HEPES utilizzando una pipetta.

Quindi, lisare le cellule per 30 minuti sul ghiaccio, vorticando ogni cinque minuti. Successivamente, far girare i detriti cellulari per 10 minuti a quattro gradi Celsius e 14.000 volte la gravità. Trasferire immediatamente ciascun surnatante in una nuova provetta di reazione per l'analisi del western blot.

Quando il GPCR è glicosilato e le bande deboli o spalmate sono un problema nell'analisi del western blot, deglicosilare i campioni con PNGasi F per aumentare l'intensità del segnale e rendere più nitide le bande. Quindi, risolvere i campioni sulla pagina SDS standard e tamponare le proteine di trasferimento su una membrana PVDF. Dopo aver bloccato la membrana, sondarla con un anticorpo anti-ligando per rilevare l'insorgenza di reticolazione.

Per rilevare il livello di espressione dell'Azi-GPCR, sondare la membrana con un anticorpo anti-flag commerciale. Dopo aver lavato la membrana, immergerla in una soluzione di chemiluminescenza potenziata e visualizzare i segnali al buio. Seminare 100.000 cellule t HEK 293 in 600 microlitri di DMEM completo e privo di coloranti per pozzetto di un vetrino per microscopia dotato di quattro pozzetti.

Un'ora prima della trasfezione, preparare una soluzione madre fresca da 100 millimolari di TCOK e idrossido di sodio 0,2 molare e DMSO al 15%. Mescolare tre microlitri della soluzione madre TCOK con 12 microlitri di un tampone molare HEPES a pH 7,4. Aggiungere delicatamente la soluzione a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di TCOK di 0,5 millimolari.

In una provetta da microcentrifuga, diluire 200 nanogrammi del plasmide e codificante per il recettore contenente il codone ambrato e 200 nanogrammi del plasmide e codificante per la coppia ortogonale in 50 microlitri di terreno. Diluire 1,25 microlitri di lipofectamina 2.000 in 50 microlitri di terreno senza coloranti, senza siero e senza antibiotici e aggiungere la soluzione alla soluzione di DNA. Agitare immediatamente e incubare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungi i complessi lipidici del DNA alle cellule. A 24 ore dalla trasfezione, trasferire 100 microlitri di terreno da ciascun pozzetto in una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Aggiungere 1,8 microlitri di una soluzione madre di colorante fluorescente arancione tetrazina e 0,3 microlitri di una soluzione madre di colorante colorante del DNA.

Trasferire il terreno contenente i coloranti nel pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno e sciacquare delicatamente le cellule due volte con PBS per rimuovere il colorante in eccesso. Quindi, aggiungere alle cellule 600 microlitri di terreno di coltura preriscaldato e completamente privo di coloranti.

Ora, visualizza i recettori marcati con un ingrandimento di 63x utilizzando filtri appropriati per il colorante fluorescente arancione GFP e il colorante colorante del DNA. Dopo aver aggiunto la soluzione madre di agonista peptidico alle cellule, osservare l'internalizzazione al microscopio utilizzando i suddetti filtri e scattare foto dopo il verificarsi chiaramente rilevabile di internalizzazione. Diversi tRNA danno una diversa efficienza di soppressione, che si riflette chiaramente nella quantità di fluorescenza misurata.

L'incorporazione di Azi in CRF1R è risultata altamente migliorata quando si utilizza il gene Azi-tRNA sintetasi ottimizzato per il codone rispetto al gene nativo, dimostrando che anche un moderato miglioramento per una proteina solubile può avere un impatto maggiore sul livello di espressione di proteine di membrana più impegnative. Il sistema ottimizzato per l'incorporazione di Azi, incluso il gene E2 Azi RS umanizzato, è stato utilizzato per mappare la tasca di legame del CRF1R e per trovare percorsi di legame di cinque ligandi. Una banda alla dimensione corretta del prodotto reticolante nel western blot rivela che la posizione si trova in prossimità del ligando all'interno del complesso del recettore del ligando.

Molteplici colpi di reticolazione con tutti i ligandi testati hanno rivelato modelli di legame distinti per gli agonisti e gli antagonisti del peptide. Sia i dati di fluorescenza che quelli di western blot suggeriscono che il TCOK è l'amminoacido non canonico per la chimica bioortogonale che viene incorporato con la più alta efficienza della variante AF della tRNA sintetasi della paralisina. TCOK è stato incorporato in una proteina di fusione CRF1R EGFP e ha permesso l'installazione di un piccolo fluoroforo luminoso sul recettore.

Dopo l'aggiunta di un peptide Agaonist, sono stati osservati compartimenti fluorescenti in tutto il citosol, rivelando il processo fisiologico di internalizzazione dei GPCR. Per eseguire un saggio di fluorescenza, abbiamo presentato qui uno strumento semplice ed efficace per valutare e ottimizzare l'efficienza di una sintetasi TI e API nelle cellule di mammifero. Alti tassi di incorporazione sono fondamentali per l'applicazione di amminoacidi non canonici per indagare su questioni biologiche complesse.

L'incorporazione altamente efficiente di amminoacidi reticolanti non canonici consente un'ampia mappatura della superficie di praticamente qualsiasi proteina, compresi i recettori di membrana o le proteine a banda bassa. Il metodo rivela la topologia delle interfacce di interazione che possono essere ulteriormente analizzate per ottenere modelli molecolari accurati. L'elevata efficienza di incorporazione di amminoacidi non canonici di ultima generazione per la chimica bioortogonale ci consente di dotare i GPCR di piccoli fluorofori luminosi, aprendo così la strada allo studio della dinamica strutturale dei GPCR in cellule vive attraverso tecniche avanzate di microscopia.