Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cristallizzazione delle proteine, come il punto temporale di nucleazione, il meccanismo di crescita dei cristalli o come preparare nano/micro-cristalli, come studiato dal Centro di Amburgo per l'imaging ultraveloce. Il vantaggio principale di questa tecnica è il monitoraggio dell'evoluzione del campione in tempo reale, consentendo l'acquisizione di informazioni preziose, come la distribuzione radiale delle particelle in soluzione in diversi stadi di cristallizzazione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla microcristallizzazione delle proteine, può essere utilizzato anche per le proteine che vengono utilizzate per la cristallografia classica o per la crescita di grandi cristalli proteici da utilizzare per la diffrazione dei neutroni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è importante, in quanto mostra il principio di funzionamento di un dispositivo di cristallizzazione unico. Per iniziare, filtrare 16 millilitri di soluzione di tartrato di sodio 1,2 molare e 16 millilitri di acqua distillata, utilizzando un filtro per siringa sterile da 2 micron. Riempire il precipitante e le bottiglie d'acqua con cinque millilitri di soluzioni filtrate.

Quindi montare le bottiglie nei supporti della pompa della camera sperimentale. Nella finestra del software, impostare i parametri sperimentali con una temperatura di 20 gradi Celsius, un'umidità relativa di 20 e acqua come solvente. Aprire lo sportello anteriore della camera sperimentale e rimuovere il supporto del vetrino coprioggetti.

Posizionare un vetrino coprioggetti pulito e siliconato sul supporto e riposizionarlo nel dispositivo. Chiudere la camera sperimentale per garantire le condizioni ambientali. Accendi la Pompa Zero, utilizzando le caratteristiche principali della pompa che si trovano nel protocollo di testo e crea un flusso d'acqua.

Regolare il flusso d'acqua, puntando la posizione verso il centro del vetrino coprioggetti azionando manualmente la vite di regolazione designata. Spegnere la Pompa Zero, quindi accendere la Pompa Uno e creare un flusso di liquido, come prima. Regolare la posizione del flusso della Pompa Uno verso la posizione fissata per la Pompa Zero.

Dopo aver spento la Pump One, sostituire il vetrino coprioggetti usato con un nuovo vetrino coprioggetti pulito per l'esperimento di cristallizzazione. Creare un nuovo file sperimentale utilizzando il pacchetto software. Nel file sperimentale, inserire la proteina come Thaumatin, da Thaumatococcus daniellii; la concentrazione proteica è di 14 milligrammi per millilitro, il precipitante è il tartrato di sodio e la concentrazione del precipitante è di 1,2 molari.

Dopo aver caricato il nuovo file dell'esperimento per attivare queste informazioni, segnare la posizione sulla gocciolina proteica aggiungendo una piccola goccia d'acqua, utilizzando la Pompa Zero. Premere il pulsante Tara' per azzerare la microbilance. Aprire il coperchio superiore della camera sperimentale e pipettare 8 microlitri di soluzione di taumatina sul punto di riferimento dell'acqua.

Per registrare la nuova goccia di taumatina, fare prima clic su Nuova goccia per attribuire le condizioni iniziali dal file sperimentale. Quindi fare clic sul pulsante Costante per compensare la naturale evaporazione dell'acqua dalla gocciolina. Usa la telecamera CCD per verificare se la Pompa Zero sta mirando alla goccia proteica.

Regolare nuovamente la posizione della pompa zero se il flusso d'acqua punta al di fuori della goccia. Accendere il laser DLS e posizionare il raggio laser nella goccia di proteina utilizzando manualmente le viti di regolazione. Inserire i parametri DLS con una durata di misurazione di 60 secondi, un tempo di attesa tra due misurazioni di 10 secondi e un numero di misurazioni pari a 300.

Fare clic sul pulsante Avvia per avviare le misurazioni DLS. Verificare la qualità del campione selezionando una delle rappresentazioni grafiche DLS. Inserire le condizioni per la fase di evaporazione nella tabella di pianificazione, come mostrato nel protocollo di testo.

Quindi attivare la fase di evaporazione del campione facendo clic sul pulsante Automazione. Fare clic sul pulsante Stop' al termine della fase di evaporazione del campione. Attiva il pulsante costante per mantenere costante il peso della goccia.

Questa caratteristica compenserà l'eventualità di un'evaporazione naturale del campione e assicurerà che non si verifichino cambiamenti di concentrazione fino a quando non verranno intraprese ulteriori azioni. Successivamente, immettere le condizioni per la fase di aggiunta del precipitante nella tabella di pianificazione, come elencato nel protocollo di testo. Attiva la fase di aggiunta del precipitante facendo clic sul pulsante Automazione.

Per tracciare l'evoluzione della gocciolina di cristallizzazione nel tempo, controllare l'aspetto dei cristalli di taumatina utilizzando la telecamera CCD. Controllare la distribuzione granulometrica utilizzando le rappresentazioni grafiche DLS. Controllare anche l'evoluzione del peso e i parametri sperimentali utilizzando la finestra di visualizzazione.

Tutte le informazioni mostrate in questa finestra sono calcolate e visualizzate in tempo reale, in base alle variazioni di peso durante la cristallizzazione, che vengono registrate online dalla bilancia ultrasensibile. Rivestire una piastra Terasaki standard pulita aggiungendo 3 millilitri di olio di paraffina alla piastra. Erogare l'olio di paraffina sui pozzetti della piastra muovendo delicatamente la piastra con diverse angolazioni in modo che l'olio copra tutti i 72 pozzetti.

Rimuovere l'olio di paraffina in eccesso versando l'olio che galleggia sulla piastra. Fare clic sul pulsante Stop per terminare l'esperimento di cristallizzazione. Estrarre con cautela il supporto del campione contenente la gocciolina di cristallizzazione.

Con l'uso di una pipetta, posizionare due microlitri di aloquote della goccia di cristallizzazione nei pozzetti della piastra Terasaki. Recuperando la goccia di cristallizzazione in una piastra sotto olio, il campione può essere controllato periodicamente per verificarne la stabilità nella crescita dei cristalli con l'uso di un microscopio o di altre tecniche dioliste che funzionano con le piastre Terasaki. Qui è mostrata una distribuzione del grafico del raggio che mostra la crescita della dimensione delle particelle nella goccia di proteina durante l'intero processo di cristallizzazione da proteina monomerica verso la formazione di nuclei, nano-cristalli e micro-cristalli.

Qui, i grafici rappresentano l'evoluzione nel tempo del peso della gocciolina proteica, insieme alla concentrazione proteica calcolata e alla concentrazione del precipitante. Qui è mostrata una fotografia registrata di microcristalli di taumatina alla fine dell'esperimento. La gocciolina mostra una quantità molto abbondante di piccoli microcristalli saturi in soluzione proteica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e 30 minuti, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante regolare il laser DLS nei sistemi di microdosaggio nella gocciolina di proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire facilmente questo dispositivo di cristallizzazione per cristallizzare con successo un campione di proteine.

Questo metodo è possibile grazie alla diffusione dinamica della luce in situ che è direttamente accoppiata alla gocciolina di cristallizzazione. Questo ci permette di monitorare tutti i cambiamenti nella distribuzione del raggio e quindi di individuare determinati modelli di distribuzione per la cristallizzazione o la precipitazione delle proteine. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come la microscopia crioelettronica o la diffrazione elettronica per rispondere a ulteriori domande e per verificare lo stato cristallino di particelle di dimensioni sub-micrometriche in soluzione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la teoria della nucleazione a due stadi, poiché le mappe DLS mostrano un chiaro modello di distribuzione di particelle di dimensioni doppie in soluzione, che sono precedenti alla crescita dei cristalli.