Un protocollo per laboratorio Housing di turchese Killifish (Nothobranchius furzeri)

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di allevare con successo una colonia di laboratorio di killifish turchesi per studiare l'invecchiamento e le malattie legate all'età in modo rapido e ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento, ad esempio se singole mutazioni genetiche o interventi ambientali possono modulare il processo di invecchiamento nelle specie vertebrate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, seguendo i nostri protocolli di base, diversi laboratori possono ora eseguire esperimenti utilizzando killifish turchese.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché l'allevamento di killifish ha alcune caratteristiche uniche. Ad esempio, gli embrioni vengono allevati su un substrato asciutto prima della schiusa, che è molto diverso dai modelli di pesci canonici come il pesce zebra. Per iniziare, allestisci vasche di riproduzione da 9,5 litri ciascuna con un maschio di cinque settimane e due femmine di sei-sette settimane.

Quindi riempi un contenitore di plastica con sabbia autoclavata a circa due o tre centimetri di profondità e posiziona la sabbiera al centro della vasca di riproduzione. Consenti al killifish turchese di riprodursi continuamente e raccogli gli embrioni una volta alla settimana per l'incubazione degli embrioni. Per raccogliere embrioni in uno stadio cellulare da utilizzare per l'iniezione e la generazione di linee transgeniche, allestire una vasca di riproduzione con un maschio e due femmine di pesce, come appena dimostrato.

Due giorni prima della raccolta degli embrioni, trasferire il maschio in una vasca individuale e tenerlo a contatto visivo con le femmine adulte. Il giorno della raccolta, aggiungi il maschio e una sabbiera alla vasca di riproduzione e lascia che i pesci depongano le uova per due ore. Dopo aver generato e rimosso la sandbox dal serbatoio, svuota la sandbox in un colino e usa l'acqua del sistema per sciacquarla.

Quindi immergere parzialmente il colino nell'acqua del sistema e agitarlo delicatamente in modo che gli embrioni si raggruppino al centro. Utilizzando una pipetta Pasteur da due millilitri, raccogliere gli embrioni e trasferirli in una piastra di Petri da 90 millimetri con circa 40 millilitri di acqua di sistema. Al microscopio ottico, ispezionare gli embrioni nella capsula di Petri e rimuovere quelli che presentano un corion rotto e segni di danneggiamento.

Dopo aver sbiancato gli embrioni secondo il protocollo di testo, ispezionare e rimuovere tutti gli embrioni morti che sarebbero macchiati di blu. Una volta che gli embrioni sono stati lasciati incubare in una soluzione fresca di blu di metilene, verificare che gli embrioni sviluppati abbiano gli occhi neri visibili. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta o una pinzetta curva fine, trasferisci gli embrioni su una piastra di carta da filtro.

Conservare gli embrioni non sviluppati in blu di metilene e monitorarli quotidianamente. Una volta che gli occhi neri si sono sviluppati, trasferirli su un substrato solido. Con una pinza, stendere gli embrioni a circa cinque millimetri di distanza fino a 100 embrioni per piastra da 90 millimetri.

Quindi usa la paraffina per sigillare il piatto e incuba gli embrioni a 28 gradi Celsius per due o tre settimane fino a quando non hanno completamente sviluppato le iridi dorate e sono pronti per la schiusa. Per la conservazione a lungo termine fino a un anno, dopo l'incubazione in soluzione di blu di metilene per tre giorni, trasferire gli embrioni su piastre di substrato solido come appena dimostrato e incubarli a 17 gradi Celsius. Per far schiudere il pesce, utilizzare una pinzetta ricurva fine per trasferire con cura da 50 a 100 embrioni sviluppati nella scatola di schiusa e immergerli completamente in una soluzione di acido umico a una profondità non superiore a due centimetri a quattro gradi Celsius.

Una fase fondamentale di questo protocollo è la schiusa degli embrioni di killifish, che si ottiene trasferendo gli embrioni incubati su un substrato asciutto in una soluzione di schiusa contenente acido umico dotata di sufficiente aerazione. Copri la scatola di schiusa con un coperchio e incubala a 28 gradi Celsius in un'incubatrice da schiusa. Per fornire un'aerazione sufficiente, collegare la scatola a un'alimentazione d'aria con tubo.

Per mantenere un'adeguata qualità dell'acqua nella scatola di schiusa, una volta al giorno a partire dal giorno successivo alla schiusa, riempire la scatola con un rapporto di uno a uno di acqua del sistema autoclavato mantenendo una profondità finale di due centimetri. Trasferisci gli embrioni non schiusi nel substrato solido e tenta la schiusa una settimana dopo. Per allevare pesci giovani e adulti a cinque giorni dalla schiusa, spostare i giovani nel sistema di ricircolo dell'acqua utilizzando pipette di plastica usa e getta o un cucchiaio di plastica per trasferire con cura cinque giovani per vasca da 0,8 litri dotata di uno schermo per avannotti da 400 micrometri.

A 14 giorni di età, trasferire i pesci giovani in una vasca da 2,8 litri dotata di uno schermo per avannotti da 850 micrometri. Da questo punto in poi, etichettare ogni acquario con un ID pesce.Per i test di sopravvivenza, alloggiare individualmente ogni pesce in un unico acquario. Anche i pesci allevati per i saggi di sopravvivenza sono alloggiati individualmente in una vasca da 2,8 litri.

Per i successivi sette giorni, nutrire i giovani due volte al giorno con cinque millilitri di artemia salina integrati con uno o tre vermi di sangue vivi. A quattro settimane di età, nutri ogni pesce due volte al giorno con artemia salina e un millilitro di vermi del sangue. In questa fase, assicurarsi che il pesce raggiunga la completa maturazione sessuale controllando la presenza di grandi pinne dorsali, anali e caudali con segni di colorazione nei maschi e addomi rotondi pieni di uova nelle femmine.

Qui è mostrata una curva di sopravvivenza rappresentativa per 70 killifish turchesi maschi. Un allevamento corretto si traduce in una sopravvivenza mediana che varia da 12 a 28 settimane nel ceppo GRZ. Le variazioni della sopravvivenza mediana dipendono dalla dieta, dalla frequenza di alimentazione e dalle condizioni di temperatura della stabulazione.

La curva di sopravvivenza per i pesci allevati in condizioni di allevamento inadeguato rivela un aumento della mortalità precoce e ripetuti cali improvvisi della sopravvivenza nel tempo rispetto ai pesci allevati in condizioni di allevamento ottimali. Seguendo questo protocollo, è importante monitorare attentamente le condizioni dell'acqua e il cibo in eccesso degli avannotti appena nati, poiché è essenziale che questi siano mantenuti in un ambiente pulito. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare le manipolazioni sperimentali nel killifish turchese, tra cui la transgenesi, l'editing del genoma e le manipolazioni dietetiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allevare con successo i killifish turchesi in laboratorio e utilizzare questo modello per esplorare la biologia dell'invecchiamento nei vertebrati dalla vita più breve che possono essere allevati in cattività.