Name: Un protocollo per laboratorio Housing di turchese Killifish (Nothobranchius furzeri) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Impara a allevare Nothobranchius furzeri in laboratorio per studi sull'invecchiamento. Questo protocollo standardizzato consente ricerche ad alto rendimento su malattie legate all'età e fattori ambientali nei vertebrati.

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Vi ringraziamo Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar e tutti i membri del laboratorio Valenzano presso l'Istituto Max Planck per la biologia dell'invecchiamento per contribuire a diversi aspetti del protocollo attuale Killi allevamento nel corso degli anni.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Tutti gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari e non finanziari.

Descriviamo un protocollo per la coltura di laboratorio di killifish turchese, tra cui la raccolta degli embrioni, incubazione, come pure la custodia di pesci adulti, allevamento e alimentazione. Il nostro protocollo destinato specificamente ai laboratori che effettuano ricerca incentrata su pesci adulti, in particolare per gli studi sperimentali su invecchiamento e durata. Killifish turchese può essere generato su un impianto di zebrafish standard; Tuttavia, importanti aspetti di allevamento killifish differiscono da standard zebrafish cura16. Queste modifiche includono una transizione precoce da una dieta di Artemia solo ad una dieta completata con verme di sangue ricco di proteine, come pure i passaggi specifici dell'incubazione di embrione, costituito da una fase di incubazione liquidi ed asciutti.
Fasi critiche all'interno del protocollo includono spedizioni embrioni intervallo di temperatura di 8-30 ° C. In caso di allevamento, fecondità dipende dall'alimentazione di frequenza e la qualità del cibo; Pertanto, si consiglia almeno due poppate al giorno per allevamento serbatoio per aumentare la resa di embrioni (vedere paragrafo 5.6.). Durante lo sbiancamento dell'embrione, non si estendono incubazione dell'embrione nella soluzione sbianca. Ciò potrebbe causare danni al corion dell'uovo e dell'embrione aumentata mortalità. Quando incubando gli embrioni con blu di metilene, non prolungare la incubazione di pronto-a-tratteggio embrioni per più di 2 settimane in quanto riducono drammaticamente la loro sopravvivenza. Da cova killifish turchese, bassa temperatura della soluzione di acido umico migliora schiusa e completa immersione degli embrioni nella soluzione consente schiusa sincronizzato. Non sufficiente areazione durante i risultati di incubazione in elevati tassi di fry non in grado di riempire la vescica gassosa (fenotipo "pancia-slider", vedere le note nella sezione 5.1).
Limitazione del protocollo per l'allevamento comprende l'uso del substrato sabbia che pone sfide ai sistemi di filtrazione centralizzati e dovrebbero essere sostituiti in futuro da metodi alternativi. Possibili alternative potrebbero essere l'uso di zebrafish allevamento serbatoi. Candeggio embrione potrebbe causare grandi cambiamenti chimico-fisici in corion dell'uovo che potrebbe tradursi in fisiologia alterata corion e da cova di successo. L'esposizione costante degli embrioni al blu di metilene può indurre cambiamenti a lungo termine in fisiologia di pesci adulti. Allevamento dei pesci adulti in singoli serbatoi per studi di coorte di sopravvivenza può influenzare negativamente il comportamento dei pesci e salute. Tuttavia, la stabulazione in gruppo per studi di coorte di sopravvivenza aggiunge significativi fattori di confusione dovuto all'istituzione di dominanza sociale e territori maschi, portando a rigorose gerarchie sociali. Di conseguenza, noi giudichiamo che l'isolamento dei pesci maschi per studi di sopravvivenza è un compromesso ragionevole. Colonie di killifish laboratorio d'alimentazione con cibo vivo da fonti non controllate aggiungere un rischio di contaminazioni esterne da parassiti e comunità microbiche potenzialmente patogene. In futuro, dovrebbe essere sviluppato un feed pesce sterile ad hoc.
Futuri miglioramenti al presente protocollo si concentreranno su una dieta controllata, non-live, che conduce ancora a completare la maturazione sessuale entro 3-4 settimane. In sintesi, il nostro protocollo offre accessibilità alla turchese killifish laboratorio coltura ad una comunità ampia scientifica.

Data la loro vita breve e rapido ciclo di vita, turchese killifish sono in rapida crescita come un promettente nuovo organismo modello in biologia1,2,3. Questa specie è caratterizzata da un unico ciclo di vita per un teleosteo, comprensivi di diapausa embrionale, rapida maturazione sessuale e una lunga durata sui fase4,5. Lavoro recente ha contribuito a delucidare la biologia di questa specie sia in cattività che in selvatici6,7. Killifish turchese vivono in corpi di acqua dolce stagionale che si formano durante la stagione delle piogge nella savana africana in Zimbabwe e Mozambico. Durante la stagione secca, gli embrioni sopravvivono nel fango secco in assenza di acqua in virtù di una fase della vita resistente alle sollecitazioni chiamata diapausa.
Mappe genetiche per questa specie sono stati generati8,9, e recentemente il loro genoma è stato sequenziato e assemblato10,11. Sono stati sviluppati diversi ceppi di pesce inbred laboratorio e transgenesi e genoma editing tramite CRISPR/Cas9 si sono resi disponibili in questa specie, di fatto promuovere killifish turchese come organismo vertebrato modello competitivo laboratorio 12,13,14.
Anche se un protocollo di laboratorio è già stato pubblicato per questa specie15, nel presente protocollo sviluppiamo un elenco completo delle linee guida di laboratorio sperimentale che mirano in particolare a studi che indagano l'invecchiamento e la sopravvivenza. Il presente protocollo consente ai ricercatori già familiari con zebrafish e medaka nell'allevamento di diventare esperti in allevamento turchese killifish adottando un numero minimo di regolazioni chiave. Allo stesso tempo, questo protocollo fornisce ai ricercatori senza precedente esperienza in allevamento di pesce con gli strumenti essenziali per generare una fiorente colonia di killifish turchese.

<table><tbody><tr><td>Soluzione tampone di calibrazione della sonda pH=7,0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>Soluzione tampone da 1 litro pH=7,0 per calibrare l'elettrodo di pH del sistema idrico</td></tr> Soluzione <tr><td>tampone di calibrazione della sonda pH=4,0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>Soluzione tampone da 1 litro pH=4,0 per calibrare l'elettrodo di pH del sistema idrico Standard di</td></tr><tr><td>conducibilità</td><td>VWR</td><td>83607,260</td><td>500 mL Standard di conducibilità 1.413 uS/cm per calibrare il sistema idrico Elettrodo di conducibilità</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Strisce reattive per la determinazione dei valori di cloro nell'acqua dell'impianto</td></tr><tr><td>Test dell'ammoniaca</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Test per la determinazione del contenuto di ammoniaca nell'acqua dell'impianto</td></tr><tr><td>Mar Rosso Sale del Mar</td><td>Rosso Secchio da</td><td></td><td>22 kg</td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Acido umico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Nuovo HUFA Artemia arricchimento ZM</td><td>Systems UK</td><td></td><td>Flacone da 75 g</td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (con / p)</td></tr> <tr><td>Fibra di cocco</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Carta Whatman</td><td>GE healthcare</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo puro</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr> <tr><td>sabbia silicea</td><td>negozio</td><td></td><td></td>di animali locale</tr><tr><td>Artemia Eggs</td><td>Levigatrici</td><td></td><td></td>di qualità premium</tr><tr><td>Bloodworm</td><td>distributore</td><td></td> locale <td>Poseidon Aquakultur Germania</td></tr><tr><td>dNTPs soluzione miscela</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8.0 soluzione</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Acquari</td><td>Volume di aquaneering</td><td></td><td>: 0,8 L, 2,8 L, 9,5 L; dotato di deflettori, rete per avannotti e coperchi Agitatore</td></tr><tr><td>orbitale</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>modello 5000</td></tr><tr><td>Incubatrice microbiologica</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>modello IMC18; per la conservazione di embrioni in fase liquida, impostata su t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Incubatrice di raffreddamento</td><td>Binder</td><td>9020-0209</td><td>modello KT115; per la conservazione di embrioni in fase solida, impostata su t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Incubatrice da cova</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>modello OGS180; per embrioni da schiusa, impostata a t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td></td><td>modello M80</td></tr><tr><td>Sabbia da riproduzione/scatole da schiusa</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL Tubo conico</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo conico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in plastica monouso</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2mL; Per l'alimentazione dei pesci con vermi di sangue o la selezione di embrioni, tagliare la punta per aprire 3-4 mm di diametro</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td> Siringa <td>da 50 ml</td></tr><tr><td></td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Finezza del filtro</td><td></td><td></td> in metallo <td>< 1 mm; per raccolta di embrioni</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>tipo5/45; per trasferimento di embrioni</td></tr><tr><td>25 L Schiusa per artemia salina</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>schiusa principale</td></tr><tr><td>500 mL Schiusa per artemia salina</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>modello Artemio 1; schiusa di riserva</td></tr><tr><td>Reti da pesca a maglie strette</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere di sabbia</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>Bicchiere di separazione per artemia salina</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Sacchetto di plastica con cerniera</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>per la conservazione del pesce morto</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>modello Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Tubo dell'aria</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>4-6 mm diametro</td></tr><tr><td>1 L Bottiglia di vetro</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Bottiglia di vetro</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Bottiglia da spremere</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>per l'alimentazione dei pesci con artemia salina</td></tr><tr><td>120-&#956; m filtro per artemia salina</td><td>Florida Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>per la raccolta di artemia salina/bloodworm</td></tr><tr><td>Finish filter socks</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956; m</td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td>di stabulazione dei pesci a filtrazione centralizzata</td><td>Aquaneering, Techniplast, Habitat acquatici, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

un protocollo per laboratorio housing di turchese killifish (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

Lo sviluppo di pratiche di allevamento in laboratorio non-modello pesci utilizzati a fini sperimentali ha notevolmente beneficiato l'istituzione dei pesci di riferimento sistemi modello, come zebrafish e medaka. Negli ultimi anni, un pesce emergente – il turchese killifish (Nothobranchius furzeri) – è stato adottato da un numero crescente di gruppi di ricerca nei campi della biologia di invecchiamento ed ecologia. Con una durata di vita in cattività di 4-8 mesi, questa specie è il più breve durato vertebrato allevato in cattività e consente alla comunità scientifica di prova – in tempi brevi – interventi sperimentali che possono portare ad alterazioni del tasso di invecchiamento e l'aspettativa di vita. Dato l'unica biologia di questa specie, caratterizzata dalla diapausa embrionale, maturazione sessuale esplosiva, contrassegnato morfologica e comportamento dimorfismo sessuale - e loro relativamente breve durata adulto - allevamento ad hoc pratiche sono in urgente domanda. Questo protocollo segnala un insieme di misure di allevamento chiave che consentono ottimali killifish turchese cura di laboratorio, che consente alla comunità scientifica di adottare questa specie come un modello animale di laboratorio potente.

Allevamento corretto killifish turchese si traduce in sopravvivenza mediana compresa tra 12-18 settimane nel ceppo GRZ (ad es. la Figura 4A). Variazioni di sopravvivenza mediana dipendono dalla dieta, alimentazione frequenza e temperatura condizioni abitative. Risultati di allevamento poveri in curve di sopravvivenza che presenta aumentato mortalità precoce e ripetitivi, improvvisi gocce di sopravvivenza nel corso del tempo, caratterizzata da diversi punti di flesso (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> Figura 1: rappresentante stadi di sviluppo embrionale con substrato incubazione rispettivi. (A) appena raccolti embrioni, incubati in soluzione di blu di metilene nell'incubatore a 28 ° C. (B) gli embrioni pronti per essere trasferito al mezzo solido, filtrare fibra di carta o di cocco. (C) embrioni pronto a schiudersi, visualizzazione tipiche dorate iridi. La barra della scala è pari a 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> Figura 2: fasi del turchese killifish post-schiusa sviluppo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> Figura 3: tag ID pesce rappresentativo per pesce fin dalla fase 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> Figura 4: curva di sopravvivenza rappresentativo per 70 Killi turchese maschi. (A) curva di sopravvivenza tipico per laboratorio-generato turchese killifish. (B) confronto delle curve di sopravvivenza ottenuti da pesci allevati in condizioni ottimali di allevamento (nero) e allevamento povero (rosso e blu). La linea orizzontale rossa tratteggiata indica 50% sopravvivenza, curva di sopravvivenza che si intersecano a durata mediana (indicata sull'asse x). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Forward primer</td>
			<td colspan="2">Reverse primer</td>
			<td>Intervallo di grandezza (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - marcatori di determinazione del sesso</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Gli iniettori di genotipizzazione per l'identificazione del ceppo.

Alloggiamento di laboratorio di turchese killifish può essere scalato a casa e in modo efficiente generare migliaia di singoli pesci in un sistema di filtrazione di acqua centralizzata, impiegando la stessa infrastruttura utilizzata per strutture standard zebrafish. Qui dettagliamo un elenco di procedure standardizzate che consentono killifish efficiente manutenzione.

Un protocollo per laboratorio Housing di turchese Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di allevare con successo una colonia di laboratorio di killifish turchesi per studiare l'invecchiamento e le malattie legate all'età in modo rapido e ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento, ad esempio se singole mutazioni genetiche o interventi ambientali possono modulare il processo di invecchiamento nelle specie vertebrate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, seguendo i nostri protocolli di base, diversi laboratori possono ora eseguire esperimenti utilizzando killifish turchese.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché l'allevamento di killifish ha alcune caratteristiche uniche. Ad esempio, gli embrioni vengono allevati su un substrato asciutto prima della schiusa, che è molto diverso dai modelli di pesci canonici come il pesce zebra. Per iniziare, allestisci vasche di riproduzione da 9,5 litri ciascuna con un maschio di cinque settimane e due femmine di sei-sette settimane.Quindi riempi un contenitore di plastica con sabbia autoclavata a circa due o tre centimetri di profondità e posiziona la sabbiera al centro della vasca di riproduzione. Consenti al killifish turchese di riprodursi continuamente e raccogli gli embrioni una volta alla settimana per l'incubazione degli embrioni. Per raccogliere embrioni in uno stadio cellulare da utilizzare per l'iniezione e la generazione di linee transgeniche, allestire una vasca di riproduzione con un maschio e due femmine di pesce, come appena dimostrato.Due giorni prima della raccolta degli embrioni, trasferire il maschio in una vasca individuale e tenerlo a contatto visivo con le femmine adulte. Il giorno della raccolta, aggiungi il maschio e una sabbiera alla vasca di riproduzione e lascia che i pesci depongano le uova per due ore. Dopo aver generato e rimosso la sandbox dal serbatoio, svuota la sandbox in un colino e usa l'acqua del sistema per sciacquarla.Quindi immergere parzialmente il colino nell'acqua del sistema e agitarlo delicatamente in modo che gli embrioni si raggruppino al centro. Utilizzando una pipetta Pasteur da due millilitri, raccogliere gli embrioni e trasferirli in una piastra di Petri da 90 millimetri con circa 40 millilitri di acqua di sistema. Al microscopio ottico, ispezionare gli embrioni nella capsula di Petri e rimuovere quelli che presentano un corion rotto e segni di danneggiamento.Dopo aver sbiancato gli embrioni secondo il protocollo di testo, ispezionare e rimuovere tutti gli embrioni morti che sarebbero macchiati di blu. Una volta che gli embrioni sono stati lasciati incubare in una soluzione fresca di blu di metilene, verificare che gli embrioni sviluppati abbiano gli occhi neri visibili. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta o una pinzetta curva fine, trasferisci gli embrioni su una piastra di carta da filtro.Conservare gli embrioni non sviluppati in blu di metilene e monitorarli quotidianamente. Una volta che gli occhi neri si sono sviluppati, trasferirli su un substrato solido. Con una pinza, stendere gli embrioni a circa cinque millimetri di distanza fino a 100 embrioni per piastra da 90 millimetri.Quindi usa la paraffina per sigillare il piatto e incuba gli embrioni a 28 gradi Celsius per due o tre settimane fino a quando non hanno completamente sviluppato le iridi dorate e sono pronti per la schiusa. Per la conservazione a lungo termine fino a un anno, dopo l'incubazione in soluzione di blu di metilene per tre giorni, trasferire gli embrioni su piastre di substrato solido come appena dimostrato e incubarli a 17 gradi Celsius. Per far schiudere il pesce, utilizzare una pinzetta ricurva fine per trasferire con cura da 50 a 100 embrioni sviluppati nella scatola di schiusa e immergerli completamente in una soluzione di acido umico a una profondità non superiore a due centimetri a quattro gradi Celsius.Una fase fondamentale di questo protocollo è la schiusa degli embrioni di killifish, che si ottiene trasferendo gli embrioni incubati su un substrato asciutto in una soluzione di schiusa contenente acido umico dotata di sufficiente aerazione. Copri la scatola di schiusa con un coperchio e incubala a 28 gradi Celsius in un'incubatrice da schiusa. Per fornire un'aerazione sufficiente, collegare la scatola a un'alimentazione d'aria con tubo.Per mantenere un'adeguata qualità dell'acqua nella scatola di schiusa, una volta al giorno a partire dal giorno successivo alla schiusa, riempire la scatola con un rapporto di uno a uno di acqua del sistema autoclavato mantenendo una profondità finale di due centimetri. Trasferisci gli embrioni non schiusi nel substrato solido e tenta la schiusa una settimana dopo. Per allevare pesci giovani e adulti a cinque giorni dalla schiusa, spostare i giovani nel sistema di ricircolo dell'acqua utilizzando pipette di plastica usa e getta o un cucchiaio di plastica per trasferire con cura cinque giovani per vasca da 0,8 litri dotata di uno schermo per avannotti da 400 micrometri.A 14 giorni di età, trasferire i pesci giovani in una vasca da 2,8 litri dotata di uno schermo per avannotti da 850 micrometri. Da questo punto in poi, etichettare ogni acquario con un ID pesce.Per i test di sopravvivenza, alloggiare individualmente ogni pesce in un unico acquario. Anche i pesci allevati per i saggi di sopravvivenza sono alloggiati individualmente in una vasca da 2,8 litri.Per i successivi sette giorni, nutrire i giovani due volte al giorno con cinque millilitri di artemia salina integrati con uno o tre vermi di sangue vivi. A quattro settimane di età, nutri ogni pesce due volte al giorno con artemia salina e un millilitro di vermi del sangue. In questa fase, assicurarsi che il pesce raggiunga la completa maturazione sessuale controllando la presenza di grandi pinne dorsali, anali e caudali con segni di colorazione nei maschi e addomi rotondi pieni di uova nelle femmine.Qui è mostrata una curva di sopravvivenza rappresentativa per 70 killifish turchesi maschi. Un allevamento corretto si traduce in una sopravvivenza mediana che varia da 12 a 28 settimane nel ceppo GRZ. Le variazioni della sopravvivenza mediana dipendono dalla dieta, dalla frequenza di alimentazione e dalle condizioni di temperatura della stabulazione.La curva di sopravvivenza per i pesci allevati in condizioni di allevamento inadeguato rivela un aumento della mortalità precoce e ripetuti cali improvvisi della sopravvivenza nel tempo rispetto ai pesci allevati in condizioni di allevamento ottimali. Seguendo questo protocollo, è importante monitorare attentamente le condizioni dell'acqua e il cibo in eccesso degli avannotti appena nati, poiché è essenziale che questi siano mantenuti in un ambiente pulito. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare le manipolazioni sperimentali nel killifish turchese, tra cui la transgenesi, l'editing del genoma e le manipolazioni dietetiche.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allevare con successo i killifish turchesi in laboratorio e utilizzare questo modello per esplorare la biologia dell'invecchiamento nei vertebrati dalla vita più breve che possono essere allevati in cattività.

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