Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una manipolazione genica cardio-specifica in vivo, mediante iniezione intramiocardica di adenovirus in topi adulti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca cardiovascolare sui meccanismi molecolari e allineare il danno cardiaco e l'efficacia della terapia genica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è priva di ventilazione, che i topi si riprendono rapidamente dall'intervento chirurgico e che è riproducibile e facile da eseguire.

Quindi ora iniziamo. Il giorno della procedura, riscaldare la soluzione purificata del vettore dell'adenovirus da negativi 80 gradi Celsius, conservandola in ghiaccio. Quando l'adenovirus si è scongelato, indossare una maschera facciale, un camice sterile e guanti sterili.

E spruzzare il tubo dell'adenovirus con etanolo al 75%. Trasferire il virus in una cappa sterile a flusso laminare e aspirare 50 microlitri della soluzione virale in una siringa Hamilton sterilizzata da 50 microlitri. Collegare un ago calibro 30 alla siringa.

Ruotare la siringa in posizione verticale. Premere delicatamente lo stantuffo, fino a quando una goccia di soluzione è visibile sulla punta dell'ago, per riempire la punta dell'ago con il virus. Quindi, aspirare con cura altri 30 microlitri di soluzione di adenovirus nella siringa e posizionare la siringa sul ghiaccio.

Per iniettare l'adenovirus nel cuore di un topo, confermare il livello appropriato di sedazione in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Radere la parte superiore del torace e l'addome dell'animale. Applicare la crema depilatoria disponibile in commercio sulla pelle esposta.

Utilizzando una garza bagnata per rimuovere la crema e gli eventuali peli rimasti dopo un minuto. Utilizzando tre scrub antisettici a base di clorexidina allo iodio, sterilizzare la parte inferiore sinistra del torace. Quindi, copri l'animale con un telo chirurgico, con un foro praticato sopra l'area chirurgica, e indossa un nuovo paio di guanti sterili.

Successivamente, utilizzando tecniche e strumenti sterili, praticare un'incisione cutanea di 0,5 centimetri dallo xifoide all'ascella e utilizzare una pinza e un emostatico Micro Mosquito per sezionare senza mezzi termini i muscoli pettorali maggiori e minori. Ritrarre i muscoli pettorali maggiori e minori per esporre lo spazio intercostale. E usa l'emostatico Micro Mosquito per perforare e aprire il quarto spazio intercostale.

Premere delicatamente contro il lato destro della parete toracica con l'indice della mano non dominante per spostare il cuore verso l'incisione. Quindi fissare con cura il cuore esternalizzato con l'indice e il pollice della stessa mano e utilizzare la mano dominante per iniettare 10 microlitri di soluzione di adenovirus nel miocardio di ciascuna delle pareti ventrale, dorsale e laterale del ventricolo sinistro. Dopo l'ultima iniezione, riportare immediatamente il cuore nello spazio intratoracico.

E premere delicatamente la parete toracica verso il sito dell'incisione, per evacuare manualmente l'aria dallo spazio intratoracico. Chiudere la pelle con una sutura di seta a cinque ott, in un modello di materasso orizzontale, e posizionare il mouse su un termoforo a 37 gradi Celsius con monitoraggio fino al completo recupero. Quindi, sterilizzare la siringa Hamilton usata e l'ago calibro 30 in uno sterilizzatore ad alta temperatura e ad alta pressione e gettare l'ago sterilizzato in un contenitore per oggetti taglienti appropriato.

Cinque giorni dopo l'iniezione intramiocardica di adenovirus contenente luciferasi, l'imaging in vivo indica una robusta sovraespressione di luciferasi, in particolare nel cuore, che può essere confermata dall'analisi Western blot, suggerendo l'assenza di trasduzione d'organo non bersaglio. L'analisi del western blot indica anche un aumento significativo dell'espressione del recettore della vitamina D. E il ventricolo sinistro dei topi a cui è stato iniettato un adenovirus che codifica per il recettore della vitamina D.

Con una ridotta espressione del recettore evidente negli animali iniettati con adenovirus che codifica per una forcina a pelo corto che prende di mira il recettore della vitamina D RNA. Al contrario, l'espressione del recettore della vitamina D non è significativamente modificata nei ventricoli destri di entrambi gli animali iniettati nel ventricolo sinistro. Una volta padroneggiato, questo metodo può essere completato in due minuti, se viene eseguito correttamente.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'iniezione di cellule cardiache possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'efficacia di specifiche terapie cellulari negli infarti del miocardio.