Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle infezioni cellulari e della microbiologia, come ad esempio il modo in cui gli emociti contribuiscono alla risposta immunitaria complessiva nei moscerini della frutta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in laboratorio, utilizzando larve precedentemente infette. In alternativa, gli emociti di larve non infette possono essere utilizzati per l'infezione ex vivo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di imaging sono difficili da apprendere a causa della complessità del microscopio confocale e delle opzioni per la ricostruzione del modello 3D. Per iniziare il protocollo, sovrapponi due o tre pezzi di pellicola di paraffina da dieci centimetri per dieci centimetri sotto uno stereomicroscopio. Quindi, preparare il capillare di vetro impostando il riscaldatore polare capillare al 55% del massimo.

Formare il tubo capillare fino a una punta acuminata di circa dieci micrometri. Riempire il capillare con olio minerale. Assemblare il tubo capillare riempito sul nanoiniettore.

E aprire la punta del tubo capillare fuso rompendo la punta con una pinza. Espellere quanto più olio possibile dalla punta del tubo capillare, quindi riempire il tubo con un mezzo isolante per emociti di drosophila o DHIM. Per una facile visualizzazione del bordo dell'olio di emolinfano, includere una bolla d'aria tra l'olio e il DHIM.

Usando una pinza, raccogli delicatamente dieci larve di drosofila di terzo stadio dalla parete interna delle fiale di cibo e mettile in un colino da 100 micrometri. Versare cinque millilitri di acqua sterile sulle larve e agitare il colino per cinque secondi. Posiziona il colino su una salvietta per rimuovere l'acqua in eccesso.

Trasferire le larve in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, anestetizzarle con gas CO2 per cinque secondi. Quindi, posizionare le larve su una pellicola di paraffina sotto lo stereomicroscopio, con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Posizionare leggermente il capillare di vetro sul corpo larvale posteriore per tenerlo in posizione e aprire la cuticola posteriore utilizzando una pinza a punta fine.

Lasciare che l'emolinfa fluisca sul film di paraffina. Crea una pozza di emolinfa, compresi gli emociti, da 20 a 50 larve alla volta, sulla pellicola di paraffina. Utilizzare il capillare di vetro sul nanoiniettore per assorbire l'emolinfa accumulata.

Espellere l'emolinfa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di DHIM. Mettere la pasta di lievito su una piastra di agar per succo d'uva. Fai un taglio fine nell'agar dove le larve possono migrare per evitare che si secchino.

Assemblare un ago di tungsteno appuntito da 0,001 millimetri con una pinza di tenuta utilizzando una pellicola di paraffina. Pipettare 50 microlitri di C.Burnetii ad alto titolo, che esprime mCherry, sulla pellicola di paraffina sotto lo stereomicroscopio e posizionare le larve nel pool di batteri. Bucherellare le larve con un ago di tungsteno.

Trasferire le larve su una piastra di agar. Trasferire il terreno patogeno rimanente sulla piastra di agar e sigillare la piastra con un film di paraffina. Conservare le larve sulla piastra in aria umida fino al momento desiderato dopo l'infezione.

Lasciare le larve infette da C.Burnetii sulla piastra per 24 ore. Posizionare un vetro di copertura rotondo da 12 millimetri in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pipettare 500 microlitri di DHIM nel pozzetto.

Estrarre e assorbire l'emolinfa dalle larve precedentemente infette, quindi espellere l'emolinfa nel pozzo. Centrifugare la piastra a 1000 G per cinque minuti. Configura il microscopio confocale per l'imaging a tre colori di DAPI, EGFP e mCherry.

Posizionare il campione sul microscopio e mettere a fuoco il campione utilizzando un obiettivo con apertura numerica 63x 1,4. Individuare gli emociti desiderati nel campo visivo per l'imaging. Quindi, regolare la potenza del laser e i guadagni del rivelatore per ottenere l'esposizione appropriata del campione.

Controllare più piani Z per assicurarsi che il livello di esposizione sia appropriato per l'intero spessore del campione. Quindi, trova la posizione superiore e inferiore sull'asse Z di un intero emocita. Impostare queste posizioni come posizioni iniziale e finale per il sezionamento Z.

Utilizzare lo zoom di scansione per visualizzare l'area contenente l'emocita. Raccogli le serie di immagini alla risoluzione appropriata, ad esempio 1024 x 1024 pixel nel piano X Y e una spaziatura di 0,3 micrometri nella dimensione Z. Importare il file della serie di immagini sezionate Z nel software associato al microscopio confocale per la ricostruzione del modello 3D.

Selezionare una co-localizzazione cellulare di nuclei colorati con DAPI e C.Burnetii che esprime mCherry in un emocita che esprime EGFP. Ritaglia la serie di immagini in modo che contenga solo la singola cella. Seleziona l'opzione visualizzatore 3D, che ricostruisce il modello 3D utilizzando l'algoritmo preconfezionato del software.

Scegli il tipo di immagine desiderato per la rappresentazione 3D tra le opzioni di fusione, superficie e mista. In questo metodo, gli emociti, i nuclei e C.Burnetii vengono mostrati utilizzando modelli di superficie. Osserva la cella ricostruita in 3D da varie posizioni di visualizzazione tenendo premuto il pulsante del mouse e trascinando il cursore sullo schermo.

Regolare l'orientamento e la posizione della cella della sorgente luminosa modellata per ottimizzare l'immagine. Infine, è possibile eseguire il rilevamento delle sezioni trasversali attraverso il modello utilizzando i comandi di ritaglio e sezionamento per visualizzare il contenuto interno dell'emocita. La visualizzazione degli emociti vivi estratti che esprimono EGFP sotto il controllo del driver dell'emoloctina da più immagini mostra che la maggior parte delle cellule DAPI-positive sono anche EGFP-positive.

Sezioni trasversali di emociti infetti da Coxiella Burnetii confermano la presenza di batteri che esprimono mCherry all'interno della cellula. Le immagini sono state ricostruite in modelli 3D e abbiamo osservato che in vivo gli emociti infetti mostravano maggiori estensioni citoplasmatiche ed erano di natura più piatta. Mentre gli emociti infetti ex vivo erano più sferici.

Le sezioni trasversali di entrambi i modelli confermano la presenza di Coxiella che esprime mCherry all'interno della cellula. Gli emociti estratti sono stati infettati con IIV6 e applicati all'analisi qRT PCR, che ha mostrato livelli significativamente più elevati del trascritto IIV6-193R tra le cellule mock e quelle infettate da IIV6. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di avere tutti i terreni preparati in anticipo e bilanciati a temperatura ambiente in modo che le cellule non rimangano prive dei nutrienti adeguati per troppo tempo.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la ricerca dell'RNA a singola cellula, per rispondere a ulteriori domande, come la risposta complessiva dell'ospite all'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuta i ricercatori in immunologia e microbiologia a esplorare l'invasione dei patogeni e le risposte dell'ospite nei moscerini della frutta o in altri animali con sistemi circolatori aperti.