Name: Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e lanalisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Impara l'estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per studiare infezioni microbiche e risposte immunitarie. Questo metodo consente la ricostruzione 3D cellulare mediante microscopia confocale.

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Siamo grati al Dr. Robert Heinzen per fornire scorte di mCherry-esprimendo il burnetii della coxiella. Ringraziamo il Dr. Luis Teixeira per la fornitura di invertebrati marini iridescente virus 6 e il centro di Stock di Bloomington per fornire scorte volare. Questo progetto è stato finanziato in parte dalla concessione di NIH R00 AI106963 (al A.G.G) e Washington State University.

1. infezione ex vivo
<ol><li>Medium e attrezzature<ol>
<li>In condizioni di sterilità, preparare fresco Drosophila emociti isolamento medio (DHIM) contenente di 75% Schneider Drosophila medie con 25% siero bovino fetale (FBS) e filtro sterilizzarlo.</li>
		<li>Strato 2-3 pezzi di pellicola di paraffina di 10 x 10 cm sotto un microscopio stereoscopico.</li>
		<li>Preparare il capillare di vetro. Impostare la stufa capillare estrattore al 55% del massimo. Tirare il tubo capillare di una punta acuminata di circa 10 µm.</li>
		<li>Recupero di informazioni del capillare con olio minerale.</li>
		<li>Assemblare il tubo capillare riempito sul nanoinjector (Figura 1A) e aprire punta fuso tubo capillare rompendo fuori la punta con il forcipe (Figura 1B). Il diametro esterno della punta dovrebbe essere 100 µm per facile assorbimento degli emociti.</li>
		<li>Espellere tanto olio quanto possibile dalla punta tubo capillare, quindi riempire con DHIM. Per una visualizzazione semplice del bordo dell'emolinfa up-preso e l'olio, includono una bolla d'aria tra l'olio e DHIM (Figura 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrazione di emolinfa<ol>
<li>Scegli 3rd instar larve di Drosophila dall'interno muro di cibo fiale delicatamente usando il forcipe e inserirli in un colino di 100 µm (Figura 1C). 3rd instar larve si trovano 3-6 giorni successivi fertile uova da una femmina adulta. Nota: Questi esperimenti usato il genotipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, poiché emociti da questi animali esprimono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) per aiutare nella identificazione delle cellule mediante microscopia.</li>
		<li>Versare 5 mL di acqua sterile sopra larve e scuotere il filtro per 5 s. posto il filtro sulla cancellazione di attività eliminare l'acqua in eccesso (Figura 1C').</li>
		<li>Trasferire le larve in una microcentrifuga da 1,5 mL. Anestetizzare li con CO2 gas per 5 s (Figura 1D).</li>
		<li>Posizionare le larve sulla pellicola di paraffina sotto lo stereomicroscopio, con il dorso rivolto verso l'alto (Figura 2A).</li>
		<li>Luogo il vetro capillare leggermente sul corpo posteriore larvale per tenerlo in posizione e disturbare la cuticola posteriore aperto utilizzando una pinzetta appuntita (Figura 2B).</li>
		<li>Consentire l'emolinfa di fluire sulla pellicola paraffina (Figura 2C).</li>
		<li>Rendere un pool di emolinfa compreso emociti da larve di 20-50 alla volta sul film di paraffina.</li>
		<li>Prendere l'emolinfa pool utilizzando il vetro capillare su nanoinjector (Figura 2D). Nota: Ci dovrebbe essere di circa 10-20 µ l di emolinfa.</li>
		<li>Espellere l'emolinfa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 µ l di DHIM (Figura 2E).</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 1.2.4) - 1.2.9) per ogni batch di larve.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contare il numero di emociti.<ol>
<li>Pipettare 5 µ l di soluzione di blu di Trypan 0,4% in un tubo del microcentrifuge 0,6 mL a macchiare le cellule morte. Delicatamente mescolare il DHIM ed emociti nel tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta e trasferire 5 µ l di DHIM tra cui emociti al tubo del microcentrifuge 0,6 mL e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di cellule da miscela 1:1 di Trypan blu: emociti nell'emocitometro.</li>
		<li>Contare il numero di emociti dal vivo che non sono macchiati con Trypan blu in ogni campo 4 angolo dell'hemocytomter e calcolare la concentrazione di emociti per millilitro usando la formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> dove X è la concentrazione di emociti live per millilitro; a, b, c e d sono contato il numero di cellule vive (come determinato dall'esclusione del Trypan blu) in ogni 4 dei campi nell'emocitometro. Divisione per 2 il numero totale di cellule contate è dovuto alla diluizione di 1:1 delle cellule con Trypan blue. Le cellule colorate con Trypan blue sono considerate morte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex vivo Infezioni<ol>
<li>Determinare il numero di pozzetti di essere seminato con celle basate su punti temporali e biologico replica necessario per ogni esperimento. 5.0 × 104 emociti sono desiderabili per la purificazione di RNA e proteine dopo l'infezione.</li>
		<li>Calcolare il volume di stock di agente patogeno essere diluiti con DHIM per infezione utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> dove molteplicità di infezione (MOI) è il numero di virali o batteri desiderato per ogni cella. Nota: MOI utilizzato dipende dal singolo esperimento e analisi eseguite. Qui, 10 equivalenti di genoma (GE) / cellula di c. burnetii, 10 CFU/di Listeriao 1 TCID50valore di IIV6 è stato usato.</li>
		<li>Preparare 500 µ l di terreno di agente patogeno per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti aggiungendo un volume adeguato di DHIM al volume virale o batterico in un tubo.</li>
		<li>Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.</li>
		<li>Dividere il DHIM compreso gli emociti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di agente patogeno di emociti in un pozzo.</li>
		<li>Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Incubare la piastra per 1 h a 28 ° C. Ogni 15 min, inclinare delicatamente la piastra dalla parte posteriore a anteriore, quindi da sinistra a destra per 5 s a mano.</li>
		<li>Dopo 1 h di passaggio invasione/allegato 1.4.8), delicatamente Pipettare fuori il mezzo di agente patogeno e lavare gli emociti con DHIM fresco e riempirlo con 500 µ l di DHIM fresca.</li>
		<li>Incubare gli emociti infetti per il tempo desiderato. In questi esperimenti, da c. burnetii- o IIV6-infettati emociti vengono incubati per 24 h e Listeria-emociti infetti vengono incubate per 1, 2 o 4 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. infezione in vivo
<ol><li>Infezione<ol>
<li>Caldo il piatto di agar succo frutta Drosophila a temperatura ambiente per 15 min. piastre sono realizzati come precedentemente descritto20.<ol>
<li>Aggiungere 30 g di agar a 700 mL di acqua e autoclave per 40 min.</li>
			<li>Sciogliere 0,5 g di paraben metilico in 10 mL di etanolo assoluto.</li>
			<li>Aggiungere la soluzione di paraben metilico in 300 mL di succo di frutta concentrato.</li>
			<li>Mescolare il succo concentrato nella soluzione agar sterilizzato nell'autoclave e pipettare 5 mL in 10 × 35 mm piastre Petri rapidamente.</li>
			<li>Dopo le piastre sono raffreddati per 15 min, conservarli a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 3rd instar larve come segue 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Posizionare la pasta di lievito su una piastra di agar. Fare un taglio sottile nella piastra di agar dove le larve possono migrare per evitare la disidratazione (Figura 3A). Montare un ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm con che tiene il forcipe usando la pellicola di paraffina (Figura 3B, C).</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di alto-titolo mCherry esprimenti -da c. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) sulla paraffina della pellicola sotto il microscopio stereo e posizionare le larve nella piscina di batteri.</li>
		<li>Posizionare le larve nella piscina di batteri. Pungere le larve con un ago di tungsteno (Figura 3D). Trasferire le larve su una piastra di agar (Figura 3E).</li>
		<li>Trasferire il restante mezzo agente patogeno sulla piastra di agar e sigillare la piastra con la pellicola di paraffina.</li>
		<li>Mantenere le larve sulla piastra in aria umida fino a quando post-l'infezione tempo desiderato (Figura 3F). In questo esperimento, da c. burnetii-larve infette sono sul piatto per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrazione di emolinfa e placcatura di emociti<ol>
<li>Preparare il mezzo e attrezzatura seguendo passo 1.1).</li>
		<li>Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pipettare 500 µ l di DHIM nel pozzo.</li>
		<li>Estrarre l'emolinfa dalle larve infette come segue 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>Espellere l'emolinfa in seguito di ben punto 2.2.2).</li>
		<li>Ripetere 2.2.3) e 2.2.4) per più gruppi di larve.</li>
		<li>Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualizzazione
<ol><li>Fissazione e colorazione<ol>
<li>Dopo aver consentito l'emociti di stabilirsi sul vetro di copertura rotondo nel pozzo, rimuovere delicatamente il mezzo da ogni pozzetto.</li>
		<li>Delicatamente aggiungere 200 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) in ciascun pozzetto di emociti depositati. Incubare gli emociti per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il 4% PFA e delicatamente aggiungere 200 µ l di PBS contenente 0,1% Triton X-100 e 1% albumina di siero bovino (BSA) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e delicatamente aggiungere 200 µ l di 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min al buio a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione DAPI e aggiungere delicatamente PBS in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Goccia 10 µ l del mezzo di montaggio antifade su un vetrino per microscopio.</li>
		<li>Dopo aver rimosso il PBS da ogni pozzetto, è necessario rimuovere il vetro di copertura dalla piastra 24 pozzetti utilizzando forcipe ammenda-aguzzo. Posizionare delicatamente il vetro di copertura sul supporto montaggio antifade su vetrino, con gli emociti rivolto verso il basso.</li>
		<li>Lasciar asciugare inserendolo nella notte scura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formazione immagine confocal<ol>
<li>Configurare il microscopio confocale per formazione immagine di DAPI, EGFP e mCherry tre di colore. Utilizzare la seguente impostazione: eccitazione DAPI (ex) 405 nm, emissione (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Posizionare il campione sul microscopio e messa a fuoco sul campione utilizzando un 63 X / 1.4 obiettivo apertura numerica (NA). Individuare gli emociti desiderati nel campo di vista per l'imaging.</li>
		<li>Regolare i guadagni di potenza e rilevatore laser per ottenere esposizione appropriata del campione. Verifica z-piani multipli per garantire che il livello di esposizione è appropriato per lo spessore dell'intero campione.</li>
		<li>Trovare la posizione superiore e inferiore sull'asse z di un intero emociti. Impostare queste posizioni come le posizioni di inizio e di fine per il sezionamento di z.</li>
		<li>Utilizzare solo scansione zoom all'immagine l'area che contiene l'emociti. Spesso vengono utilizzati fattori di zoom di 3x.</li>
		<li>Raccogliere la serie di immagini a risoluzione appropriata come 1024 x 1024 pixel nel piano x-y e 0,3 µm spaziatura nella dimensione z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ricostruzione del modello 3D Nota: Il software Open source esistente che esegue molte delle funzioni descritte di seguito per la ricostruzione del modello 3D.<ol>
<li>Importare il file di serie z-sezionato immagine nel software associato con il microscopio confocale per la ricostruzione del modello 3D.</li>
		<li>Selezionare una cella risultati co-localizzazione dei nuclei macchiato con DAPI e mCherry esprimendo da c. burnetii in un EGFP esprimendo emociti. Ritagliare l'immagine in serie per contenere solo la singola cella.</li>
		<li>Selezionare l'opzione Visualizzatore 3D che ricostruisce il modello 3D utilizzando pre-confezionati algoritmo del software. Scegliere il tipo di rappresentazione 3D tra Blend, superficie e opzioni miste desiderato. In questo metodo, emociti, nei nuclei e da c. burnetii sono illustrati utilizzando modelli di superficie.</li>
		<li>Osservare la cella ricostruita 3D da diverse angolazioni di visualizzazione tenendo premuto il pulsante del mouse e trascinando il cursore sullo schermo. Regolare l'orientamento della cella e la posizione della sorgente luminosa modellata per ottimizzare l'immagine. Esistono altre opzioni per opacità, minimo e massimo soglia, speculare, Ambient, Shineness e Gamma per ottimizzare l'immagine.</li>
		<li>Prendere le sezioni trasversali attraverso il modello utilizzando i comandi di clipping e sezionamento per visualizzare il contenuto interno degli emociti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'applicazione per l'analisi genica e/o proteine
<ol><li>Dopo l'infezione con IIV6 e Listeria, lisare cellule per successive qRT-PCR o analisi Western blot come precedentemente descritto21 e le istruzioni del produttore riportato di seguito. Nota: Consultare la Tabella dei materiali per i primers per qRT-PCR e gli anticorpi per la macchia occidentale.</li>
	<li>Analizzare i prodotti di PCR di elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto in precedenza22, per garantire la corretta lunghezza del prodotto amplificato.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Per comprendere meglio come cellule dell'ospite infettate, è importante chiarire la localizzazione dell'agente patogeno nelle cellule, soprattutto quando si sperimenta il patogeno non precedentemente testato e cella tipo combinazioni4. Mentre studiando la cascata di risposta cellulare dopo l'infezione può indicare invasione produttivo dell'agente patogeno, la combinazione dei dati di risposta cellulare e imaging è essenziale per dimostrare l'infezione e l'invasione dell'agente patogeno. Mentre i r...

Drosophila melanogaster è un organismo modello consolidata per lo studio della immunità innata1. Durante la risposta immunitaria innata, emociti gioca un ruolo importante nella risposta alla sfida di agente patogeno. Emociti sono critici per incapsulare i parassiti, oltre ad avere una funzione importante nella lotta contro l'agente patogeno attraverso azione fagocitica durante infezione fungine, virali e batteriche2,3.
Al fine di meglio comprendere la risposta immunitaria innata dell'ospite all'infezione microbica patogena, è importante visualizzare come l'agente patogeno invade le cellule dell'ospite durante l'infezione. Questa visualizzazione contribuisce alla comprensione del meccanismo di invasione. Insieme ai dettagli della localizzazione intracellulare di agente patogeno e la risposta cellulare, questi dati possono fornire indizi circa la risposta dell'ospite all'infezione ed organelli cellulari con cui interagisce il microbo. Così, la ricostruzione del modello 3D dopo formazione immagine di microscopia può essere utile per determinare l'esatta posizione di agenti patogeni e cellule ospiti. In questo studio, abbiamo visualizzato l'invasione della Coxiella burnetii (c. burnetii), l'agente eziologico della febbre Q, una malattia zoonotica che rappresenta una grave minaccia per la salute umana e animale, in primarie emociti di Drosophila . Recentemente, è stato dimostrato che Drosophila sono sensibili al livello di biosicurezza 2 fase di Nine Mile II (NMII) clonare 4 ceppo di c. burnetii e che questo ceppo è in grado di replicare in drosofila4, che indica che Drosofila può essere utilizzato come organismo modello per studiare la patogenesi da c. burnetii .
Gli studi precedenti hanno usato emociti di esaminare la risposta immunitaria innata dell'ospite. Emociti sono stati utilizzati per osservazioni morfologiche5,6,7, analisi morfometrica2,8, fagocitosi analisi2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitazione10,11, analisi immunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Anche se le cellule della drosofila S2 sono anche disponibile per vari esperimenti in vitro , immortalizzazione e potenziale pre-esistente infezione virale cambiare loro comportamento15,16. L'utilizzo di cellule primarie al contrario di una linea di cellule immortalizzate, quali cellule S2, consente lo studio della funzione immune innata in un sistema più rappresentativo dell'intero organismo. Inoltre, l'infezione di emociti in vivoprima dell'estrazione, permette alle cellule di interagire con altre proteine ospite ed il tessuto, un vantaggio sopra estrazione di emociti prima dell'infezione ex vivo . Un numero di metodi differenti è stato utilizzato per ottenere un numero sufficiente di emociti in un breve periodo di tempo per mantenere l'emociti vivo8,17,18,19.
In questo studio, presentiamo un metodo per estrarre emociti da Drosophila 3rd instar larve per infezione microbica patogena con da c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) o invertebrato iridescente Virus 6 (IIV6). Descriviamo i metodi per le infezioni di emociti sia in vivo ed ex vivo . In vivo- ed ex vivo-emociti infetti sono stati visualizzati con microscopia confocale e utilizzati per creare modelli 3D di invasione da c. burnetii . Inoltre, utilizzando il protocollo di estrazione, ex vivo-emociti infetti sono stati utilizzati per l'espressione genica e proteica saggi. In particolare, per esaminare l'estensione dell'infezione con IIV6 e Listeria, RNA o la proteina totale è stata isolata dalle cellule per qRT-PCR o analisi Western blot. Presi insieme, il protocollo fornisce i metodi per raccogliere rapidamente un numero elevato di emociti da 3rd instar larve e prove che primari emociti, infetto in vivo o ex vivo, sono una piattaforma adatta per microbica agente patogeno infezione studi e analisi applicabili a valle quali microscopia, trascrittomica e proteomica.

<table><tbody><tr><td>Schneider's Drosophila Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filtro (0.22 &micro; L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Filtro (100 &; micro; m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Estrattore capillare</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Drosophila piatti di succo di frutta</td><td>Cold Spring Harbor Protocolli</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td></td><td>Agar Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Metil parabene</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch's 100% succo d'uva concentrato congelato, 340 ml Amazon</td><td></td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Lievito, Panettieri essiccati Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Aggiungere 2 parti di acqua a 1 parte di lievito (v/v)</td></tr><tr><td>Ago di tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Pinza di tenuta</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Microsope confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X Microscopio a scansione laser confocale a luce bianca</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>Software per la ricostruzione dell'imaging</td><td>3D Leica</td><td>LASX con modulo</td> <td>di visualizzazione 3D3.3)</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Virus iridescente invertebrato 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>ceppo: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes ceppo 10403S (Bishop e Hinrichs, 1987) è stato coltivato in brodo Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences) contenente 50 &; micro; g/ml di streptomicina a 30 °C.</td></tr>Kit di sintesi del cDNA per <tr><td>la degradazione del gDNA</td> <td>18068015 DNase I Thermo</td><td>Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>1708891</td> per la</tr><tr>sintesi del <td></td><td>cDNA</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr> RpII_qRTPCR_rev <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Reagente qRT-PCR verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-actina prodotto nel coniglio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG (H+L), HRP coniugato</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

estrazione di emociti da larve di drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Durante l'infezione patogena di Drosophila melanogaster, emociti gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria durante l'infezione. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di sviluppare un metodo per visualizzare l'invasione di agente patogeno in un apposito comparto immune di mosche, vale a dire emociti. Utilizzando il metodo presentato qui, fino a 3 × 106 live emociti sono ottenibili da 200 drosofila 3rd instar larve in 30 min per infezione ex vivo . In alternativa, emociti possono essere infetti in vivo attraverso l'iniezione di 3rd instar larve seguita da estrazione di emociti post-all'infezione 24 h. Queste cellule primarie infette sono stati corretti, macchiato e imaging utilizzando la microscopia confocale. Quindi, rappresentazioni in 3D sono stati generati da immagini per mostrare definitivamente l'invasione dell'agente patogeno. Inoltre, può essere ottenuto RNA di alta qualità per qRT-PCR per la rilevazione delle seguenti mRNA patogeno infezione e sufficienti proteine possono essere estratte da queste cellule per l'analisi Western blot. Presi insieme, presentiamo un metodo per la riconciliazione definitiva dell'invasione di agente patogeno e conferma dell'infezione utilizzando tipi di agente patogeno batterico e virale e un metodo efficiente per l'estrazione di emociti per ottenere abbastanza emociti dal vivo dalla drosofila larve per esperimenti di infezione ex vivo ed in vivo .

Per raccogliere vivere emociti per infezione ex vivo , fino a 3 × 106 emociti sono stati estratti da 200 drosofila 3rd instar larve. Per sviluppare il nostro metodo, una serie di diverse tecniche sono stata tentata. Dissezione larvale individuale sarebbe prendere fino a 1,5 h, e una media di ~ 8000 cellule sono state ottenute utilizzando questo metodo18, la maggior parte dei quali non erano viva alla fine della raccolta. Succ...

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle infezioni cellulari e della microbiologia, come ad esempio il modo in cui gli emociti contribuiscono alla risposta immunitaria complessiva nei moscerini della frutta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in laboratorio, utilizzando larve precedentemente infette. In alternativa, gli emociti di larve non infette possono essere utilizzati per l'infezione ex vivo.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di imaging sono difficili da apprendere a causa della complessità del microscopio confocale e delle opzioni per la ricostruzione del modello 3D. Per iniziare il protocollo, sovrapponi due o tre pezzi di pellicola di paraffina da dieci centimetri per dieci centimetri sotto uno stereomicroscopio. Quindi, preparare il capillare di vetro impostando il riscaldatore polare capillare al 55% del massimo.Formare il tubo capillare fino a una punta acuminata di circa dieci micrometri. Riempire il capillare con olio minerale. Assemblare il tubo capillare riempito sul nanoiniettore.E aprire la punta del tubo capillare fuso rompendo la punta con una pinza. Espellere qu

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

L'emolinfa di Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante gli stadi larvali e adulti. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.

Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Fonte: Hiroyasu, A., D et al., Estrazione di emociti dalle larve di Drosophila melanogaster per infezioni e analisi microbiche. J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra la procedura per stabilire un'infezione batterica nelle larve di Drosophila inserendole in una goccia batterica e pungendola con un ago di tungsteno. Le larve vengono poi incubate su una piastra agar scanalata e ricca di nutrienti per studiare le interazioni ospite-patogeno.

Stabilimento dell'infezione batterica nelle larve di Drosophila

Fonte: Hiroyasu, A., et al. Estrazione di emociti dalle larve di Drosophila melanogaster per infezioni e analisi di microbi. J. Vis. Esp. (2018)Questo video dimostra immagini confocali ad alta risoluzione degli emociti di Drosophila melanogaster infettati da Coxiella burnetii per visualizzare la localizzazione del patogeno in 3D, consentendo un'analisi dettagliata della dinamica delle infezioni intracellulari e delle interazioni ospite-patogeno.

Imaging confocale ad alta risoluzione degli emociti di Drosophila infettati da patogeni

Questo video dimostra il test di disturbo dell'emocita, valutando la riadesione degli emociti nelle tasche ematopoietiche delle larve di Drosophila. Il disturbo meccanico rilascia gli emociti residenti, aumentando la conta degli emociti circolanti. Dopo il recupero, la riaderenza degli emociti residenti è confermata, illustrando la reversibilità.

Un test di disturbo degli emociti per valutare la riadesione degli emociti alle tasche ematopoietiche

Drosophila melanogaster è un eccezionale organismo modello per lo studio del sistema immunitario innato e delle conseguenze fisiologiche di infezioni e malattie. Questo protocollo descrive come somministrare infezioni batteriche robuste e quantitativamente ripetibili a D. melanogaster e come misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Le cellule del sangue di Drosophila, o emociti, si alternano tra i siti residenti e la circolazione.  Nella larva, gli emociti residenti (sessili) si localizzano in microambienti induttivi, le tasche ematopoietiche, mentre gli emociti circolanti si muovono liberamente nell'emolinfa. L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e la quantificazione standardizzati di queste due popolazioni di emociti, comportamentali distinte ma interscambianti.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e condividono molte caratteristiche comuni, rendendo Drosophila un modello genetico interessante per lo studio ematopoiesi. Qui mostriamo dissezione e montaggio del grande organo ematopoietico larvale per immunoistochimica. Descriviamo anche metodi per saggiare i vari compartimenti ematopoietici larvali tra emociti circolanti e le cellule di cristallo sessili.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

Questo protocollo descrive un saggio in vivo di fagocitosi usato per valutare e quantificare la capacità degli emociti di Drosophila melanogaster giovani e invecchiati di batteri fagocitosi.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.

Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva

Impara l'estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per studiare infezioni microbiche e risposte immunitarie. Questo metodo consente la ricostruzione 3D cellulare mediante microscopia confocale.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

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