Un emoderivato di Test per la rilevazione di ROS1 e RET trascrizioni di fusione da acido ribonucleico usando reazione a catena della polimerasi digitale di circolazione
5 aprile 2018
Rilevamento di acido ribonucleico (cRNA) dal sangue di circolazione è un bisogno insoddisfatto in diagnostica clinica. Qui descriviamo i metodi che caratterizzano cRNA dai malati di cancro del polmone non a piccole cellule usando reazione a catena della polimerasi digitale sensibile e specifico. Le prove di soddisfano requisiti di progettazione per individuare varianti di fusione entro 72 ore.
L'obiettivo generale di questa procedura è l'isolamento e la caratterizzazione mediante PCR digitale con goccioline di acido ribonucleico circolante derivato dal tumore da campioni di sangue intero. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della diagnostica oncologica. Ad esempio, come rilevare i trascetti di fusione genica derivati dal tumore da campioni di RNA e sangue circolanti.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza metodi altamente ottimizzati per la stabilizzazione, l'estrazione e il rilevamento di varianti di RNA presenti a bassa frequenza e campioni di sangue. I test basati sul sangue sono un complemento alle tradizionali biopsie tissutali con il vantaggio di utilizzare una tecnica minimamente invasiva in grado di fornire risultati rapidi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle mutazioni clinicamente significative e sul NSCLC, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui è necessaria l'identificazione accessibile e rapida delle molecole di RNA circolanti nel sangue intero.
L'RNA circolante per la reazione di trascrizione inversa viene isolato da campioni di sangue di donatori come descritto nel protocollo di testo. Convertire il campione di RNA circolato concentrato in cDNA utilizzando un kit di reazione di trascrizione inversa disponibile in commercio, inclusi primer casuali. Includere un campione di controllo senza trascentasi inversa e un campione di controllo senza RNA.
Quando la reazione di trascrizione inversa è completa, isolare il cDNA dalla miscela di reazione, utilizzando una colonna di spin concentratore di DNA disponibile in commercio. Questo passaggio facilita la rimozione di enzimi, primer e deossinucleotidi trifosfati liberi. Se il cDNA non verrà utilizzato immediatamente nelle reazioni PCR, conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
Indossare un camice da laboratorio monouso e guanti in nitrile durante l'esecuzione di questa procedura e un'area di preparazione dei reagenti dedicata. Coprire le sonde per proteggerle dalla luce, poiché la luce successiva può sbiancare il colorante fluorescente attaccato alla sonda. Per prima cosa preparare le miscele PCR per un volume di reazione finale di 20 microlitri come indicato in questa tabella, ma senza ancora aggiungere il cDNA.
Successivamente, trasportare le miscele, coperte e protette dalla luce, in una cappa di pulizia per PCR, situata in un'area di preamplificazione separata. Distribuire le miscele su una piastra PCR. Aggiungere il cDNA da testare alla miscela PCR.
Coprire la piastra con un sigillante per piastre rimovibile. Centrifugare brevemente le piastre per raccogliere i campioni sul fondo dei pozzetti. Mescolare su uno shaker, a fuoco basso per 10 secondi.
Centrifugare nuovamente brevemente le piastre per raccogliere i campioni sul fondo del pozzetto. Rimuovere il sigillante per piastre prima di eseguire la generazione manuale delle gocce. È importante ridurre al minimo le bolle nella punta della pipetta durante il caricamento dei campioni e successivamente trasferire lentamente le goccioline dalla cartuccia alla piastra per evitare danni alle goccioline.
Trasferire con cautela 20 microlitri della miscela PCR nei pozzetti del campione sulla cartuccia per la generazione di gocce. Aggiungere 70 microlitri di olio per la generazione di gocce. Coprire con una guarnizione di gomma e trasferire la cartuccia in un generatore di gocce manuale per avviare la generazione di goccioline.
Dopo la generazione di goccioline, utilizzare i puntali consigliati dal produttore per trasferire le goccioline in una nuova piastra PCR. Aspirare ed erogare le goccioline lentamente, per 5-6 secondi ciascuna, senza toccare l'estremità della punta con la cartuccia o la piastra delle goccioline. Sigillare la piastra con un sigillante per lastre di alluminio.
Eseguire la PCR nel termociclatore utilizzando le seguenti impostazioni. Al termine del ciclo termico, leggere la piastra utilizzando un lettore di gocce. Crea un layout di piastra per il software di lettura che identifica la posizione dei controlli e dei campioni e caricalo nel software per avviare la lettura.
I risultati della lettura delle lastre vengono analizzati utilizzando un software disponibile in commercio. Per iniziare, accedere al menu di analisi per visualizzare i grafici di ampiezza 2D o bidimensionali. Valutare la qualità complessiva dei dati esaminando i dati delle goccioline.
Utilizzando il menu degli eventi, valutare i dati per il numero totale di eventi accettati. Dovrebbero esserci oltre 10.000 eventi per pozzo. In caso contrario, i dati devono essere valutati attentamente per individuare eventuali problemi aggiuntivi.
Quindi, controlla i dati per le ampiezze di fluorescenza ripugnanti. Differenze significative di ampiezza e di concentrazione tra i campioni replicati indicano una scarsa manipolazione o miscelazione dei campioni. Prendere nota dei gruppi di goccioline con modelli di spruzzatura su un asse di 45 gradi, che è indicativo di goccioline di scarsa qualità o campioni problematici.
Esaminare prima i dati per il controllo positivo, nessun controllo della trascrittasi inversa e nessun controllo dell'RNA. Selezionare tutti i campioni di controllo ed esaminare la qualità del cluster mediante grafico 2D per una corretta soglia, dovrebbe essere evidente una chiara separazione tra i cluster di goccioline. Per ogni variante di saggio, impostare la soglia in base ai pozzetti di controllo.
Imposta le soglie sui grafici 2D utilizzando gli strumenti del mirino per separare la popolazione di goccioline doppie negative dalla popolazione di geni di controllo sull'asse x e dalla popolazione di geni varianti, se presente, sull'asse y. Alcune copie da ogni pozzetto replicante per un singolo campione. Infine, esprimere i risultati del test come il numero di copie di varianti rilevate.
Utilizzando linee cellulari, che esprimono la fusione SDC4-ROS1 e la fusione CCDC6-RET, diluito sullo sfondo dell'RNA wild type umano totale, il limite di rilevamento è stato stabilito allo 0,2% di frequenza di variante con ciascuna variante di fusione. Non è stata rilevata una preparazione del 5% di RNA derivato dalla linea cellulare bersaglio, dimostrando la specificità del test. Gli standard analitici di RNA multiplex sono stati misurati ad alte, medie e basse concentrazioni in tre esecuzioni nello stesso giorno.
Tre corse in tre giorni consecutivi e con due operatori indipendenti. I risultati dimostrano un rilevamento accurato sia del trascritto di fusione di interesse che di un gene di controllo interno GUSB. Ogni bach di campioni clinici è stato anche analizzato con un controllo positivo, un controllo senza trascrittasi inversa e un controllo senza modello di RNA.
Le varianti di fusione sono rappresentate lungo l'asse y mentre GUSB è sull'asse x. Quando i controlli dei lotti sono stati valutati nel corso di 21 giorni, sono state osservate goccioline positive alla fusione e goccioline del gene di controllo GUSB per ROS1 e RET in tutte le esecuzioni. I risultati subottimali sono mostrati in presenza di contaminazione all'interno del controllo senza trascrittasi inversa, contaminazione all'interno del controllo senza RNA, condivisione e coalescenza di goccioline e condizioni di PCR scarsamente ottimizzate o inibizione della PCR.
Una volta padroneggiato, l'intero protocollo può essere eseguito in circa 12 ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare le migliori pratiche per la gestione di campioni di RNA e sangue umano. Dopo l'isolamento dell'RNA, potrebbero essere eseguiti altri metodi, come il sequenziamento di nuova generazione, per rispondere a ulteriori domande, come l'identificazione di nuove varianti di fusione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'RNA circolante dal sangue intero e dal plasma e quindi elaborare l'RNA recuperato al fine di identificare varianti rare in circolazione come RET e ROS1. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada al rilevamento di mutazioni clinicamente perseguibili dal sangue intero. E abbiamo esteso questi metodi per esaminare le trascrizioni espresse in circolazione.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dell'acido ribonucleico circolante (cRNA) da campioni di sangue di pazienti affetti da cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Utilizzando la PCR digitale a goccioline, la tecnica consente il rilevamento di trascritti di fusione genica entro 72 ore, soddisfacendo una necessità fondamentale nella diagnostica oncologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Diagnostica Clinica
- Biologia Molecolare
Sfondo
- Il rilevamento di cRNA nel sangue è essenziale per la diagnostica del cancro non invasiva.
- I metodi attuali si basano spesso su biopsie tissutali, che possono essere invasive.
- La PCR digitale a goccioline offre un'elevata sensibilità e specificità per le varianti di RNA a bassa frequenza.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di cancro oltre al NSCLC.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per rilevare trascritti di fusione genica di origine tumorale dall'RNA circolante.
- Fornire uno strumento diagnostico rapido e minimamente invasivo per i pazienti oncologici.
- Migliorare la comprensione delle mutazioni clinicamente rilevanti nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cRNA da campioni di sangue intero.
- Trascrizione inversa di cRNA in cDNA utilizzando un kit commerciale.
- Generazione di goccioline e amplificazione PCR di cDNA.
- Analisi dei risultati PCR mediante software specializzato per la valutazione dei dati.
Risultati principali
- Rilevamento con successo di trascritti di fusione con un limite di rilevazione pari a una frequenza di variante dello 0,2%.
- Specificità del saggio dimostrata, senza rilevamento di RNA fuori bersaglio.
- Risultati accurati in più ripetizioni e tra diversi operatori.
- Chiara separazione degli aggregati di goccioline, indicativa di un corretto funzionamento del saggio.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato fornisce un approccio affidabile per la rilevazione di cRNA in campioni di sangue.
- Questa tecnica può migliorare in modo significativo la diagnostica e il monitoraggio del cancro.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri tipi di cancro e a diagnosi basate sull'RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di biopsia liquida basata sul sangue risponde a un'esigenza critica insoddisfatta nella diagnostica oncologica, consentendo un rilevamento rapido e minimamente invasivo dei trascritti di fusione di ROS1 e RET dall'RNA circolante. L'approccio supporta la verifica precoce delle ipotesi terapeutiche e la stratificazione dei pazienti guidata da biomarcatori nei tumori polmonari non a piccole cellule (NSCLC) e in altri tumori solidi. Fornendo i risultati entro 72 ore, accelera le decisioni di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi e nei processi di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il rilevamento di varianti di fusione a bassa frequenza nell'RNA circolante.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili della frequenza delle varianti per supportare la valutazione dell'affidabilità del bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso la validazione ortogonale dell'attività oncogenica guidata da fusioni in formato di biopsia liquida.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera input di cRNA standardizzati adatti allo sviluppo di saggi successivi e alle campagne di screening di biomarcatori.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro robusto con un limite definito di rilevabilità (frequenza di variante dello 0,2%) e controlli di specificità per la qualificazione del saggio.
- Valore di scalabilità: Consente il rilevamento multiplex di otto varianti di ROS1 e otto varianti di RET, permettendo la valutazione parallela di biomarcatori nel contesto dello screening esplorativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega i flussi di lavoro di scoperta e preclinici fornendo letture di biopsia liquida clinicamente rilevanti che rispecchiano i risultati ottenuti con analisi tissutali.
- Conferma predittiva: Permette il monitoraggio longitudinale della dinamica delle fusioni per guidare decisioni di avanzamento proporzionate al rischio nei modelli preclinici.
- Valore di continuità: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori traslazionali rilevando le stesse varianti di fusione identificate nei modelli tumorali mediante campionamento non invasivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione dell'obiettivo all'identificazione del composto guida, fornendo una valutazione dei biomarcatori mediante biopsia liquida che orienta lo screening dei composti e il successivo studio meccanicistico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante il rilevamento di trascritti di fusione nell'RNA circolante per validare la rilevanza del bersaglio in contesti simili all'in vivo.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili di dPCR che consentono una valutazione affidabile dei composti rispetto alla segnalazione mediata da fusioni.
- Analisi: Genera letture digitali del numero di copie della variante e dei segnali del gene di controllo (GUSB) per una quantificazione precisa e confronti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si integra con la continuità preclinica monitorando la dinamica delle varianti di fusione in campioni di biopsia liquida attraverso diversi bracci terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e minimamente invasiva per campionamenti ripetuti in studi longitudinali e progetti interfunzionali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi guidati dalla fusione, grazie al rilevamento diretto di biomarcatori.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante procedure definite per l'elaborazione dei campioni, controlli e impostazione delle soglie.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni rapide di prosegui/non prosegui basate sul coinvolgimento del bersaglio confermato mediante biopsia liquida.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo evidenze precoci della modulazione del bersaglio in campioni clinicamente rilevanti.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nell'allestimento della PCR digitale e nella generazione di goccioline per prevenire il degrado del campione e la variabilità tecnica.
- È dipendente da strumentazione per la generazione di goccioline, l'amplificazione PCR e la rilevazione della fluorescenza in un ambiente controllato.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro per la raccolta dei campioni, l'elaborazione e l'analisi dei dati, al fine di garantire la comparabilità tra diversi siti e studi.
- Richiede l'adattamento del volume in ingresso e delle strategie di controllo quando applicato a diversi sistemi modello o tipi di campioni.
- I limiti pratici includono la necessità di una manipolazione accurata delle goccioline per evitare la coalescenza e la necessità di una frequenza sufficiente di RNA in ingresso per una rilevazione affidabile.
