Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questo protocollo di immunoprecipitazione della cromatina è determinare l'abbondanza e la localizzazione delle modificazioni istoniche in regioni definite in tutto il genoma del lievito in gemmazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella regolazione della cromatina, come ad esempio come le modifiche degli istoni sono collegate al controllo dell'espressione genica e come queste modifiche cambiano in risposta a diverse condizioni ambientali. Un protocollo estremamente versatile che può essere utilizzato per studiare molte diverse modificazioni istoniche e più ceppi E contemporaneamente.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle modifiche degli istoni, può anche essere applicato allo studio di altre proteine di legame della cromatina attraverso l'uso di tag epitopici o anticorpi disponibili. Inizia questa procedura coltivando le cellule di lievito, inocula 10 millilitri di terreno YPD con una singola colonia di ogni ceppo appropriato e coltivalo a 30 gradi Celsius in un incubatore vibrante a 220 giri/min durante la notte. Il giorno successivo, dopo aver misurato la densità ottica a 600 nanometri o OD600 della coltura, diluire la coltura a un OD600 di 0,2 in 100 mL di YPD in un nuovo pallone.

Far crescere le cellule a 30 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 220 giri/min fino a raggiungere la fase di metà logaritmica. Quando le colture hanno raggiunto la fase di log medio, aggiungere 2,7 millilitri di formaldeide al 37% direttamente al terreno in ogni pallone per una concentrazione finale dell'1% di formaldeide. Trasferire i palloni in uno shaker a temperatura ambiente e agitare a 50 giri/min per 15 minuti.

Aggiungere cinque millilitri di glicina molare da 2,5 molari al terreno e continuare ad agitare a 50 giri/min a temperatura ambiente per cinque minuti per estinguere la formaldeide. Successivamente, centrifugare le celle e lavarle come descritto nel protocollo di testo. Togliere il surnatante dopo l'ultima centrifuga e procedere alla preparazione dei lisati di lievito.

Risospendere le cellule in un millilitro di precipitazione amminica della cromatina fredda o tampone di lisi ChIP con PMSF 1 millimolare e diluizione 1:1000 di un cocktail di inibitori della proteasi del lievito. Trasferire la sospensione in un tubo da 2,0 millilitri con tappo a vite contenente 200 microlitri di perle di vetro. Trasferire le cellule in un apparecchio per battere le perle per un'agitazione ad alta velocità a quattro gradi Celsius.

Sbattere le perline per 30 secondi e il ghiaccio per un minuto. Batti le perline per un totale di sei volte, mantenendo le celle sul ghiaccio per almeno un minuto tra ogni battito di 30 secondi. Utilizzando una punta di caricamento in gel, trasferire il lisato in un tubo da 1,5 millilitri.

Centrifugare il lisato a 15, 500 g a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 250 microlitri di tampone per la digestione della nucleasi micrococcica pipettando delicatamente su e giù. Aggiungere 2,5 microlitri di nucleasi micrococcica a ciascuna reazione.

Mescolare delicatamente capovolgendo da quattro a sei volte e incubare immediatamente in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo 20 minuti, interrompere la reazione posizionando le provette sul ghiaccio, aggiungendo cinque millilitri di EDTA 0,5 molare per una concentrazione finale di 10 millimolari di EDTA e mescolando delicatamente per inversione. Centrifugare a 15, 500 g a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, trasferire ogni surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per ottenere risultati più coerenti, è fondamentale assicurarsi che la stessa concentrazione di proteine venga utilizzata in ogni precipitazione amminica. A seconda del numero di reazioni di precipitazione amminica o IP, creare una miscela master di ciascuna frazione di cromatina rilasciata dalla nucleasi micrococcica e del tampone di lisi ChIP e allocare un millilitro contenente 50 microgrammi di proteine totali alle singole provette.

Rimuovere 100 microlitri da ciascuna miscela IP per elaborarla come campione di input. Congelare i campioni di input a 20 gradi Celsius per un uso successivo. È anche importante assicurarsi che la stessa quantità di perle legate all'anticorpo venga utilizzata per ogni immunoprecipitazione.

Utilizzando un puntale per pipetta a tavola larga, aggiungere 20 microlitri di microsfere di proteina magnetica AG, pre-legate con anticorpi a ciascun campione IP. Ruotare i campioni a otto giri/min a quattro gradi Celsius per tre ore. Al termine dell'IP, posizionare i tubi in un supporto magnetico e lasciare che le perline si raccolgano sul lato del tubo.

Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi ChIP alle perle e ruotare a otto giri/min a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, posizionare i tubi sul supporto magnetico e rimuovere il surnatante.

In questo modo, lavare le perle in successione con i seguenti tamponi per il numero di volte indicato. Tampone di lisi ChIP, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, tampone di lavaggio LiCl/detergente e TE. Con l'ultimo lavaggio TE, utilizzare 0,5 millilitri di TE per trasferire la maggior parte delle perle in un nuovo tubo, quindi utilizzare altri 0,5 millilitri di TE per lavare il tubo e trasferire le perle rimanenti. Aggiungere 250 microlitri di tampone di eluizione ChIP appena fatto a ciascuna provetta e agitare brevemente la soluzione.

Ruotare i campioni a otto giri/min a temperatura ambiente per 15 minuti. Posizionare i tubi nel supporto magnetico. Trasferire con cura il surnatante in un nuovo tubo ed evitare le perline.

Aggiungere altri 250 microlitri di tampone di eluizione ChIP alle perline. Ruotare i campioni a otto giri/min a temperatura ambiente per 15 minuti. Trasferire con attenzione e senza disturbare le perle, trasferire il surnatante nel tubo contenente la prima eluizione.

Scongelare i campioni di input raccolti in precedenza e aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione ChIP a ciascun campione di input. Per invertire i legami incrociati del DNA proteico, aggiungere sia ai campioni di input che a quelli IP, 20 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, cinque microlitri di glicogeno e 12,5 microlitri di proteinasi K.Mescolare bene invertendo o muovendo le provette. Incubare i campioni in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius durante la notte.

Per iniziare questa procedura, creare una miscela master QPCR per ogni set di primer combinando i volumi appropriati della miscela QPCR, il primer diretto e il primer inverso. Preparare miscele master di DNA per ogni campione di DNA in cui una reazione contiene 0,5 microlitri di DNA e 4,0 microlitri di acqua priva di nucleasi Aggiungere 5,5 microlitri della miscela master primer appropriata in ciascun pozzetto in una piastra QPCR a 384 pozzetti. Centrifugare il piatto a 200 g a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi, aggiungere 4,5 microlitri della miscela master di DNA appropriata a ciascun pozzetto. Sigillare il piatto e centrifugare a 200 g a temperatura ambiente per un minuto. Eseguire la QPCR utilizzando un sistema QPCR in tempo reale con le seguenti condizioni, 95 gradi Celsius per tre minuti, 40 cicli di 95 gradi Celsius per 10 secondi e 55 gradi Celsius per 30 secondi e una curva di fusione da 65 gradi Celsius a 95 gradi Celsius con incrementi di 0,5 gradi Celsius per cinque secondi.

Un componente chiave di questo protocollo è l'ottimizzazione della concentrazione di nucleasi micrococcica utilizzata per digerire la cromatina in frammenti solubili. Questo esempio risulta dall'elettroforesi su gel di agarosio del DNA isolato in seguito alla digestione del pellet di cromatina con quantità variabili di nucleasi micrococcica mostra che 2,5 microlitri di enzima a 20 unità per microlitro producono prevalentemente mononucleosomi. Questo esperimento rappresentativo di ChIP ha utilizzato anticorpi contro un marcatore metilico istonico H3K4me2 e un istone H3 in cellule knockout wild type e set1.

Le cellule knockout Set1 mancano della metiltransferasi che catalizza il marcatore Le barre indicano l'arricchimento relativo di H3K4me2 al basso sci indicato. Il ceppo wild type ha mostrato un chiaro arricchimento per H3K4me2 alla quinta estremità primaria di due geni noti per essere bersagli diretti di set1, PMA1 ed ERG11, mentre non è stato osservato alcun segnale nelle cellule knockout di set1. Come previsto, non c'è stato alcun arricchimento del marcatore H3K4me2 a TEL07L, è stato anche riportato che l'espressione di SPR3 è regolata da set1 ma questi risultati indicano che è probabile che la regolazione avvenga con un meccanismo diverso rispetto a PMA1 o ERG11.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro quattro giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare attentamente la specificità dell'anticorpo utilizzato con i controlli adeguati. Se disponibili, sia le regioni di controllo positive che quelle negative devono essere sondate nel QPCR.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire anche altri metodi come il sequenziamento GP per determinare il genoma mediante la distribuzione delle modificazioni istoniche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare costantemente i livelli di diverse modificazioni istoniche in regioni genomiche uniche con esperimenti ben controllati.