Name: Micro-dissezione dellorgano dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri la micro-dissezione dell'organo dello smalto nei ratti per studiare l'attività degli ameloblasti durante la formazione dello smalto dentale. Questa tecnica consente analisi quantitative tramite immunistochimica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dall'Università Paris-Diderot, l'Istituto nazionale francese di salute e ricerca medica (INSERM) e l'Istituto francese per la ricerca odontoiatrici (IFRO).

Tutti gli animali utilizzati nel presente studio sono stati effettuati conformemente agli orientamenti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Ministero francese dell'agricoltura (A-75-06-12).
1. animale esposizione alle sostanze tossiche
<ol><li>Prima di eseguire questo protocollo, ottenere la necessaria approvazione istituzionale ed essere sicuri di rispettare tutte le linee guida di cura degli animali.</li>
	<li>Applicare la struttura del protocollo ricerca permettendo la costituzione di diversi gruppi sperimentali al fine di verificare l'impatto della molecola studiata su ameloblast secrezione fase e la fase di maturazione ameloblast. Qui, quattro gruppi di ratti maschii di Wistar sono stati costituiti a seconda della loro esposizione al fluoruro (NaF) in combinazione o non con BPA (Figura 1A)2. Tutti gli animali sono stati osservati e sezionati il giorno 65 (Figura 1B).</li>
</ol>2. dissezione di Hemi-mandibole dai ratti adulti
<ol><li>Eutanasia ratti da CO2 asfissia, facoltativamente seguita dalla decapitazione alla testa separata dal resto del corpo. Esporre i ratti di CO2 per 5 min in un box dedicato16.</li>
	<li>Rimuovere tutta la pelle dalle labbra inferiori usando un bisturi #11 al fine di ottenere un facile accesso agli incisivi inferiori.</li>
	<li>Con il bisturi stesso, fare un'incisione tra i due incisivi inferiori con una leggera pressione e la mandibola sarà diviso in due metà.</li>
	<li>Tagliare l'articolazione mandibolare temporale con un bisturi per staccare la mascella e tenere hemi-mandibola con pinzette bene.</li>
	<li>Tagliare i tessuti molli circostanti con un bisturi e rimuovere tutti i muscoli, tendini e legamenti con una spatola fino a quando l'osso è completamente pulito.</li>
</ol>3. isolamento del incisivo17,18
<ol><li>Radersi con attenzione l'osso inserendo la lama parallela all'asse longitudinale principali dell'incisivo. Partono dalla cresta ossuta vicino alle punte dell'incisivo (estremità prossimale) fino alla fine dell'incisivo Ansa cervicale. Il movimento di incisione procede da prossimale a distale direzione.</li>
	<li>Effettuare un primo taglio distalmente al ciclo cervicale con il bisturi per rimuovere il gonion di hemi-mandibola e permettere che toglie l'incisivo facilmente senza danneggiare il ciclo cervicale o la fase secretiva del Adamantoblasti (linea rossa in Figura 2).</li>
	<li>Fare un secondo taglio sotto il secondo molare e inserire il bisturi tra l'osso e la superficie mediale dell'incisivo. Quando tutto l'osso basale è sollevato, ruotare verso l'esterno l'incisivo e toglierlo con attenzione per evitare smalto tessuto dell'organo compromettere con pinzette bene.</li>
</ol>4. micro-dissezione dell'organo dello smalto sotto lente binoculare
<ol><li>Goccia 200 µ l di tampone fosfato salino (PBS 1X) sull'incisivo utilizzando una pipetta. Prendere l'incisivo con pinzette bene con la superficie labiale rivolto verso l'alto. Fare un bisturi segno tra l'incolore e le parti arancione del tessuto. Questo contrassegno corrisponde per la macchia bianca sottostante che è osservabile in seguito (Figura 2).</li>
	<li>Raschiare, con un escavatore o strumento equivalente, la superficie delle cellule dal marchio bisturi alla estremità apicale corrispondente da secrezione Adamantoblasti di fase (incolore) e il marchio di bisturi alla punta dell'incisivo per l'Adamantoblasti di fase (arancione) di maturazione.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto di 2 mm corrispondono alla fase di transizione, come precedentemente descritto19. Non aprire l'incisivo durante la dissezione dell'organo dello smalto per evitare la contaminazione del mesenchima.</li>
	<li>Tagliare il ciclo cervicale situato immediatamente nella parte apicale dell'incisivo (Figura 2) come descritto in precedenza20.</li>
	<li>Raccoglierlo in soluzione al 10% formalina o lisi per ulteriori indagini (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>5. raccolta dei tessuti dell'organo dello smalto separati per ulteriori indagini
<ol><li>Goccia 200 µ l di tampone PBS 1 X sull'incisivo.</li>
	<li>Con una lama per bisturi #11, attentamente staccare le cellule epiteliali dentale gradualmente nel buffer, separatamente per ogni fase con l'aiuto del marchio bisturi fatto in precedenza.</li>
	<li>Per cella RNA e proteina estrazioni, mettere il tessuto in una soluzione di lisi che permette l'estrazione di proteine e di RNA (Vedi Tabella materiali). Nota: Preparare alta qualità RNAs girando il tessuto-escavatore nel tubo e poi rettifica le cellule fino ad ottenere un impasto omogeneo. L'impasto è pronto per l'estrazione di RNA e proteine secondo la procedura del produttore, che era precedentemente descritti2,8,17. Di solito, circa 5-10 µ g totale RNAs e 150 µ g proteine totali sono stati ottenuti per ogni preparazione.</li>
	<li>Per le analisi istologiche, immunohistochemistry (IHC) e l'ibridazione in situ (ISH), mettere lo strato delle cellule in formalina al 10% per 2 h, quindi conservare a 4 ° C in PBS 1X. Il tessuto può quindi essere incorporato in cera di paraffina o tessuto OCT per sezioni congelate.</li>
	<li>Per le estrazioni di EMP, prendere l'incisivo con pinzette bene. Dopo una breve esposizione all'aria (lieve disidratazione), una macchia bianca sarà visibile intorno alla parte centrale della superficie labial dell'incisivo, che rappresenta l'inizio della mineralizzazione dello smalto. Questa macchia bianca corrisponde alla transizione- / presto-fase di maturazione di ameloblasts, così utilizzarlo come un indicatore per l'estrazione di EMPs21.</li>
</ol>

<ol><li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+defects+reflect+perinatal+exposure+to+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A.</a> Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Exposure+to+Bisphenol+a+Exacerbates+Dental+Fluorosis+in+Growing+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats.</a> J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).</li>
<li>Alaluusua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dental+aberrations+after+the+dioxin+accident+in+Seveso%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso.</a> Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).</li>
<li>Chapple, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+lifestyle%2C+behaviour+or+systemic+diseases+with+dental+caries+and+periodontal+diseases%3A+consensus+report+of+group+2+of+the+joint+EFP%2FORCA+workshop+on+the+boundaries+between+caries+and+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases.</a> J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).</li>
<li>Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNanci%2C+A+%22Ten+Cate%27s+Oral+Histology+Development%2C+Structure%2C+and+Function%22">Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function</a>. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).</li>
<li>Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+lead+exacerbates+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Exposure to lead exacerbates dental fluorosis.</a> Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+hypomineralization+due+to+endocrine+disruptors%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tiss+Res%22%5BJournal%5D)">Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors.</a> Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+involvement+in+rat+amelogenesis%3A+an+additional+way+for+endocrine+disrupting+chemicals+to+affect+enamel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis.</a> Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).</li>
<li>Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/47479">Molar-incisor hypomineralisation.</a> Caries Res. 35, 390-391 (2001).</li>
<li>Jälevik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Diagnosis+of+Molar-Incisor-+Hypomineralisation+%28MIH%29%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).</li>
<li>Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiology+of+Molar-Incisor+Hypomineralisation%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).</li>
<li>Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJedeon%2C+K+%22Bisphenol+A%3A+Sources%2C+Risks+of+Environmental+Exposure+and+Human+Health+Effects%22">Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects</a>. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).</li>
<li>Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+tissue+effects+of+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Dental tissue effects of fluoride.</a> Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).</li>
<li>Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+fluoride+on+the+developing+tooth%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of fluoride on the developing tooth.</a> Caries Res. 38, 268-276 (2004).</li>
<li>Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+amoxicillin+and+sodium+fluoride+on+the+structure+of+developing+mouse+enamel+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro.</a> Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+of+neonatal+rats+with+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).</li>
<li>Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+the+composition+of+developing+rat+incisor+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Variations in the composition of developing rat incisor enamel.</a> Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).</li>
<li>Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+enamel+formation+and+eruption+rate+in+rat+mandibular+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors.</a> Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).</li>
<li>Smith, C. E., Nanci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+sampling+the+stages+of+amelogenesis+on+mandibular+rat+incisors+using+the+molars+as+a+reference+for+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection.</a> Anat Rec. 225, 257-266 (1989).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+32-kDa+fragment+the+functional+enamelin+unit+in+all+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species?</a> Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).</li>
<li>Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Steroid+Axis%2C+a+New+Paradigm+for+Molar+Incisor+Hypomineralization+%28MIH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH).</a> Front Physiol. 8, 343(2017).</li>
<li>Houari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asporin+and+the+mineralization+process+in+fluoride-treated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Min+Res%22%5BJournal%5D)">Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats.</a> J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).</li>
<li>Denbesten, P., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoride+toxicity%3A+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+oral+science%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis.</a> Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).</li>
<li>Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+rate+of+eruption+on+periodontal+ligament+glycosylaminoglycan+content+and+enamel+formation+in+the+rat+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor.</a> Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).</li>
<li>Lacruz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+candidate+genes+involved+in+mineralization+of+dental+enamel+by+genome-wide+transcript+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling.</a> J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).</li>
<li>Wen, X., Paine, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deposition+and+ferritin+heavy+chain+%28Fth%29+localization+in+rodent+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth.</a> BMC research notes. 6, 1(2013).</li>
<li>Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Steroid+Receptors+in+Ameloblasts+during+Amelogenesis+in+Rat+Incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors.</a> Front Physiol. 7, 503(2016).</li>
<li>Kawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+dental+epithelial+cell+line+%28HAT-7%29+and+the+cell+differentiation+dependent+on+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway.</a> Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).</li>
<li>Zhou, Y. L., Snead, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein+alpha+as+a+transactivator+of+the+mouse+amelogenin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene.</a> J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).</li>
<li>Nakata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+mouse+ameloblast-lineage+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line.</a> Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+ameloblastoma+cell+line%2C+AM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+pathology+%26+medicine%3A+official+publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1.</a> Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).</li>
<li>Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+regulating+tooth+organogenesis+and+regeneration%2C+and+the+specification+of+dental+mesenchymal+and+epithelial+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).</li>
<li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting-edge+of+mammalian+development%3B+how+the+embryo+makes+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth.</a> Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).</li>
<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Years+lived+with+disability+%28YLDs%29+for+1160+sequelae+of+289+diseases+and+injuries+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2163-2196 (2012).</li>
<li>Marcenes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+oral+conditions+in+1990-2010%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis.</a> J Dent Res. 92, 592-597 (2013).</li>
<li>National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm">https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm</a> (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ameloblast alterata attività e/o interrotte ameloblast proliferazione, differenziazione e maturazione processi piombo per i difetti dello smalto irreversibile e, a sua volta, la caratterizzazione dei difetti dello smalto può aiutare a sviluppare la comprensione dell'alterata ameloblast attività durante amelogenesis. Così, gli studi su organo dello smalto isolato sono determinante per delucidare gli eventi patologici che conducono allo smalto difetti qualunque loro origine, ambientali o genetici.
<p class="jove_conten...

Molti i difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono derivare dall'esposizione a tossici ambientali e/o stile di vita inadeguato1,2,3,4. Caratterizzazione di interrompere gli eventi e le molecole di amelogenesis utilizzando la procedura descritta attualmente promuoverà l'uso dei difetti dello smalto risultante come marker precoce di esposizione alle sostanze tossiche diverse e può aiutare a ricostituire la storia di salute della ogni paziente durante il periodo perinatale quando lo smalto è sintetizzato1,2. Sintesi dello smalto possono essere diviso in quattro fasi principali a seconda ameloblast attività5. Il primo passo raggruppa la proliferazione dei precursori delle cellule e pre-ameloblast. Durante il secondo passaggio, ameloblasts differenziato secernere proteine di matrice dello smalto (EMPs), principalmente amelogenina, enamelina e ameloblastin, che determinano lo spessore dello smalto finale. Così, qualsiasi interruzione della sintesi di EMP conduce ai difetti quantitativi dello smalto. Dopo la deposizione dello spessore dello smalto completo, inizia la fase di maturazione. Durante questa fase, crescita di cristalliti di apatite in larghezza e spessore permette lo smalto raggiungere il più alto rapporto di mineralizzazione, trovato in un tessuto biologico, fino al 96% in peso. Eventi endocrini che si verificano durante il lead di fase di maturazione a qualitativa dello smalto i difetti. Infine, ameloblasts entra in una fase di post-maturazione, anche chiamato pigmentazione nei roditori e apoptosi durante l'eruzione del dente rendendo i difetti dello smalto (se qualsiasi) irreparabile e irreversibile, quindi difetti forniscono potenziale registrazione retrospettiva di ameloblast sottolinea. Nei roditori, Amelogenesi segue una sequenza di eventi con la particolarità che loro incisivi crescono continuamente, che li rende un modello adatto per studiare il processo generale di amelogenesis simile. Così, qualsiasi interruzione di Amelogenesi provoca alterazioni della qualità dello smalto e/o quantità, a seconda l'intervallo di tempo dell'evento endocrini. In questo senso, l'esposizione alla diossina, piombo e sostanze chimiche endocrina (EDCs) come il bisfenolo A (BPA), genisteina e vinclozolin, hanno dimostrato di generare smalto hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Asimmetriche macchie opache bianche sono stati identificati sugli incisivi dei ratti esposti a una dose BPA della basso-dose durante il periodo fetale e il primo mese dopo la nascita1. Questi difetti dello smalto in ratti ed in quelli di incisivo molare umano hypomineralization (MIH), condividono caratteristiche cliniche, strutturali e biochimiche simili. MIH è una patologia dello smalto dentale recentemente descritto, per cui l'eziologia rimane ancora poco chiara9,10 , nonostante molti fattori causali essendo stato supposto9,10,11 ,12.
Un altro importante smalto hypomineralization patologia a causa di fattori ambientali è fluorosi dentale (DF), che è la conseguenza di assorbimento eccessivo di fluoro (> 0,1 mg/kg/giorno)13,14. La principale fonte di fluoro è l'acqua potabile che viene completato o naturalmente arricchita con fluoro. Fluoruro è anche spesso prescritto per prevenire la carie dentale, ma la dose profilattica è solo il 50% inferiore rispetto il tossico uno (≤ 0.05 mg/kg/giorno). MIH e DF, due frequenti patologie derivanti dall'esposizione a fattori ambientali, possono presentare caratteristiche comuni che devono essere caratterizzato a causa il potenziamento degli effetti hypomineralizing di fluoro combinato con altre sostanze tossiche come interferenti endocrini2 o amoxicillin15.
Micro-dissezione dell'organo dello smalto del ratto contenenti Adamantoblasti a stadi diversi di differenziazione aiuterà a comprendere il meccanismo d'azione di molecole capaci di interferire con attività ameloblast e causare i difetti dello smalto essere diagnosticata dopo l'eruzione dei denti. In altre parole, la caratterizzazione dei cambiamenti di composizione di matrice smalto gene espressione e smalto a causa di tossici ambientali permette la ricostituzione della storia di esposizione a sostanze tossiche e facilita il controllo di sicurezza ambientale per pubblico salute.

<table><tbody><tr><td>Bisfenolo A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>formalina 10%</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagente</td><td>Euromedex, Francia</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT tampone</td><td>Qiagen, Les Ulis, Francia</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Anticorpo recettore degli androgeni</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. A</td><td></td></tr><tr><td>fluoruro di sodio (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>paraplast regolari</td><td>Leica microsystems, Nanterre cedex,&nbsp; Francia</td><td>39601006</td><td>chiamato was/parafin nel tessuto di testo</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Forbici - Dritto/8,5 cm</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Manico per lame di bisturi - 12,5 cm</td><td>PHYMEP, Parigi, Francia</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama di bisturi curvo</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>Coltello da dissezione - Punta fine/dritta</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>Coltello circolare</td><td>PHYMEP, Parigi, Francia</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>lame per bisturi n&deg; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>lente binoculare</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp; Francia</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Difetti dello smalto derivanti da condizioni ambientali e modi di vita sono le preoccupazioni di salute pubblica a causa della loro alta prevalenza. Questi difetti derivano da attività alterata delle cellule responsabili della sintesi di smalto denominato ameloblasts, che presentano in organo dello smalto. Durante l'Amelogenesi, ameloblasts seguire una sequenza specifica e precisa di eventi di proliferazione, differenziazione e morte. Un ratto incisivi in continua crescita è un adatto modello sperimentale per studiare ameloblast fasi di attività e differenziamento in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-sezionare organo dello smalto dei ratti esposti a tossici ambientali. Gli epiteli dentali micro-dissecato contengono Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzati per esperimenti qualitativi, quali le analisi immunohistochemistry e ibridazione in situ , così come per analisi quantitative come RT-qPCR, RNA-seq e Western blotting.

Molti smalto difetti, come fluorosi dentale12,13, possono derivare da condizioni ambientali a causa dell'assorbimento di fluoro eccessivo o smalto hypomineralization simili a MIH dovuto l'esposizione a qualche EDCs1, 7,22. Questi difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono essere riprodotta sperimentalmente su ratti (<strong clas...

Comprensione dello smalto formazione e possibili alterazioni richiede lo studio di ameloblast attività. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-dissezionare organi di smalto contenente Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzato per ulteriori quantitative e qualitative procedure sperimentali.

Micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di micro-sezionare l'organo dello smalto di ratto e separare l'epitelio dentale in base alle principali fasi di differenziazione cellulare durante la sintesi dello smalto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle patologie dello smalto come la fluorosi dentale, l'ipersmaltatura degli incisivi molari e l'ereditarietà della genesi imperfetta dello smalto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di analizzare ulteriormente le cellule dentali utilizzando esperimenti quantitativi come l'immunoistochimica senza alcun trattamento precedente, nonché indagini consequenziali come Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla meccanizzazione molecolare di molecole endogene ed esogene in grado di interrompere l'emogenesi.Dopo l'eutanasia di un ratto sperimentale, rimuovere tutta la pelle dalle labbra inferiori utilizzando un bisturi numero 11 per ottenere un facile accesso agli incisivi inferiori. Quindi, con lo stesso bisturi, praticare un'incisione tra i due incisivi inferiori. Applicando una leggera pressione, la mandibola si dividerà in due metà.Successivamente, tagliare l'articolazione temporo-mandibolare con il bisturi per staccare la mascella tenendo l'emimandibola con una pinzetta sottile. Quindi taglia i tessuti molli circostanti con un bisturi e rimuovi tutti i muscoli, i tendini e i legamenti usando un raschietto fino a quando l'osso non è completamente pulito. Per isolare l'incisivo, radere accuratamente l'osso posizionando la lama parallelamente all'asse longitudinale maggiore dell'incisivo.Inizia a raderti dalla cresta ossea, vicino alle punte dell'incisivo, e lavora verso l'altra estremità dell'incisivo, vicino all'ansa cervicale. Successivamente, praticare un'incisione con il bisturi, distalmente all'ansa cervicale per rimuovere il gonione dell'emimandibola, rendendo così l'incisivo facile da rimuovere senza danneggiare l'ansa cervicale o lo stadio secretorio degli ameloblasti. Quindi fai un secondo taglio sotto il secondo molare e inserisci il bisturi tra l'osso e la superficie mediale dell'incisivo.Quando tutto l'osso basale è stato sollevato, ruotare l'incisivo verso l'esterno e rimuoverlo con cura usando una pinzetta sottile per evitare di danneggiare il tessuto dell'organo dello smalto. Ora l'intero incisivo è isolato. Per la dissezione, coprire l'incisivo con 200 microlitri di PBS in una piastra o piastra da 60 millimetri.Per iniziare, tagliare l'ansa cervicale, situata immediatamente nella parte apicale dell'incisivo, come descritto in precedenza. Quindi afferrare l'incisivo con una pinzetta sottile, con la superficie labiale rivolta verso l'alto, e fare un segno di bisturi all'estremità della parte incolore del tessuto. Questo segno corrisponde a una macchia bianca sottostante che sarà osservabile in seguito.Ora, usa un escavatore o uno strumento equivalente per raschiare la superficie cellulare dal segno all'estremità apicale, che corrisponde agli ameloblasti incolori dello stadio di secrezione. Successivamente, fai un segno di bisturi all'inizio della parte arancione, corrispondente agli ameloblasti dello stadio di maturazione e raschia dal segno del bisturi alla punta dell'incisivo. Ora rimuovi i due millimetri di tessuto che corrispondono agli ameloblasti dello stadio di transizione.Non aprire l'incisivo durante la dissezione dell'organo dello smalto poiché ciò contaminerebbe i tessuti sezionati con il mesenchima. Infine, conservare i tessuti in formalina al 10% o in una soluzione di lisi per ulteriori indagini. Per un'estrazione proteica della matrice dello smalto, rimuovere brevemente l'incisivo dalla soluzione fino a quando una macchia bianca diventa visibile intorno alla parte centrale della superficie labiale.Questo punto rappresenta l'inizio della mineralizzazione dello smalto e corrisponde alla transizione verso gli ameloblasti allo stadio iniziale. Taglia via questa regione di tessuto e trattala secondo necessità. Se il tessuto rimosso è per estrazioni cellulari di RNA e proteine, utilizzare un kit commerciale per eseguire l'estrazione.Trasferire il tessuto rimosso nella soluzione di lisi e macinarlo in una miscela omogenea. Per le analisi istologiche, l'immunoistochimica e l'ibridazione NC2 mettere il tessuto raccolto in formalina al 10% per due ore a temperatura ambiente. Quindi trasferisci il fazzoletto su PBS e conservalo a quattro gradi Celsius.Successivamente, il tessuto può essere incorporato in cera, paraffina o tessuto OCT. Quattro gruppi di ratti maschi dalla coda bianca sono stati costituiti a seconda della loro esposizione al fluoro in combinazione o meno con BPA. Tutti gli animali sono stati osservati e sezionati il giorno 65 come descritto.La qualità dei tessuti di smalto micro-sezionati è stata verificata utilizzando la colorazione Masson tricromica. L'osservazione al microscopio mostra le tipiche cellule epiteliali dello smalto e l'ameloblasto palocide. L'assenza di contaminazione mesenchimale è stata attestata dall'assenza di colorazione verde collagene.Gli ameloblasti dello stadio di secrezione esprimono la smaltolina. Gli ameloblasti della fase di maturazione esprimono la kalichina quattro e contengono anche alti livelli di foratina, dando loro la capacità di immagazzinare elevate quantità di ferro, responsabile del colore arancione dello smalto. Questi RNA sono espressi preferenzialmente dagli ameloblasti piuttosto che dalle cellule mesenchime.Il collagene uno, invece, è espresso dalle cellule mesenchimali e non dagli ameloblasti. L'immunoistochimica è stata quindi utilizzata per valutare quattro proteine specifiche negli ameloblasti dello stadio di secrezione o maturazione. Ad esempio, un recettore degli androgeni, visto in verde, è specificamente localizzato negli ameloblasti dello stadio di maturazione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come micro-sezionare, l'organo dello smalto dei roditori per una separazione di successo tra gli ameloblasti delle fasi di secrezione e maturazione. Questo approccio è molto utile per la comprensione dei meccanismi fattoriali chiave in vivo responsabili della malattia patologica e fisiologica dello smalto.

micro-dissection-enamel-organ-from-mandibular-incisor-rats-exposed-to

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Qui, presentiamo un protocollo per indurre localmente la parodontite apicale nei topi. Mostriamo come praticare un foro nel dente del topo ed esporre la sua polpa, al fine di causare infiammazione locale. Sono inoltre dimostrati metodi di analisi per studiare la natura di questa infiammazione, come la micro-TC e l'istologia.

Indurre la parodontite apicale nei topi

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

L'incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l'etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l'etichetta; il nostro studio ha utilizzato l'etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.

Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

La microdurezza è una proprietà meccanica e un parametro informativo per la valutazione della fisiopatologia dei tessuti duri. Qui, dimostriamo un protocollo standardizzato (preparazione del campione, lucidatura, superficie piana e siti di indentazione) per l'analisi della microdurezza nell'osso dentale e alveolare in modelli di malattia orale dei roditori, vale a dire, fluorosi dentale e riassorbimento osseo parodontale indotto dalla legatura.

Misurazioni di microdurezza su dente e osso alveolare in modelli di malattia orale dei roditori

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un approccio standardizzato per valutare quantitativamente l'integrità della barriera epiteliale gingivale murina applicando topicamente destranti marcati con fluorescenza di dimensioni molecolari variabili sulla superficie gengivale in vivo, seguiti da imaging ex vivo utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo.

Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

La ricerca sperimentale sugli animali svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della pratica clinica dei trapianti. Il modello di trapianto ortotopico di fegato suino (OLTx) assomiglia molto alle condizioni umane ed è spesso utilizzato nella ricerca clinicamente orientata. Il seguente protocollo contiene tutte le informazioni per un modello OLTx suino affidabile che utilizza uno shunt attivo porto-cavale-giugulare.

Tecnica di Suini appalti Fegato e trapianto ortotopico con un attivo Porto-Caval Shunt

Questo articolo descrive la misurazione della funzione ventricolare sinistra murina tramite l'analisi della pressione/volume a diverse frequenze cardiache.

Cateterizzazione cardiaca nei topi per misurare il rapporto pressione del volume: Indagare l&#39;effetto Bowditch

Scopri la micro-dissezione dell'organo dello smalto nei ratti per studiare l'attività degli ameloblasti durante la formazione dello smalto dentale. Questa tecnica consente analisi quantitative tramite immunistochimica.

Micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Esplora altri video