Name: Micro-dissezione dellorgano dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri la micro-dissezione dell'organo dello smalto nei ratti per studiare l'attività degli ameloblasti durante la formazione dello smalto dentale. Questa tecnica consente analisi quantitative tramite immunistochimica.

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Questo lavoro è stato finanziato dall'Università Paris-Diderot, l'Istituto nazionale francese di salute e ricerca medica (INSERM) e l'Istituto francese per la ricerca odontoiatrici (IFRO).

Tutti gli animali utilizzati nel presente studio sono stati effettuati conformemente agli orientamenti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Ministero francese dell'agricoltura (A-75-06-12).
1. animale esposizione alle sostanze tossiche
<ol><li>Prima di eseguire questo protocollo, ottenere la necessaria approvazione istituzionale ed essere sicuri di rispettare tutte le linee guida di cura degli animali.</li>
	<li>Applicare la struttura del protocollo ricerca permettendo la costituzione di diversi gruppi sperimentali al fine di verificare l'impatto della molecola studiata su ameloblast secrezione fase e la fase di maturazione ameloblast. Qui, quattro gruppi di ratti maschii di Wistar sono stati costituiti a seconda della loro esposizione al fluoruro (NaF) in combinazione o non con BPA (Figura 1A)2. Tutti gli animali sono stati osservati e sezionati il giorno 65 (Figura 1B).</li>
</ol>2. dissezione di Hemi-mandibole dai ratti adulti
<ol><li>Eutanasia ratti da CO2 asfissia, facoltativamente seguita dalla decapitazione alla testa separata dal resto del corpo. Esporre i ratti di CO2 per 5 min in un box dedicato16.</li>
	<li>Rimuovere tutta la pelle dalle labbra inferiori usando un bisturi #11 al fine di ottenere un facile accesso agli incisivi inferiori.</li>
	<li>Con il bisturi stesso, fare un'incisione tra i due incisivi inferiori con una leggera pressione e la mandibola sarà diviso in due metà.</li>
	<li>Tagliare l'articolazione mandibolare temporale con un bisturi per staccare la mascella e tenere hemi-mandibola con pinzette bene.</li>
	<li>Tagliare i tessuti molli circostanti con un bisturi e rimuovere tutti i muscoli, tendini e legamenti con una spatola fino a quando l'osso è completamente pulito.</li>
</ol>3. isolamento del incisivo17,18
<ol><li>Radersi con attenzione l'osso inserendo la lama parallela all'asse longitudinale principali dell'incisivo. Partono dalla cresta ossuta vicino alle punte dell'incisivo (estremità prossimale) fino alla fine dell'incisivo Ansa cervicale. Il movimento di incisione procede da prossimale a distale direzione.</li>
	<li>Effettuare un primo taglio distalmente al ciclo cervicale con il bisturi per rimuovere il gonion di hemi-mandibola e permettere che toglie l'incisivo facilmente senza danneggiare il ciclo cervicale o la fase secretiva del Adamantoblasti (linea rossa in Figura 2).</li>
	<li>Fare un secondo taglio sotto il secondo molare e inserire il bisturi tra l'osso e la superficie mediale dell'incisivo. Quando tutto l'osso basale è sollevato, ruotare verso l'esterno l'incisivo e toglierlo con attenzione per evitare smalto tessuto dell'organo compromettere con pinzette bene.</li>
</ol>4. micro-dissezione dell'organo dello smalto sotto lente binoculare
<ol><li>Goccia 200 µ l di tampone fosfato salino (PBS 1X) sull'incisivo utilizzando una pipetta. Prendere l'incisivo con pinzette bene con la superficie labiale rivolto verso l'alto. Fare un bisturi segno tra l'incolore e le parti arancione del tessuto. Questo contrassegno corrisponde per la macchia bianca sottostante che è osservabile in seguito (Figura 2).</li>
	<li>Raschiare, con un escavatore o strumento equivalente, la superficie delle cellule dal marchio bisturi alla estremità apicale corrispondente da secrezione Adamantoblasti di fase (incolore) e il marchio di bisturi alla punta dell'incisivo per l'Adamantoblasti di fase (arancione) di maturazione.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto di 2 mm corrispondono alla fase di transizione, come precedentemente descritto19. Non aprire l'incisivo durante la dissezione dell'organo dello smalto per evitare la contaminazione del mesenchima.</li>
	<li>Tagliare il ciclo cervicale situato immediatamente nella parte apicale dell'incisivo (Figura 2) come descritto in precedenza20.</li>
	<li>Raccoglierlo in soluzione al 10% formalina o lisi per ulteriori indagini (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>5. raccolta dei tessuti dell'organo dello smalto separati per ulteriori indagini
<ol><li>Goccia 200 µ l di tampone PBS 1 X sull'incisivo.</li>
	<li>Con una lama per bisturi #11, attentamente staccare le cellule epiteliali dentale gradualmente nel buffer, separatamente per ogni fase con l'aiuto del marchio bisturi fatto in precedenza.</li>
	<li>Per cella RNA e proteina estrazioni, mettere il tessuto in una soluzione di lisi che permette l'estrazione di proteine e di RNA (Vedi Tabella materiali). Nota: Preparare alta qualità RNAs girando il tessuto-escavatore nel tubo e poi rettifica le cellule fino ad ottenere un impasto omogeneo. L'impasto è pronto per l'estrazione di RNA e proteine secondo la procedura del produttore, che era precedentemente descritti2,8,17. Di solito, circa 5-10 µ g totale RNAs e 150 µ g proteine totali sono stati ottenuti per ogni preparazione.</li>
	<li>Per le analisi istologiche, immunohistochemistry (IHC) e l'ibridazione in situ (ISH), mettere lo strato delle cellule in formalina al 10% per 2 h, quindi conservare a 4 ° C in PBS 1X. Il tessuto può quindi essere incorporato in cera di paraffina o tessuto OCT per sezioni congelate.</li>
	<li>Per le estrazioni di EMP, prendere l'incisivo con pinzette bene. Dopo una breve esposizione all'aria (lieve disidratazione), una macchia bianca sarà visibile intorno alla parte centrale della superficie labial dell'incisivo, che rappresenta l'inizio della mineralizzazione dello smalto. Questa macchia bianca corrisponde alla transizione- / presto-fase di maturazione di ameloblasts, così utilizzarlo come un indicatore per l'estrazione di EMPs21.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ameloblast alterata attività e/o interrotte ameloblast proliferazione, differenziazione e maturazione processi piombo per i difetti dello smalto irreversibile e, a sua volta, la caratterizzazione dei difetti dello smalto può aiutare a sviluppare la comprensione dell'alterata ameloblast attività durante amelogenesis. Così, gli studi su organo dello smalto isolato sono determinante per delucidare gli eventi patologici che conducono allo smalto difetti qualunque loro origine, ambientali o genetici.
<p class="jove_conten...

Molti i difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono derivare dall'esposizione a tossici ambientali e/o stile di vita inadeguato1,2,3,4. Caratterizzazione di interrompere gli eventi e le molecole di amelogenesis utilizzando la procedura descritta attualmente promuoverà l'uso dei difetti dello smalto risultante come marker precoce di esposizione alle sostanze tossiche diverse e può aiutare a ricostituire la storia di salute della ogni paziente durante il periodo perinatale quando lo smalto è sintetizzato1,2. Sintesi dello smalto possono essere diviso in quattro fasi principali a seconda ameloblast attività5. Il primo passo raggruppa la proliferazione dei precursori delle cellule e pre-ameloblast. Durante il secondo passaggio, ameloblasts differenziato secernere proteine di matrice dello smalto (EMPs), principalmente amelogenina, enamelina e ameloblastin, che determinano lo spessore dello smalto finale. Così, qualsiasi interruzione della sintesi di EMP conduce ai difetti quantitativi dello smalto. Dopo la deposizione dello spessore dello smalto completo, inizia la fase di maturazione. Durante questa fase, crescita di cristalliti di apatite in larghezza e spessore permette lo smalto raggiungere il più alto rapporto di mineralizzazione, trovato in un tessuto biologico, fino al 96% in peso. Eventi endocrini che si verificano durante il lead di fase di maturazione a qualitativa dello smalto i difetti. Infine, ameloblasts entra in una fase di post-maturazione, anche chiamato pigmentazione nei roditori e apoptosi durante l'eruzione del dente rendendo i difetti dello smalto (se qualsiasi) irreparabile e irreversibile, quindi difetti forniscono potenziale registrazione retrospettiva di ameloblast sottolinea. Nei roditori, Amelogenesi segue una sequenza di eventi con la particolarità che loro incisivi crescono continuamente, che li rende un modello adatto per studiare il processo generale di amelogenesis simile. Così, qualsiasi interruzione di Amelogenesi provoca alterazioni della qualità dello smalto e/o quantità, a seconda l'intervallo di tempo dell'evento endocrini. In questo senso, l'esposizione alla diossina, piombo e sostanze chimiche endocrina (EDCs) come il bisfenolo A (BPA), genisteina e vinclozolin, hanno dimostrato di generare smalto hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Asimmetriche macchie opache bianche sono stati identificati sugli incisivi dei ratti esposti a una dose BPA della basso-dose durante il periodo fetale e il primo mese dopo la nascita1. Questi difetti dello smalto in ratti ed in quelli di incisivo molare umano hypomineralization (MIH), condividono caratteristiche cliniche, strutturali e biochimiche simili. MIH è una patologia dello smalto dentale recentemente descritto, per cui l'eziologia rimane ancora poco chiara9,10 , nonostante molti fattori causali essendo stato supposto9,10,11 ,12.
Un altro importante smalto hypomineralization patologia a causa di fattori ambientali è fluorosi dentale (DF), che è la conseguenza di assorbimento eccessivo di fluoro (> 0,1 mg/kg/giorno)13,14. La principale fonte di fluoro è l'acqua potabile che viene completato o naturalmente arricchita con fluoro. Fluoruro è anche spesso prescritto per prevenire la carie dentale, ma la dose profilattica è solo il 50% inferiore rispetto il tossico uno (≤ 0.05 mg/kg/giorno). MIH e DF, due frequenti patologie derivanti dall'esposizione a fattori ambientali, possono presentare caratteristiche comuni che devono essere caratterizzato a causa il potenziamento degli effetti hypomineralizing di fluoro combinato con altre sostanze tossiche come interferenti endocrini2 o amoxicillin15.
Micro-dissezione dell'organo dello smalto del ratto contenenti Adamantoblasti a stadi diversi di differenziazione aiuterà a comprendere il meccanismo d'azione di molecole capaci di interferire con attività ameloblast e causare i difetti dello smalto essere diagnosticata dopo l'eruzione dei denti. In altre parole, la caratterizzazione dei cambiamenti di composizione di matrice smalto gene espressione e smalto a causa di tossici ambientali permette la ricostituzione della storia di esposizione a sostanze tossiche e facilita il controllo di sicurezza ambientale per pubblico salute.

<table><tbody><tr><td>Bisfenolo A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>formalina 10%</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagente</td><td>Euromedex, Francia</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT tampone</td><td>Qiagen, Les Ulis, Francia</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Anticorpo recettore degli androgeni</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. A</td><td></td></tr><tr><td>fluoruro di sodio (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>paraplast regolari</td><td>Leica microsystems, Nanterre cedex,&nbsp; Francia</td><td>39601006</td><td>chiamato was/parafin nel tessuto di testo</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Forbici - Dritto/8,5 cm</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Manico per lame di bisturi - 12,5 cm</td><td>PHYMEP, Parigi, Francia</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama di bisturi curvo</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>Coltello da dissezione - Punta fine/dritta</td><td>PHYMEP , Parigi, Francia</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>Coltello circolare</td><td>PHYMEP, Parigi, Francia</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>lame per bisturi n&deg; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>lente binoculare</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp; Francia</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Difetti dello smalto derivanti da condizioni ambientali e modi di vita sono le preoccupazioni di salute pubblica a causa della loro alta prevalenza. Questi difetti derivano da attività alterata delle cellule responsabili della sintesi di smalto denominato ameloblasts, che presentano in organo dello smalto. Durante l'Amelogenesi, ameloblasts seguire una sequenza specifica e precisa di eventi di proliferazione, differenziazione e morte. Un ratto incisivi in continua crescita è un adatto modello sperimentale per studiare ameloblast fasi di attività e differenziamento in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-sezionare organo dello smalto dei ratti esposti a tossici ambientali. Gli epiteli dentali micro-dissecato contengono Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzati per esperimenti qualitativi, quali le analisi immunohistochemistry e ibridazione in situ , così come per analisi quantitative come RT-qPCR, RNA-seq e Western blotting.

Molti smalto difetti, come fluorosi dentale12,13, possono derivare da condizioni ambientali a causa dell'assorbimento di fluoro eccessivo o smalto hypomineralization simili a MIH dovuto l'esposizione a qualche EDCs1, 7,22. Questi difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono essere riprodotta sperimentalmente su ratti (<strong clas...

Comprensione dello smalto formazione e possibili alterazioni richiede lo studio di ameloblast attività. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-dissezionare organi di smalto contenente Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzato per ulteriori quantitative e qualitative procedure sperimentali.

Micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di micro-sezionare l'organo dello smalto di ratto e separare l'epitelio dentale in base alle principali fasi di differenziazione cellulare durante la sintesi dello smalto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle patologie dello smalto come la fluorosi dentale, l'ipersmaltatura degli incisivi molari e l'ereditarietà della genesi imperfetta dello smalto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di analizzare ulteriormente le cellule dentali utilizzando esperimenti quantitativi come l'immunoistochimica senza alcun trattamento precedente, nonché indagini consequenziali come Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla meccanizzazione molecolare di molecole endogene ed esogene in grado di interrompere l'emogenesi.Dopo l'eutanasia di un ratto sperimentale, rimuovere tutta la pelle dalle labbra inferiori utilizzando un bisturi numero 11 per ottenere un facile accesso agli incisivi inferiori. Quindi, con lo stesso bisturi, praticare un'incisione tra i due incisivi inferiori. Applicando una leggera pressione, la mandibola si dividerà in due metà.Successivamente, tagliare l'articolazion

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Qui, presentiamo un protocollo per indurre localmente la parodontite apicale nei topi. Mostriamo come praticare un foro nel dente del topo ed esporre la sua polpa, al fine di causare infiammazione locale. Sono inoltre dimostrati metodi di analisi per studiare la natura di questa infiammazione, come la micro-TC e l'istologia.

Indurre la parodontite apicale nei topi

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

La microdurezza è una proprietà meccanica e un parametro informativo per la valutazione della fisiopatologia dei tessuti duri. Qui, dimostriamo un protocollo standardizzato (preparazione del campione, lucidatura, superficie piana e siti di indentazione) per l'analisi della microdurezza nell'osso dentale e alveolare in modelli di malattia orale dei roditori, vale a dire, fluorosi dentale e riassorbimento osseo parodontale indotto dalla legatura.

Misurazioni di microdurezza su dente e osso alveolare in modelli di malattia orale dei roditori

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un approccio standardizzato per valutare quantitativamente l'integrità della barriera epiteliale gingivale murina applicando topicamente destranti marcati con fluorescenza di dimensioni molecolari variabili sulla superficie gengivale in vivo, seguiti da imaging ex vivo utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo.

Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

La ricerca sperimentale sugli animali svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della pratica clinica dei trapianti. Il modello di trapianto ortotopico di fegato suino (OLTx) assomiglia molto alle condizioni umane ed è spesso utilizzato nella ricerca clinicamente orientata. Il seguente protocollo contiene tutte le informazioni per un modello OLTx suino affidabile che utilizza uno shunt attivo porto-cavale-giugulare.

Tecnica di Suini appalti Fegato e trapianto ortotopico con un attivo Porto-Caval Shunt

Questo manoscritto descrive i protocolli per la prostata micro-dissezione e la castrazione chirurgica nel topo di laboratorio. Noi raffiguriamo anche risultati rappresentativi prodotti da questi protocolli. Infine, si discute i vantaggi e l'utilizzo di questi protocolli.

Murino della prostata Micro-dissezione e la castrazione chirurgica

Questo articolo presenta un metodo che combina l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento della citometria del flusso per isolare, coltivare, smistare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalle mattidi di ratto.

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Scopri la micro-dissezione dell'organo dello smalto nei ratti per studiare l'attività degli ameloblasti durante la formazione dello smalto dentale. Questa tecnica consente analisi quantitative tramite immunistochimica.

Micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

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