Name: Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri il metodo di frazionamento per isolare e quantificare le specie solubili e insolubili di huntingtina mutante da tessuto cerebrale murino e colture cellulari. Questa tecnica avanzata permette di analizzare l'omeostasi proteica nella malattia di Huntington.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (RO1-NS090390). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Joan Steffanfor assistenza tecnica e discussione durante lo sviluppo di questo test.

Dichiarazione etica animale - esperimenti sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e un protocollo di ricerca animale approvato dalla (uso Comitato e istituzionali Animal Care IACUC) presso la University of California, Irvine, un AAALAC accreditata istituzione. Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare la sofferenza animale.
1. preparazione del buffer di lisi
<ol><li>Preparare "Solubile" buffer di lisi (Tris 10 mM pH 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerolo) e filtro sterile attraverso il filtro di 0,22 µm.<ol>
<li>Per un buffer di lisi lavoro "Solubile", misura N-Ethylmaleimide (NEM) e accuratamente sciogliere in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) disciolti in 100% EtOH. Nota: Lysis Buffer inibitori: (i) 20mm N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1mm orthovanadate del sodio (Na3VO4); (iv) 1 µ g/mL leupeptina; (v) 1 µ g/mL aprotinina; (vi) 20mm fluoruro di sodio (NaF). Attenzione: Indossare una maschera quando si lavora con NEM in tutto il protocollo. Buffer di lisi di lavoro deve essere effettuato fresco per garantire inibitori attivi.</li>
		<li>Per il buffer di lisi solubile con inibitori della proteasi, aggiungere inibitori nel seguente ordine: fluoruro di sodio (NaF), fino a volume con tampone di lisi freddo, orthovanadate del sodio (Na3VO4), aprotinina e leupeptina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per "Insolubile" buffer di Lisi, supplemento al 4% SDS aggiungendo 500 µ l di 20% SDS a 2 mL di tampone di Lisi "Solubile". Lasciare a temperatura ambiente. Nota: SDS precipita fuori, conservato a 4 ° C; tenerlo a temperatura ambiente. Composizione di tampone di lisi finale: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; glicerolo al 10%; 4% SDS (solo insolubile).</li>
</ol>2. solubili/insolubili frazionamento protocollo
Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica.
<ol><li>Due set di tubi per ciascun campione di etichetta: "Solubile" e "Insolubile".</li>
	<li>Aggiungi X-µ l di buffer di lisi solubile di lavoro ghiacciata completati con inibitori della proteasi (Vedi 1.1.1) al tessuto. Nota: X = Volume varia a seconda della quantità di tessuto; Vedere tabella 1.</li>
	<li>Per tessuto di cervello di topo (cioè, corpo striato), lisata lentamente 30 volte in vetro da 1 mL douncer e dispensare "Insolubile" etichettati tubo (tenere il ghiaccio). Nota: Fare attenzione a non rompere la superficie del liquido dopo a partire douncing, come bolle si forma e possono produrre omogeneizzazione incompleta.</li>
	<li>Per le cellule (cioè, HeLa, HEK293T), sciacquare le cellule una volta con il freddo, 1x PBS. Rimuovere PBS e applicare il minimo volume di tampone di lisi delle cellule e sollevare con raschietto di cella. Nota: Per sopra linee cellulari, cellule erano placcate a 5 x 105 celle per ben 6 piastra e cresciute vicino a confluenza. Uno è ben paragonabile ai volumi utilizzati per striatum del mouse.</li>
	<li>Trasferimento omogeneato o lysate delle provette, "Insolubile" e lisare il ghiaccio 1 h (orologio di partenza dopo l'elaborazione del filmato finale). Nota: Per lisati cellulari, triturare diverse volte per spezzare ciuffi di cella prima di iniziare l'incubazione. Evitare la formazione di bolle. Brevemente di vortice impulso ogni campione per 1 s a metà lisi.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 4 ° C a 15.000 x g per 20 min.</li>
	<li>Recuperare il surnatante più la frazione "Solubile".<ol>
<li>Rimuovere con pipetta, fare attenzione a non disturbare il pellet/nuvoloso strato come questo, contamina la frazione. Frazione solubile di dispensare in "Solubile" etichettato tubo. Tenere il ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare la pallina con 500 µ l di tampone di lisi (x2) e centrifugare a 4 ° C a 15.000 x g per 5 min dopo ogni lavaggio; va bene se alcuni dello strato nuvoloso è dispensato fuori.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, rimuovere tutti i restanti tampone di lavaggio, lasciando solo il precipitato di tessuto. Nota: Da questo punto, insolubili campioni ora devono essere tenuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere il pellet con X-µ l di tampone di lisi completati con 4% SDS (Volume può essere regolato a seconda del formato della pallina; cfr. tabella 1).</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni ogni campione per 30 s a temperatura ambiente con un sonicatore sonda (125 watt, 20kHz, impulso, ampiezza 40%, Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Far bollire i campioni (ebollizione di rotolamento) per 30 min; Centrifugare brevemente (15 s) a 6.000 x g per non perdere alcun campione.</li>
	<li>Eseguire analisi della proteina di DC (detergente compatibile) (Vedi Tabella materiali) o analisi della proteina di Lowry per misurare la concentrazione di proteina (consigliata iniziate diluizioni di 1/5 del campione in tampone di lisi rispettivi per colture cellulari e 1/10 per tessuto lisati). Nota: Le concentrazioni di proteina dovrà essere letto usando un'analisi DC o Lowry grazie alla elevata concentrazione di detersivo.</li>
	<li>Aliquotare campioni in batch in 50 µ l per evitare problemi di congelamento-scongelamento. Nota: Protocollo può essere sospesa qui prima dell'ulteriore analisi biochimica memorizzando sia frazioni a-20 ° C.</li>
</ol>3. quantificazione e Western Blot
<ol><li>Eseguire le macchie occidentali come segnalato altrove1,13 da diluire 30 µ g di campione 1:1 nel caricamento buffer (1,6 x tintura, 1 x riduzione di carico). Nota: 30 µ g di proteina per ogni frazione è sufficiente, ma può essere regolata per risoluzione ottimale. 3 - gel di poliacrilammide Tris-acetato di 8% da utilizzarsi per la frazione insolubile. 4 - 12% bis-Tris gel sono raccomandati per la frazione solubile.</li>
	<li>Bollire brevemente campioni (ebollizione) per 5 min, centrifuga (15 s) a 6.000 x g per raccogliere il campione.</li>
	<li>Analizzare le frazioni mediante SDS-PAGE e western blot, secondo il protocollo del produttore per campioni ridotti. Nota: Frazione insolubile risolve meglio quando trasferite su membrana di nitrocellulosa 0,45 µM. nitrocellulosa µM 0,45 o 0,2 può essere utilizzato per la frazione solubile, a seconda delle dimensioni della proteina di interesse. Alcune ottimizzazione può essere richiesto per il migliore trasferimento di materiali HMW.</li>
	<li>Macchia della membrana con la macchia di intera proteina (ad es., MEMcode, vedere la Tabella materiali) per visualizzare la proteina efficienza di carico. Nota: Western blot può essere analizzato dall'intensità media pixel. Frazioni solubili possono essere normalizzate in una casa-armonia proteina migliore adatta per il sistema sperimentale. Frazione insolubile come abbondanza relativa della proteina è stata verificata dalla macchiatura della proteina reversibile o normalizzazione dell'istone 3 sulla macchia separata.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Alcune precauzioni sono necessarie per i protocolli di cui sopra garantire risultati coerenti e quantitativi. In primo luogo, mHTT in entrambe le frazioni formeranno spontaneamente aggregati nel tempo su cicli ripetuti di congelamento scongelamento, specialmente quando ci si trova in alta concentrazione. È dunque fondamentale per congelare le aliquote di preps la proteina e scongelare solo il volume necessario prima di eseguire il test come descritto nel protocollo di cui sopra. Ulteriormente, se la frazione insolubile p...

L'interruzione delle reti di controllo di qualità di proteina che assicurano il corretto ripiegamento e degradazione delle proteine cellulari è probabile centrale per la patologia nel morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e altri "misfolding proteico" disordini di2,3. Conoscere in dettaglio i componenti di rete proteostasis e i loro contributi alla patologia sono quindi cruciali per lo sviluppo di interventi terapeutici migliorati. MH è causata dall'espansione anormale di una ripetizione di CAG nel gene HD risultante in un tratto espanso di polyglutamines (poliQ) nella proteina huntingtina (HTT)4. Una caratteristica patologica coerenza della patogenesi dell'HD è il misfolding risultante, accumulo e l'aggregazione di HTT in regioni del cervello e nei tessuti periferici, che ha dimostrato di interferire in vari modi con funzione e omeostasi cellulare normale 5 , 6. HTT mentre è espressa ubiquitariamente, neuroni medi spinosi nello striato sono selettivamente vulnerabili e più apertamente interessata con atrofia corticale notevole anche associato con la patogenesi dell'HD.
La formazione di aggregati di HTT nel cervello di pazienti con MH e modelli animali in genere ha servito come un marcatore di proxy per la progressione della malattia e dominante-negativo guadagno di funzione per mHTT7. Anche se i meccanismi precisi di quale proteina misfolding e aggregazione può contribuire alla tossicità indotta da mHTT rimangono poco chiari, la formazione di queste inclusioni nel cervello dei pazienti di HD e vari modelli animali è una caratteristica invariante e inevitabile. Inclusioni appaiono per essere composto in gran parte accumulate HTT frammenti contenenti il N-terminale ampliato polyQ, indicando tale proteolisi ed elaborazione di Full-Length HTT, nonché8,di splicing alternativo9 possono svolgere un ruolo importante nella patogenesi della HTT HD. N-terminale frammenti può costituire una forma patologica di HTT che può aggregare rapidamente, nucleazione e accelerare o propagare il processo di aggregazione10.
Tuttavia, la presenza di queste inclusioni non è necessariamente correlata con la tossicità indotta da HTT o cellule morte11. HTT è stato proposto di sottoporsi a un processo di aggregazione da un monomero solubile attraverso specie oligomeriche solubile e β-foglio fibrille di aggregati insolubili e inclusioni12. Risoluzione di queste varie specie di proteina tramite saggi biochimici standard è stata una sfida nel campo grazie alla loro stabilità nel buffer di lisi di basso-detergente e difficoltà nel visualizzare utilizzando saggi biochimici standard. Così, considerazioni metodologiche sono fondamentali nel rilevare il grado e il modello di mHTT accumulati e aggregati.
Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per visualizzare diversi intermedi di HTT, in particolare la formazione di una specie di HMW HTT insolubile che sembra tenere sotto controllo con HD patogenesi e malattia progressione1,13 ,14. Essere in grado di risolvere e tenere traccia di più specie di mHTT fornisce ai ricercatori uno strumento biochimico per studiare la patogenesi della malattia e per valutare potenziali interventi terapeutici attraverso la modulazione e l'impatto sulla patogenesi della malattia.

<table><tbody><tr><td>Filtro sterile</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Tappo a vite, filtro sterile per vuoto</td></tr><tr><td>1 mL Macinatore di tessuti, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Modello Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Paragonabile al test Lowry</td></tr><tr><td>Soluzione tampone Tris 1M</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M soluzione</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS soluzione</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonio fluoruro</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>creare 100mM soluzione madre in 100% EtOH, negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Creare una soluzione madre da 0,5 M in acqua</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua</td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Creare una soluzione madre da 500 mM in acqua</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Utilizzare 1:1000 per western blot, 1:500 per il test di ritardo del filtro</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Utilizzare 1:1000 per western blot solubile</td></tr></tbody></table>

frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

L'accumulo di proteine misfolded è centrale per la patologia nella malattia di Huntington (HD) e molte altre patologie neurodegenerative. In particolare, una caratteristica patologica chiave di HD è l'aberrante accumulo della proteina mutante HTT (mHTT) in complessi ad alto peso molecolare e i corpi di inclusione intracellulari è composto da frammenti e altre proteine. I metodi convenzionali per misurare e comprendere che i contributi delle varie forme di mHTT contenenti aggregati includono microscopia a fluorescenza, l'analisi western blot e filtro trappola saggi.
Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono conformazione specifica e pertanto non può risolvere lo stato di cambiamento continuo della proteina mHTT a causa della natura complessa di aggregazione solubilità e la risoluzione completa.
Per l'identificazione di mHTT aggregati e varie forme modificate e complessi, separazione e solubilizzazione degli aggregati cellulari e frammenti è obbligatorio. Qui descriviamo un metodo per isolare e visualizzare mHTT solubile, monomeri, oligomeri, frammenti, e un insolubile ad alto peso molecolare (HMW) accumulato mHTT specie. HMW mHTT tracce con progressione di malattia, corrisponde con le letture di comportamento del mouse e ha stato favorevolmente modulata da determinati interventi terapeutici1. Questo approccio può essere utilizzato con cervello di topo, tessuti periferici e coltura delle cellule, ma può essere adattato ad altri sistemi di modello o contesti di malattia.

Risoluzione di lisati solubili e insolubili, seguito di frazionamento può essere rilevato tramite occidentale saggi di ritardo analisi e filtro (Figura 2). Ad esempio, cellule HEK293T transfected utilizzando il reagente di transfezione (ad es., lipofectamine 2000), con l'esone HTT 1 codifica cDNA contenenti glutammina 97 ripete15 seguita dalla regione ricca di prolina di poli e queste cellule sono state permesse espresso per 4...

Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere uno strumento utile per la visualizzazione, la caratterizzazione e la quantificazione del flusso proteico dell'huntingtina per l'analisi dell'omeostasi proteica nei sistemi modello della malattia di Huntington. Questo metodo può aiutarci a comprendere le questioni relative all'omeostasi delle proteine e alle malattie neurodegenerative, come la comprensione dell'impatto di alcuni interventi terapeutici sulla patogenesi della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli investigatori di isolare e risolvere specie proteiche insolubili per l'analisi quantitativa.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cambiamenti biochimici durante la patogenesi della malattia di Huntington, può anche essere applicato ad altre malattie da misfolding proteico come il Parkinson e il morbo di Alzheimer. Per iniziare questa procedura, etichettare due serie di provette per ciascun campione come solubili e insolubili. Preparare un tampone di lisi immediatamente prima della lisi del campione nella provetta solubile aggiungendo la quantità appropriata di inibitori.Successivamente, aggiungere al tessuto un ta

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

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Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di...

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Fonte: Mackler, R. M., et al. Assemblaggio e Purificazione di Intasomi del Virus della Mucose Bovina. J. Vis. Exp. (2018)Questo video illustra la purificazione degli intasomi del virus della foamy prototipico (PFV) da una sospensione mista proteina-DNA mediante estrazione con sale e cromatografia di esclusione molecolare, ottenendo complessi attivi per analisi successive.

Purificazione di intasomi di Prototype Foamy Virus mediante cromatografia a esclusione dimensionale

Questo video mostra il protocollo per isolare le fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale di topo utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità e la digestione di proteine non amiloidi.

Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale

Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.

Frazione di membrana del cervello: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Qui, presentiamo un protocollo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di monomeri nativi, privo di etichetta e fibrille di exon1, della proteina huntingtina (Httex1), basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO).

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

L'espressione e la purificazione delle proteine contenenti idrolasi fumarylacetoacetate sono descritte con esempi (espressione in E. coli, FPLC). Le proteine purificate sono utilizzate per la cristallizzazione e la produzione di anticorpi e impiegate per i saggi enzimatici. Vengono presentati alcuni saggi fotometrici per mostrare la multifunzionalità di FAHD1 come oxaloacetate decarboxylase e idrolasi acylpyruvate.

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Forniamo protocolli scalabili che coprono la progettazione di costrutti, la trasfezione transitoria, l'espressione e la purificazione di varianti proteiche di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293.

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

Questo protocollo descrive come estrarre la proteina 1 contenente dominio della fumarilacetoacetato idrolasi (FAHD1) dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi elencati possono essere adattati ad altre proteine di interesse e modificati per altri tessuti.

Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo

Scopri il metodo di frazionamento per isolare e quantificare le specie solubili e insolubili di huntingtina mutante da tessuto cerebrale murino e colture cellulari. Questa tecnica avanzata permette di analizzare l'omeostasi proteica nella malattia di Huntington.

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

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