Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili
27 febbraio 2018
Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere uno strumento utile per la visualizzazione, la caratterizzazione e la quantificazione del flusso proteico dell'huntingtina per l'analisi dell'omeostasi proteica nei sistemi modello della malattia di Huntington. Questo metodo può aiutarci a comprendere le questioni relative all'omeostasi delle proteine e alle malattie neurodegenerative, come la comprensione dell'impatto di alcuni interventi terapeutici sulla patogenesi della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli investigatori di isolare e risolvere specie proteiche insolubili per l'analisi quantitativa.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cambiamenti biochimici durante la patogenesi della malattia di Huntington, può anche essere applicato ad altre malattie da misfolding proteico come il Parkinson e il morbo di Alzheimer. Per iniziare questa procedura, etichettare due serie di provette per ciascun campione come solubili e insolubili. Preparare un tampone di lisi immediatamente prima della lisi del campione nella provetta solubile aggiungendo la quantità appropriata di inibitori.
Successivamente, aggiungere al tessuto un tampone di lisi solubile di lavoro a freddo ghiacciato integrato con inibitori della proteasi. Per il tessuto cerebrale del topo, immergere lentamente 30 volte in un distruttore di vetro da un millilitro. Fare attenzione a non rompere la superficie del liquido poiché si formeranno bolle che potrebbero produrre un'omogeneizzazione incompleta.
Quindi pipettarlo nel tubo etichettato con l'insolubile sul ghiaccio. Per le linee cellulari, le cellule sono state piastrate a cinque volte da 10 a cinque cellule in ciascuna piastra a sei pozzetti e cresciute fino a raggiungere una confluenza quasi totale. Successivamente, sciacquare le celle una volta con 1X PBS freddo e rimuoverlo.
Quindi applicare un volume minimo di tampone di lisi sulle cellule e sollevarle con un raschietto cellulare. Quindi, trasferire l'omogenato o il lisato cellulare nella provetta insolubile etichettata e limare su ghiaccio per un'ora. Per i lisati cellulari, triturare più volte per rompere i grumi cellulari prima di iniziare l'incubazione ed evitare la formazione di bolle.
Pulsare brevemente ogni campione per un secondo a metà della lisi. Successivamente, centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius a 15.000 x g per 20 minuti. Quindi rimuovere il surnatante.
Fare attenzione a non disturbare il pellet o lo strato torbido in quanto ciò contaminerebbe la frazione. Pipettare il surnatante come frazione solubile nella provetta marcata con il solubile e tenerla in ghiaccio. Tenere traccia dei tamponi di lisi solubili e insolubili è fondamentale.
Cambiare i tamponi o mettere il tampone insolubile o i campioni sul ghiaccio sarà dannoso per l'esito del protocollo. Lavare il pellet con 500 microlitri di tampone di lisi e centrifugare a quattro gradi Celsius a 15.000 x g per cinque minuti. Ripetere il lavaggio ancora una volta.
Successivamente, rimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente lasciando solo il pellet di tessuto. Successivamente, risospendere il pellet con tampone di lisi integrato con SDS al 4%. Sonicare ogni campione per 30 secondi a temperatura ambiente con un sonicatore a sonda.
Sonicare piccoli volumi per un lungo periodo di tempo è tecnicamente impegnativo. Fare attenzione a non perdere alcun campione emulsionando o spruzzando durante il completamento di questo passaggio. Successivamente, far bollire i campioni per 30 minuti.
Quindi centrifugarli brevemente a 6.000 x g. Successivamente, eseguire il test delle proteine compatibili con il detergente o il test delle proteine di Lowry per misurare la concentrazione delle proteine. Successivamente, aliquotare i campioni in lotti da 50 microlitri per evitare problemi di congelamento/disgelo.
In questa fase, eseguire western blot diluendo 30 microgrammi di campione in un rapporto di uno a uno nel tampone di caricamento. Far bollire i campioni per cinque minuti e centrifugarli brevemente a 6.000 x g. Successivamente, analizza le frazioni in base alla pagina SDS e al western blot.
Colora la membrana con la macchia proteica intera per visualizzare l'efficienza del carico proteico. Ecco le frazioni solubili e insolubili dei lisati cellulari HEK 293T risolte rispettivamente su gel di pagina 4-12% Bis-Tris e 3-8% Tris-Acetato. La frazione solubile normalizzata al controllo del carico di GAPDH mostra una fluttuazione del monomero solubile dell'esone 1 dell'huntingtina mutata in base all'esposizione all'inibitore della proteasi MG132.
La frazione insolubile mostra che le specie accumulate ad alto peso molecolare di huntingtina mutante sono modulate anche dal trattamento con MG132. Ed ecco i campioni di frazioni solubili e insolubili da lisati cellulari HeLA utilizzando l'analisi del western blot e del ritardo del filtro. I dati mostrano che la presenza di un'isoforma SUMO sovraespressa aumenta sia l'huntingtina mutante ad alto peso molecolare che quella insolubile fibrillare nella frazione insolubile.
Questa figura mostra la regolazione dell'accumulo di huntingtina mutante ad alto peso molecolare dopo la modulazione di una potenziale terapia nel frazionamento insolubile dalle cellule HeLa oltre l'espressione dell'esone 1 dell'huntingtina 97Q. Il bersaglio terapeutico PIAS1 è stato silenziato con un siRNA verso PIAS1 o sovraespresso. Le frazioni insolubili da striata di topo trattate con microRNA contro PIAS1 e risolte su gel di pagina di Tris-Acetato al 3-8% mostrano la modulazione dell'huntingtina insolubile ad alto peso molecolare.
Non dimenticare che lavorare con NEM può essere estremamente pericoloso e che l'adozione di precauzioni come indossare una maschera facciale dovrebbe essere sempre presa durante l'esecuzione di questo protocollo. Una volta padroneggiata, questa tecnica dal lisato alla fine del frazionamento può essere eseguita in circa tre o quattro ore a seconda del numero di campioni. Dovrebbe essere prevista un'ora in più per la quantificazione e l'aliquotazione delle proteine.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'elettroforesi su gel di agarosio o il ritardo del filtro, al fine di rilevare rispettivamente oligomeri solubili o fibrille insolubili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e risolvere le proteine insolubili mal ripiegate per l'analisi quantitativa.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per frazionare specie di huntingtina mutante insolubili e solubili da cervello di topo e colture cellulari. La tecnica facilita la caratterizzazione e la quantificazione del flusso della proteina huntingtina, contribuendo all'analisi dell'omeostasi proteica nella malattia di Huntington e in altri disturbi neurodegenerativi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Malattie neurodegenerative
Sfondo
- La proteina huntingtina è implicata nella malattia di Huntington.
- Comprendere l'omeostasi proteica è fondamentale per la patogenesi delle malattie.
- Il malfunzionamento delle proteine è una caratteristica comune in varie malattie neurodegenerative.
- Questo metodo può essere applicato anche allo studio delle malattie di Parkinson e di Alzheimer.
Scopo dello studio
- Fornire uno strumento per la visualizzazione e la quantificazione del flusso della proteina huntingtina.
- Analizzare l'omeostasi proteica nei sistemi modello della malattia di Huntington.
- Valutare l'impatto di interventi terapeutici sulla progressione della malattia.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di specie proteiche solubili e insolubili.
- Preparazione del buffer di lisi con opportuni inibitori.
- Analisi quantitativa del flusso proteico.
- Applicazione del metodo a diversi modelli di malattie neurodegenerative.
Risultati principali
- Il metodo consente l'isolamento efficace di specie proteiche della huntingtina.
- L'analisi quantitativa fornisce informazioni sulle dinamiche di omeostasi proteica.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi alla base delle malattie.
- La tecnica mostra un potenziale applicativo più ampio nelle malattie associate al malfunzionamento proteico.
Conclusioni
- Questo metodo è uno strumento prezioso per lo studio della malattia di Huntington.
- Migliora la comprensione della dinamica delle proteine nella neurodegenerazione.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altre malattie correlate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di risolvere quantitativamente le forme solubili e insolubili della huntingtina mutante, fornendo informazioni meccanicistiche sull'omeostasi proteica nei modelli di malattia di Huntington. Isolando gli aggregati di alto peso molecolare rilevanti per la malattia, che si correlano con gli esiti fenotipici e la modulazione terapeutica, l'approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi associati alle strategie di modulazione della HTT. Offre un flusso di lavoro trasferibile applicabile in contesti di colture cellulari, tessuti e altre malattie neurodegenerative, migliorando la capacità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi del flusso delle specie di HTT mutate per chiarire i meccanismi patogenetici e validare HTT come bersaglio terapeutico.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative dei compartimenti solubili e insolubili di HTT per valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando i cambiamenti biochimici nelle specie di HTT alla progressione della malattia e alla risposta terapeutica.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza per saggi: Genera frazioni solubili e insolubili standardizzate adatte per saggi successivi come western blot, filtrazione con ritardo o rilevamento di oligomeri.
- Output quantitativo: Permette la misurazione precisa della concentrazione delle specie di HTT mediante saggi proteici compatibili con detergenti, supportando analisi di risposta dose-dipendente e nel tempo.
- Riproducibilità: Passaggi definiti di lisi, centrifugazione e lavaggio garantiscono una frazionamento costante tra diversi tipi di campioni, facilitando il trasferimento del saggio e l'uso in contesti multifunzionali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Isola specie di HTT ad alto peso molecolare che si correlano con il comportamento nei topi e sono modulate da interventi terapeutici, permettendo un collegamento tra fenotipo e meccanismo.
- Continuità traslazionale: Consente il passaggio da modelli in vitro a validazioni su tessuti, allineando le scoperte con le valutazioni di efficacia preclinica.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se gli interventi influenzano monomeri solubili, oligomeri o aggregati insolubili, riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, consentendo la verifica di ipotesi su strategie di targeting della HTT prima dell'identificazione del capostazione e della validazione preclinica, fornendo letture quantitative basate sulla frazionamento dell'omeostasi proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi meccanicistica dei percorsi di processamento, aggregazione e rimozione della HTT in modelli di malattia.
- Screening: Prepara frazioni biochimicamente definite per lo screening affidabile di composti contro forme solubili o insolubili della HTT.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sulla concentrazione proteica e su blotting western per confrontare i livelli di diverse forme della HTT in condizioni sperimentali diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega la frazionamento della HTT a livello cellulare e tissutale con esiti comportamentali e patologici in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio del malfolding proteico nei modelli di Huntington, Parkinson e Alzheimer.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia sul bersaglio risolvendo i contributi specifici della specie HTT alla patogenesi e alla risposta terapeutica.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di lisi, frazionamento e quantificazione proteica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione collegando la modulazione del bersaglio a modifiche misurabili negli aggregati di HTT rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di candidati in grado di ridurre l'espressione di HTT o di modulare l'aggregazione, basata sulla riduzione delle specie insolubili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica delle proteine, tecniche di frazionamento e analisi mediante western blot.
- Dipende dall'accesso a centrifuga, sonicator e reagenti compatibili, inclusi SDS e inibitori delle proteasi.
- Necessita di protocolli standardizzati tra i gruppi di lavoro per prevenire contaminazioni crociate tra tamponi e garantire la purezza delle frazioni.
- Deve tenere conto della variabilità nell'efficienza di omogeneizzazione dei tessuti e nell'efficienza della sonificazione quando si passa da un modello all'altro.
- È limitato dalla necessità di una manipolazione accurata per evitare la perdita di campione durante i passaggi di sonificazione e risospensione, in particolare con volumi ridotti.
