Name: Coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello Ex Vivo della membrana di Bruch umano invecchiato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara a coltivare cellule epiteliali del pigmento retinico su membrane di Bruch umane invecchiate per studiare la degenerazione maculare legata all'età. Questo metodo consente di analizzare il comportamento cellulare in vivo.

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Questa ricerca è supportata dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, www.rpbusa.org e il maggiore centro di New York per retinica degenerativa malattia Foundation Fighting cecità, www.blindness.org. Gli autori vorrei ringraziare Luanna Bartholomew, pH.d., per la sua revisione critica di questo manoscritto.

Il seguente protocollo viene eseguito in aderenza ai principi della dichiarazione di Helsinki e le linee guida del Comitato di etica umana ricerca di Yale University.
1. gli occhi erogatori umani di sourcing
<ol><li>Ottenere globi donatore umano dalla nazionale ricerca malattia Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). A seconda del progetto, è necessario preparare non meno di tre paia di occhi di donatore per ogni gruppo sperimentale.</li>
	<li>Enucleare gli occhi erogatori all'interno di 10 h e nave entro 48h post-mortem. Quindi trasportare gli occhi al laboratorio in modificato Eagle medium (DMEM) terreno di coltura sterile di Dulbecco su ghiaccio. Precedentemente segnalati studi hanno dimostrato che gli occhi donatore raccolgono e trasportati in questo modo di preservare le caratteristiche biologiche e le attività di membrana25,26,29 di Bruch.</li>
</ol>2. raccolta della membrana di Bruch umano espianti
<ol><li>Luogo ogni occhio su una garza di 1,5 x 1,5 pollici imbevuto con anidride carbonica-indipendente DMEM media in una piastra di coltura di 100 mm e uso lama fine forbici per fare un'incisione attraverso la sclera 3 mm posteriormente al limbus ed estendere circonferenzialmente in entrambe le direzioni.</li>
	<li>Fare un incisione circonferenziale di pieno-spessore (penetrando vitroso) 1 mm posteriore per l' ora serrata. Rimuovere e gettare il segmento anteriore (cornea, lente e iris), il vitreo e retina.</li>
	<li>Utilizzare forbici chirurgiche bene fare quattro incisioni radiali tra la sclera e la coroide e staccarsi la sclera la periferia al nervo ottico, avendo cura di evitare di strappare la membrana di Bruch/coroide complesse.</li>
	<li>Successivamente, praticare un'incisione circonferenza attraverso lo spazio suprachoroidal lungo l' ora serrata e sbucciare complesso coroide membrana di Bruch RPE posteriormente dalla sclera.</li>
	<li>Rimuovere cellule RPE native bagnando l'espianto con 0,02 M idrossido di ammonio in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) in un polistirolo 60 x 15 mm di Petri per 20 min a temperatura ambiente, seguita da lavare tre volte in DPBS (Figura 1).</li>
	<li>Float espianto di complesso membrana di Bruch in media senza anidride carbonica su una membrana di 65 µm di spessore politetrafluoroetilene unlaminated, idrofobo con 0,2 µm pori, con lo strato di lamina basale di ogni espianto rivolto verso la membrana.</li>
	<li>Inserire una membrana di politetrafluoroetilene con espianto della membrana di Bruch su un supporto di vetro sinterizzato in un sistema di vuoto portafiltro microanalisi di vetro.</li>
	<li>Appiattire i bordi arricciati dal lato della coroide con una pinzetta rivestita con Teflon, facendo attenzione a non per toccare il lato di laminina basale membrana di Bruch.</li>
	<li>15 mL di agarosio (4% in DPBS) di calore e quindi raffreddarlo a 37 ° C. Poi versare 15 mL di gel frullato sul complesso coroide membrana di Bruch dal lato coroidica esercitando una leggera aspirazione per garantire che l'espianto rimarrà piatta. Mantenere il tessuto a 4 ° C per 2-3 min solidificare l'agarosio e poi sbucciare la membrana di politetrafluoroetilene distanza.</li>
	<li>Mettere espianto di membrana di Bruch (1,5 pollici di diametro, all'interno di gel di agarosio solidificato) in un 60 x 15 mm polistirolo cella cultura piatto (con la membrana di Bruch si è rivolto verso l'alto) che è stato rivestito con agarosio caldo liquido sul fondo del piatto per fissare la membrana di Bruch explant sul fondo del pozzo con lo strato basale laminina explant rivolto verso l'alto.</li>
	<li>L'agarosio solidificherà entro 2-3 min a temperatura ambiente per stabilizzare espianti di membrana di Bruch nella piastra di coltura. Coperchio della membrana di Bruch espianti nella cultura piatto con DPBS e memorizzare il piatto a 4 ° C per un uso futuro. Figura 2A dimostra che la membrana di Bruch isolato espianti in una piastra di coltura 60 x 15 mm.</li>
	<li>Se il sistema di coltura desiderata si trova in una piastra a 96 pozzetti, espianto di membrana di Bruch (1,5 pollici di diametro, con gel di agarosio solidificato) posto su un foglio di Teflon con il laminin-lato in su.</li>
	<li>Utilizzando un trapano, tagliata cinque o sei, 6 mm-circolare pulsanti dalla membrana di Bruch complesso explant e inserire ciascuno su agarosio al 4% a 37 ° C in un polistirolo non trattata bene di una piastra a 96 pozzetti. L'agarosio solidificherà entro 2-3 min a temperatura ambiente per Difficoltà espianti di membrana di Bruch (pulsanti) sul fondo di ciascun pozzetto. Nota: Nella figura 2B dimostra pulsanti a membrana di Bruch trephined in una piastra a 96 pozzetti. In genere, 9-11 pulsanti o espianti possono essere raccolto da ogni occhio.</li>
</ol>3. coltura delle cellule epiteliali (RPE) del pigmento retinico sulla membrana di Bruch umano espianti
<ol><li>Al ricevimento degli occhi dei donatori, pulire il tessuto extraoculare con DPBS. Praticare un'incisione circonferenza 5 mm sotto l'iride-sclera tocco punto (pars plana) nello spazio subretinal. Scartare il segmento anteriore, vitreo e retina.</li>
	<li>Lavare l'oculare, che contiene la membrana di Bruch e foglio di RPE, con DPBS freddo. Dissociare le cellule RPE con 5 mL di tripsina 0,25% per non più di 10 min per ciascun campione di occhio. Placare la reazione di tripsina con 25 mL di terreno completo DMEM con 15% siero bovino fetale (FBS) riscaldato a 37 ° C in un tubo da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 × g per 10 min a 24 ° C e risospendere il pellet in 5 mL di terreno completo DMEM (con 15% FBS).</li>
	<li>Contare le celle e 15.000 cellule RPE vitali sulla lamina basale di espianti di ogni Bruch invecchiato vari membrana (pulsanti) in una piastra a 96 pozzetti in 200 µ l di media senza siero minimo essenziale (MEM) contenenti antibiotici di seme (100 IU/mL di penicillina G, 100 mg / mL di streptomicina, gentamicina 5 mg/mL e 2,5 mg/mL anfotericina B). Supponendo un diametro delle cellule di 20 µm, placcatura a questa densità vi permetterà di cellule RPE coprire circa il 15% della zona di placcatura.</li>
	<li>Piastra le cellule sul pulsante, per cui la densità delle cellule può quindi essere aumentata gradualmente fino a confluenza di 100% a seconda dell'effetto di ogni parametro sul comportamento delle cellule.</li>
	<li>Permettono alle cellule di fissare per l'espianto per 24 h in atmosfera umidificata di 95% air/5% CO2 a 37 ° C. Delicatamente sostituire il terreno con DMEM completo caldo.</li>
</ol>

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<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li>
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</ol>

Nessuno degli autori hanno qualsiasi divulgazione commerciale di dichiarare.

Membrana di Bruch umano invecchiato (matrice extracellulare) contribuisce alla progressione della malattia di AMD e così c'è una necessità di capire come questa matrice alterata contribuisce alla disfunzione delle cellule RPE. Data la mancanza di sufficienti modelli animali per studiare i cambiamenti relativi all'età in AMD, ex vivo sistemi modello che imitano gli effetti della malattia possono servire come uno strumento prezioso per capire la patofisiologia. La metodologia descritta in questo manoscritto può essere utilizzata per isolare costantemente umano espianti di membrana di Bruch e cultura RPE cellule, tra cui linee di cellule RPE primarie, immortalate o derivati da cellule staminali.
Come accennato in precedenza, espianti di membrana di Bruch umano provengono dal NDRI. Un protocollo è stabilito con NDRI che specifica i criteri stabiliti per gli occhi del donatore essere accettabile. Ad esempio, i donatori non devono avere nessun malattie conosciute della retina degli occhi, occhi/globi vengono recuperati all'interno di 10 h dopo la morte e globi arrivano in laboratorio entro 48 h dopo la morte (tramite consegna pacchetto durante la notte sul ghiaccio). Specificare la fascia di età appropriata e il numero di occhi necessari per l'analisi statistica dello studio, ad es., cinque paia di globi da donatori fra le età di 20-49 anni e cinque paia di globo da donatori di età compresa tra i 50-89 anni.
La disponibilità dei globi occhio varia, generalmente una media di dieci paia di globi disponibili ogni mese. Il pacchetto di occhio arriva con informazioni di base, de-identificato donatore: età, razza, tempo di morte, causa di morte e breve anamnesi passata (profilo di malattia o comorbidità).
La cosa più importante, raccolta espianti di membrana di Bruch umana richiede la rimozione del segmento anteriore dell'occhio e vitreo, permettendo per l'isolamento del complesso coroide membrana di Bruch RPE. Una volta isolata la membrana di Bruch, cellule RPE possono essere seminate sugli espianti acellulare alle concentrazioni variabili e coltivate per esperimenti a valle. La preparazione e la manipolazione procedurali come descritto nel presente documento è critica, prestando attenzione all'orientamento della membrana di Bruch isolato per assicurarsi che la superficie laminare è rivolto-up pur non toccando la superficie meccanicamente per evitare di danneggiare il struttura di superficie della matrice extracellulare.
Si deve anche osservare che quando si utilizzano sistemi di espianto della membrana di Bruch, ci sono alcune variabili che potrebbero influenzare i risultati di esperimenti a valle come sfondo genomica dei donatori individuali, età della membrana di Bruch, o tempo post mortem di Bruch membrana e la posizione della membrana di Bruch, vale a dire., centrale o periferico parte degli espianti di membrana di Bruch. Come con qualsiasi altro studio di tessuti umani, uno deve reclutare il numero di esempio appropriato donatore occhio per avere la necessaria potenza statistica e abbinare età dell'occhio donatore se appropriato. Stabilire criteri rigorosi per l'accettazione di occhi da banche degli occhi è un parametro critico. Accettano solo gli occhi che sono enucleated meno di 10 h post mortem e che preparazione della membrana di Bruch possa essere raccolte entro 24-48 h dopo la morte. Il sito del nervo ottico può essere utilizzato come un indicatore per l'orientamento e utilizzare le stesse posizioni per sperimentale e di controllo di gruppi di studio. Attraverso queste misure, uno può ridurre al minimo la variabilità sperimentale.
In sintesi, comprensione del complesso coroide membrana di Bruch RPE e come essa è influenzata dall'età e la malattia è fondamentale per comprendere il suo contributo alla patofisiologia di AMD. Sistemi di modello che impiegano tecniche di ex vivo sono uno strumento prezioso per studiare questi effetti utilizzando tessuto umano. Qui, descriviamo una metodologia che si avvale di espianti di donatore umano come un modello di rilevanti ex vivo della membrana di Bruch invecchiato. Questa tecnica permette di utilizzare la membrana di Bruch umano invecchiato e/o malato come uno strumento di ricerca per studiare come i mutamenti strutturali all'interno della matrice può influenzare sovrapponendo RPE comportamento cellulare compreso di espressione genica, la proliferazione e allegato25 , 27. lo sviluppo di sistemi simili ex vivo modello sarà avanzare la nostra comprensione di AMD e facilitare lo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.

Età-correlate cambiamenti strutturali alla membrana di Bruch umana, che è causata da molti fattori, tra cui nitrosativo e stress ossidativo, esercita molteplici effetti deleteri sulla funzione del pigmento retinico epiteliale (RPE) cellule e contribuisce alla patologia di degenerazione maculare senile (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Quando si considera la terapia sostitutiva delle cellule per avanzate AMD atrofica o atrofia geografica, trattamento richiederà probabilmente il trapianto di cellule su un letto di atrofia delle cellule RPE. Cambiamenti età-correlati all'interno della membrana di Bruch umana possono influenzare negativamente il successo degli innesti di cellule RPE trapiantati, dato il danno alla matrice extracellulare6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating umani biologia della membrana di Bruch e come i mutamenti strutturali all'interno della matrice contribuire alla progressione di AMD sono fondamentali per comprendere la patologia della malattia. Così, c'è una necessità critica per gli investigatori nel campo degli occhi legate all'età di sviluppare protocolli che descrivono la raccolta di ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malate.
Storicamente, è stato difficile ai disordini relativi all'età di modello quali atrofia geografica e membrana di Bruch umana a un invecchiato in animali23. Questa difficoltà nasce da molteplici fattori tra cui la longevità degli esseri umani rispetto ai roditori e altre specie frequentemente utilizzato per malattia di modellazione, come pure la mancanza di un macula nella maggior parte dei vertebrati24. Il vantaggio del metodo descritto qui è che le cellule possono essere testate direttamente sulla membrana di Bruch estratta dal post mortem occhi di persone malate o invecchiati. L'obiettivo generale di questo articolo è fornire una metodologia dettagliata per un modello ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malati, tra cui l'isolamento di umano di Bruch membrana espianti da donatori umani e la semina di RPE cellule per esperimenti a valle. Questo modello può servire come un modello pertinente di studiare il contributo di danni di matrice extracellulare RPE cellulare funzione e patologia20,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>Globi donatori umani National</td><td>Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon-dioxide independent media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in polistirene da 60 mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>351007</tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 & micro; membrana in politetrafluoroetilene di spessore m con 0,2 &micro; m pori</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand sistema di supporto per filtro sottovuoto per microanalisi in vetro&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 & 10mm piastra di coltura</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>piastra Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Supporti minimi essenziali (MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello ex vivo della membrana di bruch umano invecchiato

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Oltre a vitamine e antiossidanti consigliati dallo studio di malattia dell'occhio relativa all'età, non esiste nessuna terapia efficace per "secca" o atrofica età degenerazione maculare senile (AMD) che rappresenta il 90% dei casi. Sono necessarie terapie per rallentare o ritardare lo sviluppo di atrofia geografica (GA), e capire la patologia della membrana di Bruch è parte di questo processo. Alterazioni nella membrana di Bruch umano precedono la progressione di AMD contribuendo al danno di epiteliale del pigmento retinico (RPE) cellule. Data la mancanza di sufficienti modelli animali per lo studio di AMD, modelli ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato servono come un utile strumento per studiare il comportamento delle cellule RPE da immortalato e linee cellulari primarie come pure RPE linee derivate da staminali pluripotenti indotte cellule (iPSCs). Qui, presentiamo un metodo dettagliato che permette di determinare gli effetti del comportamento delle cellule RPE seminate su espianti di membrana di Bruch umano raccolto da donatori umani, compreso l'allegato, apoptosi e proliferazione, capacità di phagocytize del fotoricettore esterno segmenti, istituzione di polarità e l'espressione genica. Questo test fornisce un modello ex vivo della membrana di Bruch invecchiato per valutare le caratteristiche funzionali delle cellule RPE quando seminato sulla matrice extracellulare invecchiato/compromessa.

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si possono determinare gli effetti della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malati sulla funzione delle cellule RPE dalla definizione di polarità e la barriera della retina esterna sangue, secrezione polarizzata di fattori di crescita e citochine, e la fagocitosi dei segmenti esterni del fotoricettore della barretta.
Abbiamo generato i dati che dimostrano un fenotipo di malattia sulla membrana di Bruch umano invecchiato. Ad esempio, coltura delle cellule RPE su invecchiato membrana espianti diminuzioni RPE cella il reattachment di Bruch umano (Figura 3). Cellule RPE coltivate su membrana di Bruch umano invecchiato diminuisce la capacità di queste cellule di phagocytize segmenti esterni della barretta (ROS), una funzione critica di RPE (Figura 4). Inoltre, cellule apoptotiche possono essere identificate e confrontate su questi espianti di pulsante utilizzando un terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick d'etichettatura (TUNEL) macchia come descritto nel precedente lavoro26. Gli effetti di un invecchiato e/o malato umano la membrana di Bruch, il profilo di espressione genica delle cellule RPE possono essere determinati mediante tecnologia microarray. Abbiamo dimostrato che l'espressione genica delle cellule RPE è alterato quando coltivate sulla membrana di Bruch umana da individui più anziani rispetto a espianti da più giovani individui (Figura 5)27. Per l'analisi statistica, espianti di donatori umani almeno 3-5 sono utilizzati per ogni gruppo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figura 1. Rappresentazione schematica della separazione della membrana di Bruch umana dagli occhi di donatore. Membrana di Bruch umano si raccolgono rimuovendo la sclera, segmento anteriore, retina, vitreo ed epiteliale (RPE) cellule del pigmento retinico nativo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figura 2. Isolato la membrana di Bruch umano (BM) in una piastra di coltura. (A) schema degli espianti di membrana di Bruch umano (ogni 1,5 pollici di diametro, con gel di agarosio solidificato) collocati in un 60 × 15 mm polistirolo cella cultura piatto (BM scoperte) riempito con liquido caldo agarosio sul fondo del piatto. Espianto di membrana di Bruch un umano (B) che è stato trephined in pochi pulsanti circolari a 6 mm (espianti), ogni portata che veniva riposto su agarosio al 4% a 37 ° C in un polistirolo non trattata bene di una piastra a 96 pozzetti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figura 3. Cellula epiteliale del pigmento retinico (RPE) Tasso di riattacco sulla membrana di Bruch umano giovani e meno giovani (BM). Cellule RPE primarie sono state seminate su umani della membrana di Bruch espianti da giovani (&lt; 50-year-old, n = 3) o più anziani (&gt; 70 anni, n = 5) occhi donatore per tre settimane. Tasso di attacco delle cellule è stata misurata dall'analisi di attuabilità delle cellule MTT. Membrana di Bruch umano più vecchio ridotto il tasso di attacco delle cellule RPE di 24% (giovane BM 100 + 8,54 S.E. vs vecchi BM 76,65 + /-1,44 S.E.). p &lt; 0,05, S.E. = errore standard.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figura 4. Fagocitosi di cella (RPE) epiteliale del pigmento retinico sono influenzata dall'età della membrana di Bruch umano (BM). Cellule primarie di RPE coltivate su umani più anziani della membrana di Bruch espianti avevano una ridotta capacità di phagocytize segmenti esterni della barretta (ROS) (giovane BM 873 + /-9.3 S.E., n = 5 vs vecchi BM 608 + /-25.4 S.E., n = 5). p &lt; 0.01, S.E. = errore standard.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figura 5. Numero di retinico del pigmento epiteliali geni di cellule (RPE) espressi in ogni campione coltivate su young o membrana di Bruch umano più vecchio espianti. Non c'era più dispersione nel numero di geni espressi in cellule primarie di RPE seminate su vecchi contro la membrana di Bruch umano più giovane (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, rispettivamente); cinque espianti sono stati testati per ogni gruppo di età. Ha presentato con l'autorizzazione completa di tutti gli autori del Cai, H et al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare alla coltura delle cellule (RPE) epiteliale del pigmento retinico sulla membrana di Bruch umano invecchiato e/o malate. Questo metodo è adatto per studiare il comportamento delle cellule RPE su una matrice extracellulare compromessa.

Coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello Ex Vivo della membrana di Bruch umano invecchiato

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di creare una matrice extracellulare ex vivo nota come sistema di coltura della membrana di Bruch, per osservare l'effetto della membrana di Bruch sulla sovrapposizione di cellule epiteliali pigmentali retiniche. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nella sub-biologia dell'RPE nel campo dell'eziologia dell'AMD, come ad esempio se i cambiamenti sulle membrane di Bruch invecchiate contribuiscono ai malfunzionamenti delle cellule RPE sovrapposte. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di isolare la membrana di Bruch nativa da un occhio di donatore umano di età diverse e di utilizzarla per lo studio della proteomica in colture cellulari di RPE.Isolare la membrana di Bruch e creare un vero e proprio sistema di coltura vivo con il minimo danno alla membrana nativa di Bruch è impegnativo, ma vi mostrerò come in questo video. Per iniziare, metti una garza da 1,5 pollici quadrati imbevuta di DMEM indipendente dalle emissioni di CO2 in un piatto da 100 millimetri. Quindi caricare il globo oculare sulla garza.Successivamente, utilizzare una lama chirurgica per praticare un'incisione attraverso la sclera tre millimetri dietro il limbus. Quindi, usa le forbici a lama fine per praticare un'incisione a tutto spessore ed estendere circonferenzialmente l'incisione in entrambe le direzioni intorno all'occhio. Quindi, rimuovere e scartare il segmento anteriore, compresa la cornea, il cristallino e l'iride.Inoltre, scartare il vitreo e la retina. Quindi, staccare con cura il complesso coroide della membrana di Bruch dell'RPE dalla periferia al nervo ottico utilizzando una spatola rivestita di teflon. Questo deve essere fatto con molta attenzione per non strappare il complesso della membrana.Ora, usa le forbici chirurgiche sottili per fare quattro incisioni radiali nella sclera e staccare la sclera. Quindi, tagliare l'espiante della coroide di membrana di Bruch dal nervo ottico e trasferire questo espiante in un piatto da 60 millimetri contenente 0,02 idrossido di ammonio molare in DPBS. Per rimuovere le cellule RPE native, incubare questo espiante per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, lavare l'espiante tre volte utilizzando DPBS fissando il sito del nervo ottico sulla membrana di Bruch con una pinza rivestita di teflon mentre la soluzione scorre intorno al tessuto. Quindi, far galleggiare l'espianto, con il lato della laminina rivolto verso l'alto in un terreno privo di anidride carbonica. Praticare quattro incisioni sulla membrana di Bruch, quindi trasferire una membrana in PTFE idrofobica non laminata, spessa 65 micron con pori di 0,2 micron, sopra l'espianto.Posizionarlo con la lamina basale contro la membrana in PTFE. Rimuovere il liquido in eccesso dal piatto, quindi trasferire il gruppo in un sistema di supporto del filtro sottovuoto per microanalisi in vetro, dove deve essere posizionato su un supporto di vetro screpolato. Successivamente, evitando accuratamente il contatto con la lamina basale, appiattire i bordi arricciati del lato coroideale utilizzando una pinza rivestita in teflon.Ora, liquefare 15 millilitri di agarosio al 4% in DPBS e raffreddarlo a 37 gradi Celsius. Quindi, versare lentamente l'agarosio sul lato coroideale dell'espianto, esercitando un'aspirazione delicata per mantenerlo piatto. Una volta che il gel inizia a solidificarsi, trasferirlo con la membrana in un piatto da 60 millimetri su ghiaccio.Lascia che il gel si solidifichi per due o tre minuti, quindi stacca la membrana in PTFE. Quindi, immergere l'espiante in DPBS e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quando si coltiva l'espiante su un piatto da 60 millimetri rivestito con agarosio liquido al 4%, fare in modo che la membrana di Bruch sia rivolta verso l'alto.Quando si utilizza una piastra a 96 pozzetti rivestita in polistirene, posizionare l'espiante di membrana di Bruch rivestito in gel su un foglio piatto di teflon con il lato della laminina rivolto verso l'alto. Quindi, usando una trefina, tagliare da sei a otto bottoni da sei millimetri dall'espiantante e trasferire i bottoni di tessuto in pozzetti carichi di agarosio liquido. Per iniziare, posiziona il globo oculare su una garza imbevuta di DPBS come prima.Successivamente, praticare un'incisione circonferenziale cinque millimetri sotto il punto di contatto iride-sclera, la pars plana, nello spazio sottoretinico. Scartare il segmento interno, l'umor vitreo e la retina. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, lavare l'oculare con due o tre millilitri di DPBS freddo.In totale, lavare l'oculare tre volte. Quindi, per dissociare le cellule RPE, trattare la conchiglia oculare con tripsina per un massimo di 10 minuti. Quindi, trasferire le cellule RPE tripsinizzate in una provetta da 50 millilitri e, per estinguere la reazione, aggiungere 25 millilitri di terreno con FBS a 37 gradi Celsius.Ora, centrifugare il fazzoletto e la soluzione a 200 g per 10 minuti a 24 gradi Celsius. Quindi, risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM completo di terreno con il 15% di FBS. Ora, contate le cellule e posizionate 15.000 cellule RPE vitali in 200 microlitri di terreno essenziale minimo privo di siero contenente antibiotici su ciascun bottone della membrana di Bruch nella piastra a 96 pozzetti.Coltivare le cellule per almeno 24 ore per l'attaccamento. Successivamente, cambia delicatamente il terreno per riscaldare il DMEM completo e continua a coltivare le cellule. Utilizzando questo protocollo, le membrane di Bruch umane invecchiate e malate possono essere studiate facendo crescere su di esse cellule RPE.In genere, gli espianti invecchiati riducono il riattacco delle cellule RPE. Le cellule RPE coltivate sulla membrana di Bruch umana invecchiata sono anche meno in grado di fagocitare i segmenti esterni dei bastoncelli, una funzione critica dell'RPE. Utilizzando i microarray, è stato scoperto che l'espressione genica delle cellule RPE è diversa quando le cellule vengono coltivate sulla membrana di Bruch da individui più anziani rispetto alle cellule coltivate sulla membrana da individui più giovani.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la membrana di Bruch dagli occhi del donatore umano e fare espianti in cui le cellule RPE possono essere coltivate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non toccare il lato della laminina dell'espiante della membrana di Bruch con strumenti di dissezione per evitare di danneggiare la superficie.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la fagocitosi RPE e gli studi di espressione genica delle cellule RPE, al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se la membrana di Bruch proveniente da un donatore di età variabile o da donatori con degenerazione maculare legata all'età influenzerà le funzioni delle cellule RPE sovrapposte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della degenerazione maculare legata all'età per esplorare il meccanismo eziologico dell'AMD in un sistema modello ex vivo della membrana di Bruch.

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Biologia dello sviluppo

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Coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello Ex Vivo della membrana di Bruch umano invecchiato

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