Coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello Ex Vivo della membrana di Bruch umano invecchiato

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di creare una matrice extracellulare ex vivo nota come sistema di coltura della membrana di Bruch, per osservare l'effetto della membrana di Bruch sulla sovrapposizione di cellule epiteliali pigmentali retiniche. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nella sub-biologia dell'RPE nel campo dell'eziologia dell'AMD, come ad esempio se i cambiamenti sulle membrane di Bruch invecchiate contribuiscono ai malfunzionamenti delle cellule RPE sovrapposte. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di isolare la membrana di Bruch nativa da un occhio di donatore umano di età diverse e di utilizzarla per lo studio della proteomica in colture cellulari di RPE.

Isolare la membrana di Bruch e creare un vero e proprio sistema di coltura vivo con il minimo danno alla membrana nativa di Bruch è impegnativo, ma vi mostrerò come in questo video. Per iniziare, metti una garza da 1,5 pollici quadrati imbevuta di DMEM indipendente dalle emissioni di CO2 in un piatto da 100 millimetri. Quindi caricare il globo oculare sulla garza.

Successivamente, utilizzare una lama chirurgica per praticare un'incisione attraverso la sclera tre millimetri dietro il limbus. Quindi, usa le forbici a lama fine per praticare un'incisione a tutto spessore ed estendere circonferenzialmente l'incisione in entrambe le direzioni intorno all'occhio. Quindi, rimuovere e scartare il segmento anteriore, compresa la cornea, il cristallino e l'iride.

Inoltre, scartare il vitreo e la retina. Quindi, staccare con cura il complesso coroide della membrana di Bruch dell'RPE dalla periferia al nervo ottico utilizzando una spatola rivestita di teflon. Questo deve essere fatto con molta attenzione per non strappare il complesso della membrana.

Ora, usa le forbici chirurgiche sottili per fare quattro incisioni radiali nella sclera e staccare la sclera. Quindi, tagliare l'espiante della coroide di membrana di Bruch dal nervo ottico e trasferire questo espiante in un piatto da 60 millimetri contenente 0,02 idrossido di ammonio molare in DPBS. Per rimuovere le cellule RPE native, incubare questo espiante per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, lavare l'espiante tre volte utilizzando DPBS fissando il sito del nervo ottico sulla membrana di Bruch con una pinza rivestita di teflon mentre la soluzione scorre intorno al tessuto. Quindi, far galleggiare l'espianto, con il lato della laminina rivolto verso l'alto in un terreno privo di anidride carbonica. Praticare quattro incisioni sulla membrana di Bruch, quindi trasferire una membrana in PTFE idrofobica non laminata, spessa 65 micron con pori di 0,2 micron, sopra l'espianto.

Posizionarlo con la lamina basale contro la membrana in PTFE. Rimuovere il liquido in eccesso dal piatto, quindi trasferire il gruppo in un sistema di supporto del filtro sottovuoto per microanalisi in vetro, dove deve essere posizionato su un supporto di vetro screpolato. Successivamente, evitando accuratamente il contatto con la lamina basale, appiattire i bordi arricciati del lato coroideale utilizzando una pinza rivestita in teflon.

Ora, liquefare 15 millilitri di agarosio al 4% in DPBS e raffreddarlo a 37 gradi Celsius. Quindi, versare lentamente l'agarosio sul lato coroideale dell'espianto, esercitando un'aspirazione delicata per mantenerlo piatto. Una volta che il gel inizia a solidificarsi, trasferirlo con la membrana in un piatto da 60 millimetri su ghiaccio.

Lascia che il gel si solidifichi per due o tre minuti, quindi stacca la membrana in PTFE. Quindi, immergere l'espiante in DPBS e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quando si coltiva l'espiante su un piatto da 60 millimetri rivestito con agarosio liquido al 4%, fare in modo che la membrana di Bruch sia rivolta verso l'alto.

Quando si utilizza una piastra a 96 pozzetti rivestita in polistirene, posizionare l'espiante di membrana di Bruch rivestito in gel su un foglio piatto di teflon con il lato della laminina rivolto verso l'alto. Quindi, usando una trefina, tagliare da sei a otto bottoni da sei millimetri dall'espiantante e trasferire i bottoni di tessuto in pozzetti carichi di agarosio liquido. Per iniziare, posiziona il globo oculare su una garza imbevuta di DPBS come prima.

Successivamente, praticare un'incisione circonferenziale cinque millimetri sotto il punto di contatto iride-sclera, la pars plana, nello spazio sottoretinico. Scartare il segmento interno, l'umor vitreo e la retina. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, lavare l'oculare con due o tre millilitri di DPBS freddo.

In totale, lavare l'oculare tre volte. Quindi, per dissociare le cellule RPE, trattare la conchiglia oculare con tripsina per un massimo di 10 minuti. Quindi, trasferire le cellule RPE tripsinizzate in una provetta da 50 millilitri e, per estinguere la reazione, aggiungere 25 millilitri di terreno con FBS a 37 gradi Celsius.

Ora, centrifugare il fazzoletto e la soluzione a 200 g per 10 minuti a 24 gradi Celsius. Quindi, risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM completo di terreno con il 15% di FBS. Ora, contate le cellule e posizionate 15.000 cellule RPE vitali in 200 microlitri di terreno essenziale minimo privo di siero contenente antibiotici su ciascun bottone della membrana di Bruch nella piastra a 96 pozzetti.

Coltivare le cellule per almeno 24 ore per l'attaccamento. Successivamente, cambia delicatamente il terreno per riscaldare il DMEM completo e continua a coltivare le cellule. Utilizzando questo protocollo, le membrane di Bruch umane invecchiate e malate possono essere studiate facendo crescere su di esse cellule RPE.

In genere, gli espianti invecchiati riducono il riattacco delle cellule RPE. Le cellule RPE coltivate sulla membrana di Bruch umana invecchiata sono anche meno in grado di fagocitare i segmenti esterni dei bastoncelli, una funzione critica dell'RPE. Utilizzando i microarray, è stato scoperto che l'espressione genica delle cellule RPE è diversa quando le cellule vengono coltivate sulla membrana di Bruch da individui più anziani rispetto alle cellule coltivate sulla membrana da individui più giovani.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la membrana di Bruch dagli occhi del donatore umano e fare espianti in cui le cellule RPE possono essere coltivate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non toccare il lato della laminina dell'espiante della membrana di Bruch con strumenti di dissezione per evitare di danneggiare la superficie.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la fagocitosi RPE e gli studi di espressione genica delle cellule RPE, al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se la membrana di Bruch proveniente da un donatore di età variabile o da donatori con degenerazione maculare legata all'età influenzerà le funzioni delle cellule RPE sovrapposte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della degenerazione maculare legata all'età per esplorare il meccanismo eziologico dell'AMD in un sistema modello ex vivo della membrana di Bruch.