Name: I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Scopri la microscopia dSTORM bidimensionale per visualizzare microtubuli e filamenti intermedi in cellule U373 fissate. Questo metodo super-risoluzione consente di caratterizzare le interazioni del citoscheletro con dettaglio nanometrico.

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Ringraziamo Mickael Lelek, Orestis Faklaris e Nicolas Bourg per la proficua discussione, Andrey Aristov ed Elena Rensen per aiuto con la tecnica di Super-risoluzione e Shailaja Seetharaman per una lettura attenta del manoscritto. Noi riconosciamo con gratitudine Citech UtechS fotonici Bioimmagini (Imagopole) dell'Institut Pasteur (Parigi, Francia), nonché la rete di infrastrutture di Francia-bioimmagini supportato da French National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investimenti per il futuro) e la Région Ile de France (programma Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) per l'uso del microscopio Elyra. Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Contre le Cancer e la French National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

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</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Fasi critiche nel protocollo
Presentiamo qui un protocollo che riduce al minimo gli artefatti nelle immagini dSTORM dei microtubuli e IFs nelle cellule gliali. Gli artefatti possono essere creati in ogni fase della preparazione del campione e la formazione immagine: fissazione, blocco, immunolabeling, deriva durante l'acquisizione, non ottimale lampeggiante condizioni23. Elenchiamo qui di seguito le fasi più critiche.
Pulizia...

I filamenti intermedi citoplasmatici (IFs) sono 10 nm di diametro omo - o eteropolimeri di un sottoinsieme specifico del tipo di cella di proteine se. IFs partecipare a una vasta gamma di funzioni cellulari quali risposte di motilità, proliferazione e lo stress delle cellule. Loro ruolo chiave è evidenziato dal fatto che più di 90 malattie umane sono direttamente causati da mutazioni in proteine se; per esempio, cambiamenti nella composizione se accompagna la crescita del tumore e la diffusione di1,2,3. Vi è crescente evidenza che i tre sistemi di citoscheletro lavorano in collaborazione per controllo funzioni cellulari quali la polarizzazione della cellula, divisione e migrazione2,3. Poiché non vi è un accoppiamento stretto tra architettura spaziale e funzioni, è fondamentale ottenere approfondimenti l'organizzazione strutturale del se con altri filamenti e capire meglio il cross-talk del citoscheletro. Questo articolo fornisce un protocollo per eseguire il Super-risoluzione tecnica dual-color dSTORM (diretto stocastico microscopia ottica a ricostruzione)4 e come utilizzarlo per studiare l'interazione tra se e i microtubuli in fisso, coltivate cellule in 2 dimensioni (2D).
Diverse tecniche di Super-risoluzione sono state sviluppate nel corso degli ultimi dieci anni e là scoperte furono all'origine del premio Nobel in chimica nel 20145. Tra tutte queste tecniche si trova i metodi basati su localizzazione singola molecola come PALM6 (Photo-Activated localizzazione microscopia) che utilizza proteine fluorescenti fotomodulabili, tempesta7 con coppie di fluorofori o dSTORM4 con fluorofori convenzionali. Tutti questi metodi sono basati sullo stesso principio che consiste di (i) l'interruttore della maggior parte dei reporter fluorescente in un stato "spento" "di stato (ii) l'attivazione stocastica di un sottoinsieme di essi in una fluorescente (non fluorescente), al fine di localizzare loro posizione spaziale con precisione nanometrica e (iii) la ripetizione di questo processo al fine di attivare come molti sottoinsiemi di fluorofori come possibile. Un'immagine finale viene ricostruita utilizzando tutte le localizzazioni delle molecole attivate, fornendo una risoluzione laterale fino a ~ 20-40 nm. Diversi sistemi ottici commercializzati permettendo PALM/STORM sono ora disponibili per i biologi per esperimenti di routine. Qui, uno di questi sistemi è stato usato per studiare l'associazione strutturale dei microtubuli e IFs. Tra tutti i singola molecola basati su localizzazione metodi, la tecnica di doppio-colore dSTORM è stata selezionata, perché è adatto per osservare regioni lamellare molto sottile (< 1 µm) delle cellule aderenti e può fornire un significativo miglioramento della risoluzione dell'immagine con investimento minimo di tempo e denaro. Infatti, dSTORM è una tecnica molto comoda e versatile che è compatibile con i coloranti organici standard abitualmente utilizzati per la colorazione cellulare e immunofluorescenza.
Mentre un colore dSTORM immagini sono relativamente semplici da ottenere utilizzando il fluoroforo Alexa6478, dSTORM doppio colore richiede per ottimizzare le condizioni sperimentali, in modo che due coloranti possono lampeggiare correttamente nel buffer selezionate, soprattutto quando c'è limitato potere del laser. Eccellente documenti sono già disponibili sui metodi per impostare la pagina di formazione immagine di multi-colore con dSTORM9,10,11,12,13, e questi documenti spiegano in dettaglio le possibili fonti di artefatti e risoluzione dell'immagine degradata e come superarli. In questo articolo, le condizioni sperimentali ottimali in termini di cellule fissazione, immunostaining, preparazione del campione, sono descritti al fine di acquisire immagini di fitte reti di IF citoplasmatici e microtubuli in imaging acquisizione e ricostruzione dell'immagine cellule gliali con dual-color dSTORM. Brevemente, il metodo di estrazione/fissazione descritto in Chazeau et al12 è stato adattato alle cellule gliali e utilizzato con un passaggio di post-fissazione, concentrazione di anticorpi ottimizzata, un buffer di tempesta con 10mm MEA descritto in Dempsey9 et al., che era risultati ottimali per la sperimentale messa a punto e il tipo di campione.
Cellule gliali esprimono principalmente tre tipi di proteine se: il vimentin, nestina e GFAP (proteina fibrillare acida). Queste tre proteine sono state indicate per co-polimerizzare in astrocytes14. Precedentemente abbiamo mostrato usando microscopia di Super-risoluzione strutturato illuminazione (SR SIM) che queste tre proteine se possono essere trovate nel singolo filamento di se stesso e consentono di visualizzare simile distribuzione e dinamica in cellule gliali 15. Dovuto le somiglianze tra le tre proteine di se, vimentin macchiatura è stata usata come reporter per l'intera rete di se. Utilizzando dSTORM, siamo riusciti a risolvere come fasci di forma se lungo i microtubuli, che non era possibile con la diffrazione limitata microscopia tecniche15. Queste osservazioni possono aiutare a comprendere come il vimentin IFs può microtubuli modello e regolare la loro traiettoria di crescita, promuovendo il mantenimento di un asse di polarità durante la migrazione di cellule16. Immagini di Super-risoluzione fornito informazioni chiave sull'interazione reciproca dei due sottosistemi del citoscheletro e portato approfondire il legame tra associazione spaziale e funzione locale che potrebbe essere il tipo di cella specifici17. In generale, dSTORM dual-color consente di studiare il crosstalk tra elementi del citoscheletro o altri tipi di organelli, condizione che immunostaining buone condizioni sono raggiunti in termini di densità e specificità. Questa tecnica sarà utile per caratterizzare meglio i cambiamenti di citoscheletro osservati durante astrogliosis e nel glioblastoma, il tumore più comune e più maligni del sistema nervoso centrale, dove l'espressione di proteine se è alterato 18 ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>Terreni essenziali minimi (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>aminoacido non essenziale</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>coltura cellulare 1/100e</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>coltura cellulare 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig; tal Siero Bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>coltura cellulare 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>vetrino coprioggetti per colture cellulari</td></tr><tr><td>18 mm n&deg; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>coprioggetti</td></tr>, <tr><td>soluzione di paraformaldeide (PFA),</td><td>Sigma</td><td>F8775</td>, <td>fissazione cellulare,</td></tr><tr><td>glutaraldeide,</td><td>Sigma</td><td>G5882</td>, <td>fissazione cellulare</td></tr>, <tr><td>tritone X100</td>, <td>Sigma</td><td>T9284</td>, <td>tensioattivo non ionico. Utilizzato per la fissazione cellulare,</td></tr><tr><td>boroidruro di sodio (NaBH4),</td> <td>Sigma</td><td>452904-25ML</td>, <td>fissazione cellulare</td></tr>, <tr><td>passivazione del campione BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td>, <td>3% in PBS,</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-vimentina (V9), prodotto nel topo</td>, anticorpi <td>primari Sigma</td><td>V6630</td>, <td>anticorpi primari</td></tr><tr><td>anti-alfa tubulina di ratto</td>, <td>Biorad</td><td>MCA77G</td>, <td>anticorpi primari</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-ratto di capra IgG (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Fisher scientific</td><td>10635923</td><td>anticorpi secondari anti-topo</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anticorpo secondario, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher scientific</td><td>10226162</td><td>anticorpi secondari</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0,1 &; m, blu fluorescente/verde/arancione/rosso scuro</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>perline fluorescenti</td></tr><tr><td>Camera magnetica Camlide</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>portacampioni magnetico, volume massimo 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cisteamina (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>per il tampone lampeggiante</td></tr><tr><td>glucosio ossidasi da Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>per il tampone</td></tr> <tr>lampeggiante<td>glucosio</td><td>Sigma</td><td></td><td>per il tampone lampeggiante</td></tr><tr><td>catalasi da fegato bovino</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>per il tampone lampeggiante</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>per il tampone lampeggiante</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry portavetrini</td><td>coprioggetti Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>pulitore ad ultrasuoni</td> per film di paraffina<td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>pulitore al plasma</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

i filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Il citoscheletro, composto di microfilamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi (IF), svolge un ruolo chiave nel controllo della forma delle cellule, la polarità e la motilità. L'organizzazione delle reti di actina e dei microtubuli è stato studiato estesamente, ma quella di IFs non è ancora pienamente caratterizzato. IFs hanno un diametro medio di 10 nm e forma una rete che si estende in tutto il citoplasma delle cellule. Sono fisicamente associate con l'actina e i microtubuli attraverso motori molecolari e linker del citoscheletro. Questa stretta associazione è al centro dei meccanismi normativi che garantiscono la regolazione coordinata delle tre reti del citoscheletro necessari per la maggior parte delle funzioni delle cellule. È pertanto fondamentale per visualizzare IFs da solo e anche insieme a ciascuna delle altre reti del citoscheletro. Tuttavia, se le reti sono estremamente dense nella maggior parte dei tipi di cellule, soprattutto nelle cellule gliali, che rende molto difficile da raggiungere con microscopia di fluorescenza standard la sua risoluzione (risoluzione di ~ 250 laterale nm). Microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) è una tecnica che permette un guadagno nella risoluzione laterale di un ordine di grandezza. Qui, indichiamo che laterale dSTORM risoluzione è sufficiente per risolvere l'organizzazione densa delle reti se e, in particolare, dei pacchi di se che circondano i microtubuli. Tale stretta associazione è probabile che partecipano alla regolazione coordinata di queste due reti e maggio, spiegare come modello IFs vimentin e stabilizzare la organizzazione dei microtubuli, nonché potrebbe influenzare il traffico vescicolare dipendente dei microtubuli. Più in generale, vi mostriamo come l'osservazione di due componenti citoscheletriche con tecnica dual-color dSTORM porta nuova comprensione nella loro reciproca interazione.

Un microscopio dotato di 50 mW 405 nm e laser a stato solido da 100 mW 488, 561 e 642 nm, un EMCCD 512x512 fotocamera, un alpha Plan Apo 100 X / 1,46 obiettivo e Band Pass 570-650 / 655 emissione filtri passa-lungo è stato usato per i risultati rappresentativi presentati di seguito.
Figura 1A fornisce un esempio di molecola densità e segnale / rumore che deve essere utilizzato durante l'acquisizione...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di dare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione per acquisizione di immagini e la ricostruzione al fine di eseguire immagini dSTORM 2D doppio colore dei microtubuli e filamenti intermedi in celle fisse

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di creare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione all'acquisizione e ricostruzione delle immagini al fine di eseguire l'imaging D-STORM bicolore 2D di microtubuli e filamenti intermedi in cellule fisse. Questo metodo può aiutare a caratterizzare le interazioni fisiche tra reti citoscheletriche dense e complesse come filamenti intermedi e microtubuli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione di strutture cellulari, che non vengono risolte con la microscopia a fluorescenza convenzionale.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il controllo della preparazione del campione e l'acquisizione dei dati di collegamento delle vesti è fondamentale per limitare la generazione di artefatti. Dopo aver coltivato le cellule U373 secondo il protocollo di testo, fissare le cellule utilizzando prima il PBS per lavarle una volta. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro per pozzetto di soluzione di fissaggio per l'estrazione preriscaldata.Incubare le cellule a temperatura ambiente per 60 secondi. Quindi rimuovere la soluzione e aggiungere un millilitro per

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Biologia

Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Le informazioni spazio-temporali sulle proteine dinamiche all'interno delle cellule vive sono fondamentali per comprendere la biologia. Un tipo di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata in 3D veloce (f3D-SIM) rivela informazioni uniche sull'anello Z citocinetico nei batteri: sia il suo aspetto simile a una perlina che la rapida dinamica di FtsZ all'interno dell'anello.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Presentiamo un protocollo di applicazione del interferometrica fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM), un metodo di risoluzione di microscopia eccellente 3-dimensional localizzazione singola molecola, per l'imaging del citoscheletro actina in cellule di mammifero aderenti. Questo approccio permette la visualizzazione basata sulla luce delle caratteristiche strutturali nanoscala che altrimenti rimarrebbero irrisolti da convenzionale microscopia ottica di diffrazione limitata.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Questo protocollo è una guida per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza su un microscopio a fluorescenza standard per l'imaging senza etichette, ad alto contrasto e ad alta velocità dei microtubuli utilizzando analisi in vitro.

Implementazione della microscopia di riflessione delle interferenze per l'imaging ad alta velocità e senza etichetta dei microtubuli

La microscopia ottica a super-risoluzione basata su chip è un nuovo approccio alla microscopia a fluorescenza e offre vantaggi in termini di efficacia in termini di costi e produttività. Qui vengono mostrati i protocolli per la preparazione e l'imaging dei chip per la microscopia TIRF e la microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione.

Fluorescenza della riflessione interna totale ad alto consumo e microscopia della ricostruzione ottica stocastica diretta utilizzando un chip fotonico

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

La microscopia dinamica differenziale (DDM) combina caratteristiche di diffusione dinamica della luce e microscopia. Qui, viene presentato il processo di utilizzo del DDM per caratterizzare le reti citoscheletriche ricostituite quantificando la dinamica subdiffusiva e ingabbiata delle particelle nelle reti di vimentine e il movimento balistico dei compositi actina-microtubulo attivi guidati dalla miosina.

Quantificazione della dinamica del citoscheletro mediante microscopia dinamica differenziale

Questo protocollo descrive in dettaglio come costruire un microscopio a fluorescenza a singolo obiettivo e il suo utilizzo per la visualizzazione di reti di citoscheletro.

Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri

Scopri la microscopia dSTORM bidimensionale per visualizzare microtubuli e filamenti intermedi in cellule U373 fissate. Questo metodo super-risoluzione consente di caratterizzare le interazioni del citoscheletro con dettaglio nanometrico.

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

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