I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di creare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione all'acquisizione e ricostruzione delle immagini al fine di eseguire l'imaging D-STORM bicolore 2D di microtubuli e filamenti intermedi in cellule fisse. Questo metodo può aiutare a caratterizzare le interazioni fisiche tra reti citoscheletriche dense e complesse come filamenti intermedi e microtubuli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione di strutture cellulari, che non vengono risolte con la microscopia a fluorescenza convenzionale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il controllo della preparazione del campione e l'acquisizione dei dati di collegamento delle vesti è fondamentale per limitare la generazione di artefatti. Dopo aver coltivato le cellule U373 secondo il protocollo di testo, fissare le cellule utilizzando prima il PBS per lavarle una volta. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro per pozzetto di soluzione di fissaggio per l'estrazione preriscaldata.

Incubare le cellule a temperatura ambiente per 60 secondi. Quindi rimuovere la soluzione e aggiungere un millilitro per pozzetto di PFA al 4% appena preparato e preriscaldato diluito nel tampone del citoscheletro. Riposizionare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi rimuovere il PFA e aggiungere tre millilitri di PBS per pozzetto. Utilizzare PBS per lavare le celle due volte. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 10 millimolari di boroidruro di sodio diluiti in PBS appena preparati per spegnere l'autofluorescenza dalla glutaraldeide.

Incubare le cellule a temperatura ambiente per sette minuti e trasferire il boroidruro di sodio riciclato in un contenitore specifico. Usa il PBS per lavare i pozzetti tre volte per cinque minuti ciascuno. Quindi rimuovere il PSB e aggiungere il 5% di BSA in PBS come soluzione bloccante.

Dopo l'immunocolorazione dei campioni e la preparazione delle soluzioni in tamponi secondo il protocollo di testo, montare il vetrino coprioggetti contenente le cellule marcate su un portacampioni magnetico. E aggiungi il tampone di imaging per riempire completamente la camera. Applicare il coperchio e assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il tampone di imaging e il coperchio.

Utilizzando etanolo assoluto, pulire il fondo del campione e verificare che non vi siano perdite. Quindi, se necessario, utilizzare del grasso per sigillare correttamente la tenuta del campione. Per eseguire l'imaging, accendere il microscopio e il software di acquisizione.

Impostare i parametri di acquisizione secondo il protocollo di testo, utilizzando l'obiettivo NA 1.46 da 100 volte, l'obiettivo Optivar da 1,6 volte e la modalità TIRF UHP. Crea una traccia 647 per visualizzare i filamenti di vimentina etichettati con Alexa Fluor 647. Selezionate le linee laser a 405 e 642 nanometri e il filtro di emissione LP 655.

Quindi, crea una traccia 555 per visualizzare i microtubuli etichettati con Alexa Fluor 555. Selezionare le linee laser a 561, 488 e 405 nanometri per visualizzare i fluorofori e il filtro di emissione BP da 570 a 650. Quindi, aggiungere olio all'obiettivo e posizionare il campione sull'obiettivo.

Quindi, seleziona la scheda di localizzazione e apri l'otturatore della lampada a fluorescenza. Trova la messa a fuoco e usa l'oculare per cercare le cellule da visualizzare. Quindi utilizzare il joystick per posizionare le celle al centro del campo.

Fare clic sulla scheda di acquisizione per tornare alla modalità di acquisizione. Quindi selezionare la traccia 647 e impostare la potenza del laser 642 allo 0,2% e la potenza del laser 405 al suo valore minimo. Impostare il tempo di esposizione su 50 millisecondi e il guadagno su 50.

Quindi scegli la modalità di acquisizione continua per osservare la cella sullo schermo. Assicurarsi che ci sia almeno un cordone fluorescente nel campo visivo. Utilizzare una modalità di scalabilità automatica per il display e regolare la messa a fuoco.

Quindi, scatta un'immagine di epifluorescenza ad ampio campo della rete di vimentina facendo clic su snap e salva l'immagine. Per verificare l'illuminazione TIRF, cliccare su TIRF, premere continuamente, regolare i parametri di acquisizione in modo da avere un campo di illuminazione omogeneo. Quindi premere snap e salvare l'immagine.

Controlla la traccia 555. Deseleziona la traccia 647 e seleziona la traccia 555. Prendi un'immagine in epifluorescenza della rete di microtubuli e salvala.

Quindi prendi un'immagine TIRF e salvala. Ora, controlla la traccia 647. Deseleziona la traccia 555 e seleziona la traccia 647.

Impostare il guadagno su zero e il tempo di esposizione su 10 millisecondi. Quindi premere continuamente. Imposta la potenza del laser a 642 nanometri al 100% per pompare la maggior parte dei coloranti Alexa 647 allo stato scuro.

Una volta che i fluorofori iniziano a lampeggiare, aumentare l'esposizione a 15 millisecondi e il guadagno a 300. Utilizzare la modalità indicatore di portata per verificare che i segnali di una singola molecola non saturino la fotocamera come indicato dal colore rosso. In tal caso, diminuire il guadagno fino a quando la saturazione non scompare.

Le perle rimarranno sature all'inizio dell'acquisizione. Premere stop per interrompere l'osservazione della cella. Espandi lo strumento di elaborazione online e fai clic su PALM di elaborazione online per visualizzare l'immagine STORM durante l'acquisizione.

Usa nove per la dimensione della maschera di picco e sei per l'intensità di picco del rumore. Ora, premi avvia acquisizione. Durante l'acquisizione, se necessario, rifocalizzare la cellula.

Regolare il tempo di esposizione ed eventualmente accendere la linea laser a 405 nanometri partendo dallo 0,001% per mantenere una densità media di fluorofori con una distanza minima di un micrometro tra le singole molecole. Assicurarsi che il picco di precisione di localizzazione sull'istogramma sotto l'immagine ricostruita sia centrato intorno o al di sotto di 10 nanometri. Premere stop per terminare il filmato quando sono state raggiunte più di un milione di localizzazioni.

Salva i dati grezzi dall'acquisizione STORM con il formato CZI. Quindi, nello strumento canali, selezionare la traccia 555, deselezionare la traccia 647 e selezionare la traccia 555. Quindi, premere il pulsante continuo.

Impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi e il guadagno su zero. Quindi imposta entrambi i laser 488 e 561 al 100% per pompare i coloranti Alexa 555 allo stato scuro. Utilizzare la modalità di illuminazione HILO.

Una volta esauriti i fluorofori, premere stop. Impostare il guadagno su 250 e diminuire il laser 488 al 50%Utilizzare l'indicatore di portata per verificare che le singole molecole non saturino la fotocamera. In tal caso, diminuire il guadagno.

Ora, premi avvia acquisizione. Durante l'acquisizione, aumentare gradualmente il guadagno fino a raggiungere il limite di saturazione. Aumenta passo dopo passo la potenza del laser a 405 nanometri per attivare le molecole e raggiungere una densità media nel campo visivo.

Diminuire la potenza del laser a 488 nanometri al 30% quando il laser 405 è di circa il 15%, quindi diminuire gradualmente il 488 aumentando la potenza del laser 405 in modo da mantenere il lampeggio delle molecole il più veloce possibile e con una densità media. La linea laser 488 accoppiata con il laser di eccitazione 561 alla massima intensità aumenta sia la velocità di accensione che quella di spegnimento dei fluorofori, mentre la linea laser 405 aumenta solo la velocità di accensione. Interrompere l'acquisizione quando sono state raggiunte 500.000 localizzazioni o più o quando non ci sono più molecole che lampeggiano.

Quindi salvare i dati grezzi dall'acquisizione STORM con il formato CZI. Per eseguire la ricostruzione dell'immagine utilizzando lo strumento PAL-Drift, scegliere il tipo di correzione basata sul modello con segmenti automatici con una dimensione massima di otto. Premere applica più volte di seguito fino a correggere la deriva.

Questa correzione basata su modelli applica un algoritmo basato sull'analisi della correlazione incrociata, che corregge la deriva. Utilizzando gli strumenti del filtro PAL, è possibile migliorare l'aspetto dell'immagine STORM selezionando solo le molecole meglio localizzate. Ad esempio, limitare la precisione di localizzazione a 30 nanometri e la PSF a 120-180 nanometri.

Con lo strumento PAL-Render, utilizza una risoluzione in pixel di cinque o 10 nanometri e parametri secondo il protocollo di testo. Selezionate l'intervallo dinamico automatico di rendering HR con un valore del 95% e l'intervallo dinamico automatico di rendering SWF con un valore del 90%. Quindi seleziona la qualità di rendering migliore.

Nel menu PALM della scheda di elaborazione, selezionare PALM convert. Premere seleziona e quindi applica. Infine, salva l'immagine creata con il formato LSM e non CZI.

Questa figura mostra un tipico esempio di immagine D-STORM di filamenti di vimentina immuno-marcati con Alexa 647. L'aumento della risoluzione può essere chiaramente osservato confrontandolo con l'immagine acquisita con un microscopio standard a campo largo. I profili di intensità della fluorescenza presentati in questo grafico mostrano che l'imaging al microscopio a super risoluzione consente la risoluzione dei fasci di vimentina.

La risoluzione D-STORM è sufficiente per contare il numero di filamenti presenti nei fasci. Qui è mostrato un tipico esempio di imaging D-STORM a due colori di reti di vimentina e microtubuli immuno-marcate rispettivamente con Alexa 647 e Alexa 555. Le buone immagini di vimentina dovrebbero avere almeno 5.000 localizzazioni per micrometro quadrato e 2.500 per micrometro quadrato per i microtubuli.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante adattare i metodi di fissazione e parametrizzazione alla proteina che verrebbe visualizzata. Ad esempio, la fissazione con la sola glutaraldeide dà scarsi risultati per i filamenti intermedi, ma è la migliore per la fissazione dei microtubuli.

È importante ricordare di utilizzare campioni e soluzioni appena preparati, in particolare MEA, il cui pH deve essere regolato con attenzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la morfologia delle strutture cellulari nanoscopiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e la ricostruzione di immagini D-STORM 2D bicolore di filamenti intermedi e microtubuli.

Non dimenticare che lavorare con alcune soluzioni, in particolare PFA, NABH4 può essere estremamente pericoloso e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti, lavorare sotto il cofano chimico e utilizzare contenitori specifici.