Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

L'obiettivo generale di questa procedura 3D-PAGE è quello di separare i complessi proteici e ribonucleoproteici dalla linfa di Brassica napus ploem, insieme all'identificazione dei rispettivi acidi nucleici e componenti proteici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biochimica e fisiologia vegetale. Ad esempio, è possibile analizzare la composizione dei complessi floematici sotto stress.

Il vantaggio principale della tecnica è che la linfa floematica pura può essere raccolta e gli acidi nucleici, così come i componenti proteici, possono essere analizzati contemporaneamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni delle proteine proteiche e degli acidi nucleici proteici all'interno del sistema floematico della colza, può essere applicato anche all'analisi floematica di altre piante come cucurbitacee, lupini e yucca. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di identificare i partner di interazione tra proteine e RNA per specifiche proteine del floema.

Per prima cosa, pungere più volte lo stelo infiorescente di una pianta di B.napus di otto settimane utilizzando un ago ipodermico da 0,8 millimetri. Forare diversi altri steli infiorescenti sulla stessa pianta e su altre piante per ottenere abbastanza linfa floematica. Pulisci la prima goccia da ogni sito ferito con carta da filtro.

Dopo aver rimosso le prime gocce, utilizzare una pipetta per raccogliere le gocce rimanenti. E trasferirli in una provetta di reazione conica da 1,5 millilitri pre-raffreddata. Quindi conservare l'essudato raccolto a meno 20 gradi Celsius utilizzando un sistema di raffreddamento senza ghiaccio.

Continuare a raccogliere le gocce fino a quando non si osserva più la formazione di gocce, ma non più di un'ora. Successivamente, aggiungere il campione di floema a un concentratore centrifugo con un peso molecolare tagliato di 10.000 dalton e concentrare a circa 1/6 del volume iniziale. Quindi, centrifugare il campione concentrato a quattro gradi Celsius e 20.000 g per almeno 15 minuti per rimuovere le particelle di polvere.

Per eseguire la PAGE nativa blu, assemblare la camera del gel. E aggiungi il tampone catodico blu scuro B alla metà e lava i pozzetti con il tampone catodico. Caricare da 20 a 30 microgrammi di campione proteico concentrato per pozzetto su un gel radiante Bis-Tris commerciale in almeno triplicato.

Riempire la camera con catodo e anodo tampone e far funzionare il gel a quattro gradi Celsius e 150 volt fino a quando il campione non supera 1/3 del gel, il che richiede dai 20 ai 30 minuti. Mettere in pausa la corsa e scambiare il tampone catodico blu scuro B con il tampone catodico blu chiaro B 1/10. Riavvia la corsa e continua fino a quando la parte anteriore blu inizia a eluire dal gel, il che richiede dai 120 ai 180 minuti.

Ritagliare un'intera corsia di gel dal gel blu nativo, quindi trasferirla su una membrana di nylon mediante tamponamento semi-asciutto e segnare i bordi superiore e inferiore del gel sulla membrana con una matita. Dopo l'asciugatura, lavare la membrana con acqua trattata con DEPC e posizionarla tra due pezzi di carta da filtro ad asciugare. Successivamente, eseguire la reticolazione UV della membrana tamponata con un'energia applicata di 120.000 micro joule per centimetro quadrato.

Ora, pre-ibridare la membrana reticolata UV con sei millilitri di tampone di ibridazione per 60 minuti a 68 gradi Celsius in un forno di ibridazione. Aggiungere alla membrana un ulteriore millilitro di tampone di ibridazione contenente quattro microlitri di sonde biotinilate a 3 prime. Quindi, incubare la membrana con la sonda durante la notte mentre si raffredda il forno di ibridazione da 68 a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, lavare la membrana con un tampone contenente 2x SSC e 0,1% SDS per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere le sonde legate in modo non specifico. Eseguire il rilevamento delle sonde biotinilate a 3 prime sulla membrana con un coniugato HRP di streptavidina e luminol come substrato della perossidasi di rafano, determinando una reazione chemiluminescente sensibile. Accise singole bande dal gel nativo blu.

Combina bande di campioni eseguiti in corsie parallele in una provetta di reazione conica da 1,5 millilitri per ottenere un'ulteriore concentrazione di proteine complesse. Per preparare un gel di urea Tris-Tricina al 12%, versare 10 millilitri di soluzione di gel A tra due lastre di vetro e sovrapporre con isopropanolo. Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'isopropanolo, aggiungere due o tre millilitri di soluzione di gel B al gel e inserire un pettine a 10 pozzetti.

Per l'equilibratura dei pezzi di gel asportati, aggiungere un millilitro di tampone campione 2x SDS nella provetta di reazione. Dopo aver incubato il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, riscaldare in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius per circa un minuto. Quindi incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti.

Successivamente, impilare diversi pezzi di gel equilibrati che rappresentano lo stesso complesso in un'unica tasca di gel. Dopo aver assemblato la camera del gel, eseguire l'elettroforesi utilizzando tamponi anodici e catodici a 150 volt per 45-60 minuti. Al termine, asportare l'intera corsia del gel.

Incubare la corsia di gel tagliata per 20 minuti in tampone acido. Quindi, equilibrare in Tris-HCL da 125 millimolari a pH 6,8 per altri 20 minuti. Versare una soluzione di gel separatore SDS al 15% secondo lanely.

Una volta che il gel si è solidificato, rimuovere l'isopropanolo, aggiungere tre millilitri di una soluzione di gel impilabile al 4% e inserire l'apposito pettine per gel IPG. Dopo la solidificazione, trasferire la corsia del gel equilibrante sul gel SDS e coprire il gel con lo 0,5% di agarosio in 1x tampone di corsa SDS integrato con una traccia di blu di bromofenolo. Dopo aver assemblato la camera del gel, far funzionare il gel a 150 volt per 60 minuti.

Al termine, colorare il gel con la soluzione colloidale di Kumasi per la successiva analisi spettrometrica di massa. Infine, analizzare le macchie proteiche visibili utilizzando la spettrometria a tempo di volo a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice. Qui è raffigurato un risultato rappresentativo ottenuto da un campione di floema puro.

I campioni di floema non contaminato mostrano una banda visibile per l'età della tioredossina, mentre non si osserva alcun segnale per RuBisCO e la proteina del rivestimento pollinico. Almeno quattro bande principali del complesso proteico diventano visibili dopo BN PAGE della linfa del floema di B.napus. Concentrazioni troppo basse o troppo alte di linfa floematica non consentono una netta separazione dei complessi.

La separazione ad alta risoluzione è osservata in 3D PAGE a causa dei diversi comportamenti di migrazione delle proteine nei gel urea e SDS-PAGE. Tipicamente, le proteine appartenenti a un singolo complesso saranno visibili come una linea diagonale attraverso il gel. Le proteine al di sopra di questa linea hanno una maggiore idrofobicità, mentre le proteine al di sotto della linea sono più idrofile.

Il northern blotting di BN mostra che uno specifico tRNA è presente solo in un complesso specifico. L'analisi spettrometrica di massa ha mostrato che questo complesso contiene principalmente tRNA ligasi, il che conferma l'attività di legame del tRNA riscontrata dal Northern blotting del BN. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare guanti e un camice da laboratorio per ridurre al minimo la contaminazione da carotene che ostacolerà l'analisi spettrometrica di massa. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come zimogrammi e saggi enzimatici con linfa floematica raccolta per rispondere a ulteriori domande, come studi complessi di attività e inibizione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scienza delle piante per esplorare complessi multi-subunità in campioni di floema di diverse specie vegetali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la linfa del floema dalle piante di Brassica napus e come isolare e analizzare le proteine proteiche e i complessi di acidi nucleici proteici. Non dimenticare che lavorare con SDS, acrilammide e TMET può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto il cofano con guanti e camice da laboratorio.