Name: Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Scopri il campionamento del floema da Brassica napus per l'analisi 3D-PAGE di proteine e complessi ribonucleoproteici. Questo metodo consente l'identificazione simultanea di componenti proteici e acidi nucleici.

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Ringraziamo Jennifer Deke e Urszula Zarzenska per il loro sostegno scientifico. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione di integrazione di carriera (CIG, 0734 PCIG14-GA-2013-63) dalla Commissione europea nell'ambito del 7 ° programma quadro, la sovvenzione LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) e della concessione di DFG (DFG KE 856_6-1) assegnato a JK.

1. il campionamento e la preparazione di sap floema da b. napus piante 4,8,20
<ol><li>Per sap floema di campionamento, utilizzare ben irrigato 8-settimana-vecchio che visualizza solo iniziale fioritura per evitare contaminazioni di polline di piante di b. napus .</li>
	<li>Utilizzare un ago ipodermico (Ø 0,8 mm) e punctate infiorescenza staminali diverse volte. Ripetere a numerosi altri fusti infiorescenza e su altre piante per ottenere abbastanza sap floema (Figura 2a). Nota: Per analisi complesse, si consiglia di iniziare con almeno 600 µ l di sap del floema. 4 a 5 piante produrranno tra 200 e 700 µ l di sap del floema.</li>
	<li>Eliminare la prima goccia dai siti feriti con carta da filtro. Queste gocce principalmente contengono materiale altamente contaminato dal circostante tessuto danneggiato e devono essere scartati.</li>
	<li>Raccogliere le gocce seguenti pipettando e memorizzare l'essudato raccolto in una provetta di reazione pre-refrigerati conico 1,5 mL a-20 ° C utilizzando un sistema di raffreddamento libero dai ghiacci.</li>
	<li>Continua a raccogliere fino a quando nessun ulteriore formazione di goccia è osservabile, ma non più di 1 h. Questa procedura può essere ripetuta dopo due giorni senza perdita significativa di sap floema raccolti. Nota: La linfa del floema raccolti può essere usata immediatamente o conservata a-80 ° C per le analisi future. Per deposito di-80 ° C,-congelamento la provetta di reazione in azoto liquido.</li>
	<li>Concentrare il campione di floema per circa 1/6th del volume iniziale usando concentratori centrifughi con un peso molecolare tagliato fuori (MWCO) di 10.000 Dalton (Da). Centrifugare il campione concentrato a 4 ° C e 20.000 x g per almeno 15 min rimuovere le particelle di polvere. Nota: Concentrazione di sap floema non comporta una perdita significativa di proteine.</li>
	<li>Per la successiva analisi complessa, procedere con il passaggio 3.1.</li>
</ol>2. controllo della purezza floema sap mediante reverse transcriptase PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>Isolare il RNA totale da sap floema utilizzando un metodo di estrazione di RNA standard per materiale liquido (ad es. estrazione TRIzol o fenolo-cloroformio seguita da precipitazione di isopropanolo dalla fase acquosa ed etanolo lavatrice passi secondo il protocollo del produttore). Attenzione: Fenolo-cloroformio è tossico. Lavorare sotto una cappa con indumenti protettivi appropriati. il RNA estratto può essere conservato in etanolo a-80 ° C per fino a sei mesi.</li>
	<li>Rimuovere la contaminazione del DNA tramite digestione con dnasi I (1 u / µ g) per 45 min a 37 ° C e inattivare l'enzima con l'aggiunta di EDTA a una concentrazione finale di 5 mM e incubare il campione a 75 ° C per 10 min.</li>
	<li>Per ottenere RNA puro, purificare e concentrare il campione da un altro passaggio di purificazione (per esempio usando i kit di pulitura di RNA, secondo le istruzioni del produttore).</li>
	<li>Eseguire un reverse transcriptase PCR (RT-PCR) per la sintesi di cDNA con un kit di sintesi di cDNA utilizzando 150 ng di RNA puro come descritto dal produttore di protocollo. Nota: Il cDNA può essere conservato a-20 ° C fino ulteriore uso.</li>
	<li>Utilizzare 5 µ l di cDNA come modello per una reazione di PCR standard come specificato dal fabbricante, per amplificare vano specifici trascritti e verifica tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi. Confermare la purezza dei campioni del floema utilizzando ad esempio gli iniettori per subunità piccola rubisco, thioredoxin h e la proteina del cappotto di polline (Figura 1b, tabella 1).</li>
</ol>3. blu nativo pagina 4,25,26,31
<ol><li>Utilizzare entrambi self-colata gel gradiente nativo come descritto altrove27 o commerciale gel gradiente Bis-Tris.</li>
	<li>Carico 20-30 µ g del campione concentrato della proteina per pozzetto sul gel in almeno triplicates.</li>
	<li>Esegua il gel a 4 ° C e 150 V con catodo blu scuro buffer B e buffer di anodo (tabella 2) fino a quando il campione passato 1/3rd del gel (ca. 20-30 min, Figura 3a). Nota: Per macchiarsi nordico, una corsia singola gel è sufficiente, mentre per l'analisi della composizione proteica di pagina 3D e spettrometria di massa che si consiglia di combinare la stessa banda da fino a dieci corsie di gel a concentrarsi meno abbondanti proteine.</li>
	<li>Mettere in pausa l'esecuzione e cambio catodo blu scuro buffer B con luce blu catodo tampone B/10 (tabella 2) e continuare l'esecuzione. Finire il gel eseguito all'avvio parte anteriore blu eluire fuori il gel (ca. 120-180 min, Figura 3a). Nota: Il finito Natale blu del gel può essere memorizzato a 4 ° C per almeno una settimana. Conservazione prolungata può portare a diffondere bande e dovrebbe essere evitata. Scuro blu tampone B può essere riutilizzato.</li>
</ol>4. facoltativo: Rilevazione del RNA usando blu nativo northern blotting 4
<ol><li>Tagliare le fasce distinte o usare la corsia di gel tutto dal blu gel nativo e trasferirli su una membrana di nylon di semi-secco macchiare a 3,5 mA/cm2 per 60 min e segnano il confine di gel superiore e inferiore con una matita sulla membrana (Figura 4a).</li>
	<li>Dopo blotting, lavare la membrana con acqua trattata con DEPC e asciugare tra due fogli di carta filtro.</li>
	<li>Eseguire UV-reticolazione della membrana blotted con 120.000 µ j/cm2 (85 s se utilizza il reticolante in Tabella materiali).</li>
	<li>Pre-ibridare la membrana con 6 mL di tampone di ibridazione (commerciale o self-made) per 60 min a 68 ° C in un forno di ibridazione (Figura 4a).</li>
	<li>Aggiungere un ulteriore 1 mL di tampone di ibridazione contenente 4 µ l di 3'-biotinylated sonde (100 nM).</li>
	<li>Incubare la membrana con la sonda in una notte, durante il raffreddamento del forno da 68 ° C a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare la membrana con tampone contenente SDS x SSC e 0,1% 2, per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere le sonde associati non specifico. Attenzione: SDS possono causare irritazioni. Lavorando con SDS e soluzioni contenenti SDS, indossare guanti e camice da laboratorio.</li>
	<li>Eseguire il rilevamento delle sonde 3'-biotinylated sulla membrana ad esempio con streptavidina-HRP-coniugato e luminol come substrato rafano perossidasi (HRP), provocando una reazione chemiluminescente sensibile (Figura 4a).</li>
</ol>5. seconda dimensione: Tris-Tricine-urea pagina 4,28
<ol><li>Accise singole bande dal blu gel nativo. Combinare le bande da campioni eseguiti in corsie parallele per ottenere un'ulteriore concentrazione di proteine complesse (Figura 5). Nota: Asportati bande possono essere memorizzati in singole provette fino all'ulteriore utilizzo a 4 ° C.</li>
	<li>Versare un gel di Tris-Tricine-urea 12% (spessore di 1 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (larghezza x lunghezza)). Preparare 10 mL di soluzione di gel A per il gel di separazione (tabella 2), versare tra due lastre di vetro e overlay con isopropanolo. Rimuovere l'isopropanolo al termine della polimerizzazione e trasferire 4 mL di soluzione di gel B (tabella 2) per il gel d'impilamento sul gel e Inserisci che un 10 ben pettine. Attenzione: Non polimerizzate acrilamide può essere neurotossico e TEMED è nocivo se inalato. Sempre indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare sotto una cappa.</li>
	<li>Trasferire le bande di gel asportato in una provetta di reazione da 1,5 mL e aggiungere 1 mL di tampone del campione SDS di equilibramento dei pezzi gel (Figura 5, tabella 2): 2x.<ol>
<li>Incubare i campioni per 10 min a temperatura ambiente prima dell'ebollizione in un blocco di riscaldamento (95 ° C) o in un forno a microonde e incubare i campioni nuovamente a temperatura ambiente per ulteriori 15 minuti.</li>
		<li>Impilare diversi pezzi di gel equilibrato nello stesso complesso che rappresenta in un gel singola tasca.</li>
		<li>Eseguire l'elettroforesi con anodo e catodo in esecuzione buffer a 150 V per 45-60 min e asportare la corsia di gel tutto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la corsia di taglio per 20 min nel buffer acide (100 mM Tris, acido acetico 100 mM) ed equilibrare in 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 per un altro 20 min (Figura 5).</li>
</ol>6. terza dimensione: SDS-PAGE 4,32
<ol><li>Versare un 15% SDS che separa gel secondo Laemmli32 (spessore: 1,5 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (larghezza x lunghezza)) (tabella 2) e aggiungere un sottile strato di un 4% stacking gel sopra. Attenzione: SDS, acrilammide e TEMED sono tossiche e nocive. Lavorare sotto una cappa e indossare dispositivi di protezione individuale.</li>
	<li>Trasferire la corsia equilibrato gel sul gel SDS e coprire il gel con 0,5% (w/w) agarosio in 1x SDS completati con una traccia di blu di bromofenolo (Figura 5) tampone di corsa.</li>
	<li>Bollire il tampone di corsa con agarosio nel microonde previo caricamento su gel di SDS.</li>
	<li>Per l'esecuzione di un marcatore di proteina per stimare i pesi molecolari dei singoli componenti, inserire un pezzo di carta da filtro su un'estremità del gel fino all'agarosio solidificato o utilizzare un pettine speciale utilizzato in genere per IPG gel.</li>
	<li>Esegua il gel a 150 V per 60 min e macchia il gel con Coomassie colloidale, macchia d'argento o di qualsiasi altro metodo di colorazione adatto per la successiva analisi di spettrometria di massa.</li>
	<li>Analizzare le macchie visibili proteine mediante spettrometria di massa approcci come desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF) tempo di volo o spettrometria di massa LC-MS/MS. Nota: Si consiglia di utilizzare il Coomassie colloidale colorazione come già descritto33. Nelle nostre mani, anche meno abbondanti proteine può essere sufficientemente macchiato e consente un'analisi di spettrometria di massa con qualità ragionevole dei dati.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il floema è un comparto di grande interesse, poiché costituisce la via di trasporto principali per fotoassimilati ed è anche essenziale per la segnalazione a lunga distanza tra piante diverse parti9,20,34, 35. Oltre a piccole molecole, macromolecole come proteine ed RNA sono stati implicati con manutenzione del floema e segnalazione4,7,8. L'analisi della composizione del floema è limitato dall'accessibilità limitata ai campioni del floema nella maggior parte delle specie di piante. La tecnica del mandrino dell'insetto è ampiamente applicabile, ma sperimentalmente esigenti e si traduce in quantità molto piccole di floema campioni11. Una tecnica facile utilizzata per il campionamento del floema è EDTA-facilitato essudazione12. EDTA chelata ioni bivalenti come calcio e quindi impedisce la chiusura del setaccio piastre di P-proteine e callosio. È facile da usare, ma è soggetto a contaminazione da parte di cellule danneggiate e campioni vengono diluiti. Che riducono gli ioni bivalenti con EDTA potrebbe anche portare ad una rottura dei complessi esistenti. Tuttavia, esso consente il campionamento da una vasta gamma di specie tra cui l'impianto di modello di a. thaliana15. Essudazione spontanea di sap floema si verifica solo in un piccolo numero di specie di piante. È un metodo invasivo che coinvolge la ferita significativa di pianta tessuti10. Recentemente abbiamo stabilito b. napus come una specie di modello per studiare il trasporto a lunga percorrenza4,8,20. Qui, sap floema possono essere campionati da piccole incisioni, che riduce gli effetti pungenti e fonti di contaminazione.
Utilizzando tecniche di campionamento diverso, il proteoma dei campioni del floema da diverse specie vegetali è stato studiato in anni recenti7,8,17,36,37, 38,39. Per questi studi di proteomica, proteine sono state estratte e precipitate sotto condizioni di denaturazione e pertanto non consentono conclusioni sulla proteina/proteina e proteina: interazioni acido nucleico presentano in condizioni native. Sovrapposizione dosaggi e co-immunoprecipitazione (CoIP) hanno indicato che una ribonucleoproteina principale complessa potrebbe esistere in sap floema da zucca40, ma non è stato dimostrato che qualsiasi complessi macromolecolari esistono condizioni nativo all'interno del sistema del floema.
Blu PAGE nativo, introdotta da Schägger et al. 26, in combinazione con passaggi di elettroforesi su gel ad alta risoluzione successiva attivare la separazione dei singoli componenti dei complessi della proteina grande. Usando le analisi 3D-pagina di nativo b. napus essudato del floema, recentemente potremmo dimostrare che parecchi RNP complessi e ad alto peso molecolare della proteina: esistono nei campioni del floema e sono enzimaticamente attivo4. Metodi alternativi per isolare i complessi della proteina come pure RNP come cromatografia di esclusione di formato potrebbero esistere, ma non in termini di risoluzione rispetto ai BN-PAGE. Inoltre, per una ragionevole qualità della separazione complessi, matrici di dimensione esclusione colonna devono essere adattato secondo i pesi molecolari nel complesso complessi indagati. L'analisi di complessi di diverse dimensioni richiederà pertanto diversi tipi di colonne che è costosa e non è consentito come messa a fuoco ad alta potenza come una BN-PAGE.
Passaggi critici per analizzare complessi da b. napus comprendono la quantità totale di floema sap utilizzato come materiale di partenza. Almeno 600 µ l di campione del floema sono necessari e possono essere ottenuti da cinque piante ben irrigate. Per 3D-pagina e BN Macchiarsi nordico è necessario avviare il gel BN iniziale con una quantità sufficiente di campioni del floema. Per raggiungere questo obiettivo, i campioni del floema sono concentrati fino a 20 a 30 µ g di proteina possono essere caricati in ogni bene e almeno triplici copie dello stesso campione vengono eseguiti in parallelo. Concentrazioni troppo basse o troppo alte riducono la rilevazione dei complessi (Figura 3). Floema campioni devono essere raccolti in provette di reazione sul ghiaccio e devono essere conservati congelati per un uso successivo evitare fatturato e degradazione delle proteine. Inibitori della proteasi sono stati trovati in tutti i proteomi di floema analizzati, ma anche un proteasoma pienamente attiva è stata descritta nel floema delle b. napus4. Inoltre, volume e composizione dei campioni di floema dipendono il tempo-punto di campionamento e condizioni ambientali10. Pertanto si deve prestare attenzione a raccogliere allo stesso tempo del giorno in condizioni simili. Trattamenti (ad es. la siccità) possono ridurre la quantità di floema che possa essere raccolti. Per identificare singole proteine tramite spettrometria di massa, è obbligatorio limitare contaminazioni possibili cheratina di guanti da portare tutto il tempo. Cheratina porta a segnali addizionali durante l'analisi di massa spec e ostacola l'identificazione della proteina. Esecuzione della BN-pagina ad una tensione superiore o a temperatura ambiente può portare a riscaldamento del gel che potrebbero tradursi in smontaggio dei complessi fragile.
Il protocollo qui presentato è adatto per l'analisi dei complessi proteina/proteina. Mostriamo anche che può essere utilizzato per rilevare specifici RNA contenuto nei complessi in parallelo. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo recentemente introdotto un protocollo per i BN northern blotting4. RNAs sono inclini alla degradazione da contaminazioni di RNAsi. Per limitare tale degradazione DEPC-trattati, acqua deve essere utilizzato.
Principali limitazioni del metodo presentato includono la stima del peso molecolare di complessi proteici separati da BN-PAGE, poiché il comportamento di migrazione dipende dalle dimensioni, forma e anche su modifiche di posttranslational dei complessi31, 41. Stima delle dimensioni dei complessi RNP è ancora più complicata a causa dell'influenza degli acidi nucleici sul comportamento di migrazione. Può anche non essere prevenuta che complessi della stessa dimensione co-migrano in una singola banda. Questo può portare alla previsione errata delle composizioni complesse. Pertanto verificare le interazioni osservate con tecniche complementari, ad esempio da saggi funzionali4, potrebbe essere necessario. Anche proteine solo debolmente o transitoriamente associate ad un complesso macromolecolare potrebbero essere perso in BN buffer utilizzato. Per evitare questo, campioni potrebbero essere reticolati, ciò che può anche portare a manufatti o può impedire l'identificazione della proteina, o le condizioni di buffer possono essere ottimizzate.
In contrasto con il classico 2D-PAGE, la combinazione di urea e di SDS-PAGE permette la separazione secondo idrofobicità e peso molecolare invece di punto isoelettrico (pI) e peso molecolare 28e non limita la separazione di proteine di un spettro specifico pI. Proteine simili alla classica 2D-PAGE, separate sono visibili come punti singoli, ma su una diagonale linea 4,28 (Figura 5, , Figura 6). Altre proteine idrofobiche compaiono nei punti sopra la diagonale, mentre più proteine idrofiliche si trovano sotto la linea28. Le concentrazioni di poliacrilammide utilizzate nel presente protocollo saranno ben separare le proteine tra 25 a 80 kDa. Per consentire la separazione delle proteine più piccole o più grandi il poliacrilammide concentrazione può essere variata o gel gradiente può essere utilizzato nella terza dimensione. I componenti del complesso IV (Figura 3) separati da 3D-pagina (Figura 6) sono stati tagliati fuori, tripsina digerito ed analizzati mediante spettrometria di massa. Ciò ha provocato l'identificazione di diverse ligasi di tRNA. I componenti dei altri complessi sono stati recentemente pubblicati 4. Il nostro 3D-pagina abilitata la separazione delle diverse ligasi, vale a dire aspartato, asparagina, treonina, lisina e glicina ligasi, con pesi molecolari simili (tabella 3). Utilizzando una sonda di tRNA-specific di metionina, siamo stati in grado di rilevare il tRNA potenzialmente associati all'interno del complesso IV, ma se full-length tRNA o frammenti di tRNA sono nel complesso non possono essere discriminati con le sonde utilizzate. Per verificare se gli acidi nucleici sono davvero legato all'interno del complesso e non co-migrazione, proteasi digerito sap floema campioni potrebbero servire come controlli di migrazione adatto.
Si è ipotizzato, all'inizio, che la traduzione della proteina può verificarsi all'interno di tubi cribrosi del floema, poiché quasi la maggior parte dei componenti del ribosoma intero così come i fattori di allungamento sono stati trovati nel floema campioni4,7. La nostra individuazione del tRNA e ligasi tRNA sembra supportare questa idea. Tuttavia, frammenti di tRNA presenti nei campioni del floema di zucca sono stati indicati per essere inibitori potenti di traduzione42 e ribosomi funzionali sembrano essere assenti4, suggerendo che la traduzione non può avvenire.
Presi insieme, il protocollo presentato qui consente la separazione di proteine: proteina nativa e persino RNP complessi da campioni del floema e la separazione e l'identificazione dei loro singoli componenti con alta risoluzione. L'applicazione di questo metodo consente la scoperta di nuova proteina e RNP complessi nei campioni del floema e pertanto può delucidare nuove funzioni in questo compartimento pianta altamente specializzati.

I condotti a lunga distanza del floema sono essenziali per la ripartizione dei nutrienti organici nelle piante superiori, ma sono anche coinvolti nella regolazione di molti processi differenti importanti per la crescita e lo sviluppo, difesa degli agenti patogeni e l'adattamento alle avverse condizioni ambientali. Oltre a piccoli effettori come ioni, fitormoni o metaboliti stessi, macromolecole come proteine ed RNA recentemente sono emerso come segnali di potenziali.
Gli studi hanno indicato che il caricamento del floema delle proteine è dimensione dipendente e controllato dal limite di esclusione di formato (SEL) delle unità poro-plasmodesmal collega compagno cellule (CC) ed il setaccio elementi (SE) che sono in genere nel range di 10-> 67 kDa1 , 2 , 3. Tuttavia, nonostante queste proteine più grandi limitazioni di dimensioni e proteina complessi sono stati trovati all'interno del sistema di floema sfidando l'idea di dimensione esclusione4, e anche non specifico perdita di proteine da CC a SE è stato suggerito5 .
Complessi multiproteici, nonché grandi ribonucleoproteina giocano un ruolo fondamentale nella biosintesi e mantenimento dell'integrità strutturale della cellula6. C'è evidenza che complessi proteina-proteina e ribonucleoproteina floema-mobile esistano4,7, ma fino ad oggi si sa poco sulla loro funzione. In elementi di setaccio del floema: proteina e RNP complessi sono stati implicati con trasporto su lunghe distanze e / o segnalazione8,9. Per svelare le funzioni dei complessi spostati, lo studio della loro composizione in variabili ambientali o condizioni di stress sono necessarie. Per raggiungere questo obiettivo, nativi complessi devono essere isolato e loro componenti devono essere separati con una risoluzione sufficiente.
Per isolare i complessi ad alto peso molecolare da floema, è innanzitutto necessario ottenere campioni di sap in qualità e quantità sufficiente. La tecnica che può essere utilizzata per il campionamento del floema dipende la specie vegetali di interesse. Esistono tre metodi principali per ottenere sap floema 10: insetto stylectomy11, EDTA-facilitato essudazione12ed essudazione spontanea13.
Campioni del floema da thaliana di Arabidopsis (a. thaliana), l'impianto modello principali nei laboratori in tutto il mondo, può di EDTA-facilitato essudazione o afide stylectomy14,15. Entrambi i metodi portano a sap floema altamente diluite o importi molto basso del campione. EDTA-facilitato essudazione è anche soggetto a contaminazione e potrebbe non rappresentare il floema reale composizione16. Essudazione spontanea del floema è limitato a piantare specie come cucurbitacee, lupino o yucca, dove tagliare le parti della pianta porta a un'emissione spontanea di sap floema che possono essere facilmente raccolti13,17,18, 19. Abbiamo recentemente stabilito colza (Brassica napus) come un sistema di modello adatto per l'analisi del floema, poiché è un parente stretto di a. thaliana e diversi microlitri di sap floema possono essere ottenuti da piccole incisioni che ha dimostrato di essere di elevata purezza4,8,20. Inoltre, la sequenza del genoma di b. napus è stata rilasciata nel 201421.
Ad eccezione di afide stylectomy, tutti i metodi di raccolta del floema descritti includono il danneggiamento del tessuto presso il sito di campionamento circostante e la composizione della linfa del floema può cambiare in risposta alla lesione. Pertanto è indispensabile controllare la qualità dei campioni del floema, indipendentemente dal metodo di campionamento applicato. Ci sono diversi metodi per il controllo di qualità di sap floema raccolti, ad esempio tramite determinazione di RNAsi attività22,23, RT-PCR con primer contro Rubisco8,24o l'analisi dello zucchero composizione8.
Diversi metodi per isolare e separare i complessi della proteina possono essere applicati, tra cui la cromatografia di esclusione di formato, saccarosio densità ultracentrifugazione o filtrazione del campione attraverso membrane con peso molecolare distinti taglio off. Tuttavia, questi approcci non consentono ad alta risoluzione. La tecnica chiamata PAGE nativo blu (BN-PAGE), in primo luogo descritta da Schägger et al. 25, è superiore in termini di risoluzione. È stato usato con successo per determinare i pesi molecolari dei complessi della proteina nativa grande da vari organelli o da lisati cellulari e loro abbondanze relative26,27.
Per più ulteriormente delucidare la complessa composizione dei complessi della proteina, è necessario separare i singoli componenti sotto denaturare le condizioni, che portano al completo smontaggio di componenti complessi. Ciò può essere ottenuto da una seconda dimensione di SDS-PAGE 28,29 o, per raggiungere la più alta risoluzione, da una seconda dimensione di isoelettrofocalizzazione (IEF) seguita da un third dimension di SDS-PAGE30 e la successiva identificazione di le proteine mediante spettrometria di massa.
In questo protocollo, descriviamo il campionamento di sap floema puro da b. napus piante e l'analisi dei complessi della proteina da tali esempi di floema utilizzando un approccio elettroforetico 3D combinando BN-PAGE con Tris-Tricine-urea-PAGE e SDS-PAGE. Le proteine separate componenti complessi vengono successivamente identificati mediante spettrometria di massa. Inoltre, introduciamo Macchiarsi nordico nativo blu come un metodo che permette la rilevazione di RNA in grande RNP complessi4, estendere l'applicabilità dell'approccio.

<table><tbody><tr><td>Provette di reazione da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>pettine a 10 pozzetti per SDS PAGE, spessore 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 30 % (29:1) Soluzione</td><td>BioRad</td><td></td> 1610156 <td></td>Soluzione</tr><tr><td>di acrilammide-bisacrilammide al 30 % (37,5:1)</td><td></td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % Etanolo</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di alluminio-(14-18)-idrato</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Perossidisolfato di ammonio (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Concentratori centrifughi es. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Kit modulo di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Carte per cromatografia ad es. 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30</td><td>Sistema Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel ad es Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb più</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione es Incubatore di ibridazione GFL 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico (0,8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>Pettine gel IPG, spessore 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Marcatura dell'RNA esBiotina 3'end Kit di etichettatura del DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Gel a gradiente nativo ad es. Novex NativePAGE 4&ndash; Gel proteico Bis-Tris 16%</td><td>Membrana</td><td></td> in nylon BN1002BOX <td></td></tr><tr><td>es. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Acido orto-fosforico</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler scala proteica prestained</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi su gel EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>disponibile presso GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot es. Fastblot 43B semi secco Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Sintesi di cDNA es. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Tampone di ibridazione ultrasensibile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker es. Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>di Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi verticale es.The XCell SureLock Mini-Cell o Mini-Protean III</td><td>System Thermo Fisher Scientific o BioRad</td><td>EI0001 o 1658004</td><td></td></tr><tr><td>tergicristalli es. KIMWIPES Delicato Tergicristalli</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

floema sap campionamento da brassica napus per 3d-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Floema delle piante superiori di campionamento è spesso laborioso e significativamente dipende la specie di pianta. Tuttavia, proteoma studi sotto condizioni di denaturazione potrebbero essere realizzati in diverse specie vegetali. Proteine: proteina nativa e proteina: complessi di acidi nucleici da campioni di floema ancora sono a malapena stati analizzati, anche se potrebbe giocano ruoli importanti nel mantenimento di questo comparto specializzato o nella segnalazione a lunga distanza. Assiemi di grandi dimensioni molecolari possono essere isolati utilizzando un'elettroforesi Natale blu del gel (BN-PAGE). Loro componenti proteici possono essere separate da un successiva sodio dodecil solfato (SDS-pagina). Tuttavia, le proteine con pesi molecolari simili co-migrano, ciò che può ostacolare la identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa. BN-PAGE la combinazione con due differenti denaturante gel elettroforesi passi, vale a dire Tris-Tricine-urea e SDS-PAGE, consente l'ulteriore separazione delle proteine secondo loro idrofilicità/idrofobicità e così aumenta la risoluzione e il successo di identificazione della proteina. Esso consente anche di distinguere una proteina che differiscono solo nelle loro modifiche di posttranslational. Inoltre, Macchiarsi nordico nativo blu può essere applicato per identificare i componenti di RNA in complessi macromolecolari. Indichiamo che il nostro protocollo è adatto per svelare le proteine e RNA componenti di proteine: proteina nativa e complessi della ribonucleoproteina (RNP) che si verificano nei campioni del floema. Combinando un blu PAGE nativo con due diverse fasi di pagina denaturazione può aiutare a separare i diversi tipi di complessi proteici grande e consente inoltre un tasso aumentato di identificazione dei loro componenti mediante spettrometria di massa. Inoltre, il protocollo è abbastanza robusto per rilevare contemporaneamente acidi nucleici potenzialmente associati all'interno di complessi di singole proteine.

Qui presentiamo un protocollo per analizzare la composizione proteica della grande proteina nativa: proteina e proteina: complessi di acidi nucleici da colza (b. napus) essudato floema utilizzando un approccio di elettroforesi (pagina) del gel di poliacrilammide 3D combinando blu nativo (BN) con due pagine di denaturazione seguita dall'identificazione spettrometria di massa.

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

L'obiettivo generale di questa procedura 3D-PAGE è quello di separare i complessi proteici e ribonucleoproteici dalla linfa di Brassica napus ploem, insieme all'identificazione dei rispettivi acidi nucleici e componenti proteici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biochimica e fisiologia vegetale. Ad esempio, è possibile analizzare la composizione dei complessi floematici sotto stress.Il vantaggio principale della tecnica è che la linfa floematica pura può essere raccolta e gli acidi nucleici, così come i componenti proteici, possono essere analizzati contemporaneamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni delle proteine proteiche e degli acidi nucleici proteici all'interno del sistema floematico della colza, può essere applicato anche all'analisi floematica di altre piante come cucurbitacee, lupini e yucca. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di identificare i partner di interazione tra proteine e RNA per specifiche proteine del floema.Per prima cosa, pungere più volte lo stelo infiorescente di una pianta di B.napus di otto settimane utilizzando un ago ipodermico da 0,8 millimetri. Forare diversi altri steli infiorescenti sulla stessa pianta e su altre piante per ottenere abbastanza linfa floematica. Pulisci la prima goccia da ogni sito ferito con carta da filtro.Dopo aver rimosso le prime gocce, utilizzare una pipetta per raccogliere le gocce rimanenti. E trasferirli in una provetta di reazione conica da 1,5 millilitri pre-raffreddata. Quindi conservare l'essudato raccolto a meno 20 gradi Celsius utilizzando un sistema di raffreddamento senza ghiaccio.Continuare a raccogliere le gocce fino a quando non si osserva più la formazione di gocce, ma non più di un'ora. Successivamente, aggiungere il campione di floema a un concentratore centrifugo con un peso molecolare tagliato di 10.000 dalton e concentrare a circa 1/6 del volume iniziale. Quindi, centrifugare il campione concentrato a quattro gradi Celsius e 20.000 g per almeno 15 minuti per rimuovere le particelle di polvere.Per eseguire la PAGE nativa blu, assemblare la camera del gel. E aggiungi il tampone catodico blu scuro B alla metà e lava i pozzetti con il tampone catodico. Caricare da 20 a 30 microgrammi di campione proteico concentrato per pozzetto su un gel radiante Bis-Tris commerciale in almeno triplicato.Riempire la camera con catodo e anodo tampone e far funzionare il gel a quattro gradi Celsius e 150 volt fino a quando il campione non supera 1/3 del gel, il che richiede dai 20 ai 30 minuti. Mettere in pausa la corsa e scambiare il tampone catodico blu scuro B con il tampone catodico blu chiaro B 1/10. Riavvia la corsa e continua fino a quando la parte anteriore blu inizia a eluire dal gel, il che richiede dai 120 ai 180 minuti.Ritagliare un'intera corsia di gel dal gel blu nativo, quindi trasferirla su una membrana di nylon mediante tamponamento semi-asciutto e segnare i bordi superiore e inferiore del gel sulla membrana con una matita. Dopo l'asciugatura, lavare la membrana con acqua trattata con DEPC e posizionarla tra due pezzi di carta da filtro ad asciugare. Successivamente, eseguire la reticolazione UV della membrana tamponata con un'energia applicata di 120.000 micro joule per centimetro quadrato.Ora, pre-ibridare la membrana reticolata UV con sei millilitri di tampone di ibridazione per 60 minuti a 68 gradi Celsius in un forno di ibridazione. Aggiungere alla membrana un ulteriore millilitro di tampone di ibridazione contenente quattro microlitri di sonde biotinilate a 3 prime. Quindi, incubare la membrana con la sonda durante la notte mentre si raffredda il forno di ibridazione da 68 a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, lavare la membrana con un tampone contenente 2x SSC e 0,1% SDS per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere le sonde legate in modo non specifico. Eseguire il rilevamento delle sonde biotinilate a 3 prime sulla membrana con un coniugato HRP di streptavidina e luminol come substrato della perossidasi di rafano, determinando una reazione chemiluminescente sensibile. Accise singole bande dal gel nativo blu.Combina bande di campioni eseguiti in corsie parallele in una provetta di reazione conica da 1,5 millilitri per ottenere un'ulteriore concentrazione di proteine complesse. Per preparare un gel di urea Tris-Tricina al 12%, versare 10 millilitri di soluzione di gel A tra due lastre di vetro e sovrapporre con isopropanolo. Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'isopropanolo, aggiungere due o tre millilitri di soluzione di gel B al gel e inserire un pettine a 10 pozzetti.Per l'equilibratura dei pezzi di gel asportati, aggiungere un millilitro di tampone campione 2x SDS nella provetta di reazione. Dopo aver incubato il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, riscaldare in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius per circa un minuto. Quindi incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti.Successivamente, impilare diversi pezzi di gel equilibrati che rappresentano lo stesso complesso in un'unica tasca di gel. Dopo aver assemblato la camera del gel, eseguire l'elettroforesi utilizzando tamponi anodici e catodici a 150 volt per 45-60 minuti. Al termine, asportare l'intera corsia del gel.Incubare la corsia di gel tagliata per 20 minuti in tampone acido. Quindi, equilibrare in Tris-HCL da 125 millimolari a pH 6,8 per altri 20 minuti. Versare una soluzione di gel separatore SDS al 15% secondo lanely.Una volta che il gel si è solidificato, rimuovere l'isopropanolo, aggiungere tre millilitri di una soluzione di gel impilabile al 4% e inserire l'apposito pettine per gel IPG. Dopo la solidificazione, trasferire la corsia del gel equilibrante sul gel SDS e coprire il gel con lo 0,5% di agarosio in 1x tampone di corsa SDS integrato con una traccia di blu di bromofenolo. Dopo aver assemblato la camera del gel, far funzionare il gel a 150 volt per 60 minuti.Al termine, colorare il gel con la soluzione colloidale di Kumasi per la successiva analisi spettrometrica di massa. Infine, analizzare le macchie proteiche visibili utilizzando la spettrometria a tempo di volo a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice. Qui è raffigurato un risultato rappresentativo ottenuto da un campione di floema puro.I campioni di floema non contaminato mostrano una banda visibile per l'età della tioredossina, mentre non si osserva alcun segnale per RuBisCO e la proteina del rivestimento pollinico. Almeno quattro bande principali del complesso proteico diventano visibili dopo BN PAGE della linfa del floema di B.napus. Concentrazioni troppo basse o troppo alte di linfa floematica non consentono una netta separazione dei complessi.La separazione ad alta risoluzione è osservata in 3D PAGE a causa dei diversi comportamenti di migrazione delle proteine nei gel urea e SDS-PAGE. Tipicamente, le proteine appartenenti a un singolo complesso saranno visibili come una linea diagonale attraverso il gel. Le proteine al di sopra di questa linea hanno una maggiore idrofobicità, mentre le proteine al di sotto della linea sono più idrofile.Il northern blotting di BN mostra che uno specifico tRNA è presente solo in un complesso specifico. L'analisi spettrometrica di massa ha mostrato che questo complesso contiene principalmente tRNA ligasi, il che conferma l'attività di legame del tRNA riscontrata dal Northern blotting del BN. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare guanti e un camice da laboratorio per ridurre al minimo la contaminazione da carotene che ostacolerà l'analisi spettrometrica di massa. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come zimogrammi e saggi enzimatici con linfa floematica raccolta per rispondere a ulteriori domande, come studi complessi di attività e inibizione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scienza delle piante per esplorare complessi multi-subunità in campioni di floema di diverse specie vegetali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la linfa del floema dalle piante di Brassica napus e come isolare e analizzare le proteine proteiche e i complessi di acidi nucleici proteici. Non dimenticare che lavorare con SDS, acrilammide e TMET può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto il cofano con guanti e camice da laboratorio.

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