Microscopia a coerenza ottica a campo intero per l'analisi istologica delle caratteristiche stromali negli innesti corneali

Questo metodo può migliorare lo screening e la selezione dei tessuti dei donatori corneali nelle banche degli occhi, migliorare i risultati del trapianto di cornea. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di valutazione ad alta risoluzione e che la cornea rimane immersa in una camera chiusa riempita con supporto di memorizzazione durante l'acquisizione delle immagini, riducendo qualsiasi potenziale rischio di contaminazione. A dimostrare la procedura sarà Maelle Vilbert, dottoranda del nostro laboratorio.

Per iniziare, posizionare la cornea immersa nel supporto di conservazione nel supporto del campione con l'epitelio rivolto verso l'alto. Posizionare un vetrino di copertura in silice pulito fornito con il supporto del campione sulla parte superiore della cornea. Quindi, chiudere il supporto ruotando delicatamente la base fino a quando il campione non è leggermente appiattito e immobilizzato sotto il vetrino di copertura, fornendo una superficie di imaging relativamente uniforme.

Prendere precauzioni per evitare bolle d'aria. Applicare uno spesso strato di gel oftalmico o ottico sul vetrino di copertura come mezzo di immersione. Inizializzare il dispositivo accendendo l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo.

L'illuminazione di un LED verde sulla parte anteriore del dispositivo indica che l'alimentazione è accesa. Assicurarsi che la fase di imaging sia chiara, ad eccezione del vassoio mobile. Quindi fare clic su OK nel software di acquisizione per inizializzare i motori al prompt.

Per configurare il dispositivo, immettere un identificatore di esempio nel campo designato e obbligatorio. E facoltativamente inserisci una descrizione di esempio e una descrizione dello studio. Quindi, fare clic su Acquisisci immagine macro per creare un'istantanea dell'esempio che può essere successivamente utilizzata per il posizionamento laterale e la navigazione.

Una volta soddisfatta, convalidare l'immagine al prompt facendo clic su Sì. Dopodiché il dispositivo sposterà il vassoio del campione sotto l'obiettivo ed eseguirà una regolazione automatica. Assicurarsi che l'obiettivo del microscopio sia ben immerso nel gel ottico prima di procedere ulteriormente.

Prepara l'acquisizione andando alla scheda Esplora. Prima di acquisire una pila di immagini, navigare verso il centro della cornea tramite il joystick o la selezione manuale sullo schermo. Varia la profondità dell'immagine tramite la rotazione del joystick, la regolazione del cursore o l'input manuale della tastiera nell'interfaccia utente grafica.

Quindi regolare il valore medio a 40 per un'imaging corneale ottimale. Immettere il valore della superficie corneale o la prima posizione dell'immagine nel campo di profondità. Quindi selezionare la scheda Acquisisci per acquisire immagini.

Selezionare e impostare la spaziatura delle sezioni corrispondente alla risoluzione assiale del dispositivo. Immettere il valore dello spessore corneale in Numero di fette. Rivedere i parametri e il tempo di acquisizione.

E quando sei soddisfatto, premi OK per avviare l'acquisizione. Durante l'acquisizione, evitare il contatto con il tavolo su cui è posizionato il microscopio. Per valutare lo spessore dello strato stromale e di Bowman, misurare le distanze delle sezioni trasversali corneali.

Ad esempio, aggiungete cinque punti equidistanti nella sezione trasversale come descritto nel testo manuscritto. Tracciare una linea tra due punti di distanza nota in base al campo visivo predefinito. Quindi vai alla scheda Analizza e seleziona Imposta scala.

Immettere la distanza nota e l'unità di lunghezza nei campi appropriati. Impostate su 1024 pixel o 780 micrometri e fate clic su OK. Tracciare una linea tra due punti di distanza sconosciuta e leggere la lunghezza o la distanza misurata direttamente dalla barra di stato. Registrare la media e il coefficiente di variazione.

Fare clic sulla scheda Immagine e selezionare Reslice Z in Stacks per determinare la densità dei cheratinociti. Questo sommare le immagini stromali en face in gruppi di sette per produrre fette di spessore comparabile. Per ulteriori analisi, includere tutte le fette en face disponibili per lo stroma più anteriore, 15 immagini per lo stroma anteriore, cinque immagini per lo stroma medio e cinque immagini per lo stroma posteriore.

Su ogni immagine rivestita, seleziona una regione di interesse di 300 per 300 micrometri. Per migliorare la visualizzazione del nucleo, invertire l'immagine utilizzando Inverti nella scheda Modifica. Regola il contrasto e la luminosità facendo clic sulla scheda Immagine e passando a Luminosità-Contrasto.

Per contare manualmente i nuclei delle cellule, vai su Plugin e vai a Contatore celle nella scheda Analizza. Premere Inizializza, quindi selezionare un tipo di contatore. Quindi conta i nuclei cellulari facendo clic sulle caratteristiche ovali scure nell'immagine invertita, considerando quelle che atterrano su un bordo dell'immagine solo per due dei quattro lati dell'immagine.

La cornea del donatore umano selezionato era gonfia dopo la conservazione in terreno di coltura d'organo, fornendo un modello fisiopatologico della cornea edematosa e impedendo l'acquisizione di immagini attraverso l'intero spessore corneale a causa della limitata profondità di penetrazione. Il trasferimento al terreno di coltura d'organo integrato con destrina, ha ridotto il gonfiore e ha provocato cornee del donatore di spessore normale. Le cornee malate sono state riconosciute dai cambiamenti morfologici e dalle caratteristiche stromali tipiche, tra cui una diminuzione dello spessore stromale variabile o dello strato di Bowman.

La valutazione della densità dei cheratinociti e della riflettività stromale ha ulteriormente aiutato nell'analisi istologica e nella differenziazione dei tessuti corneali normali da quelli patologici con microscopia a coerenza ottica a campo intero, che va oltre le capacità dei sistemi di tomografia a coerenza ottica clinica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi istologica qualitativa e quantitativa dello stroma corneale che consente di differenziare la malattia dai normali tessuti corneali umani.