Name: Microscopia a coerenza ottica a campo intero per lanalisi istologica delle caratteristiche stromali negli innesti corneali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Impara la microscopia a coerenza ottica a campo intero per analizzare la qualità dello stroma corneale nei tessuti donatore. Questa tecnica ad alta risoluzione migliora la selezione degli innesti e ottimizza i risultati della cheratoplastica.

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Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dall'Agence Nationale de Recherche (ANR), nell'ambito di una sovvenzione PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) e dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 709104 (K.I.). Gli autori ringraziano Céline de Sousa per l'aiuto con il conteggio delle cellule e l'elaborazione istologica.

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e hanno seguito i requisiti etici internazionali per i tessuti umani. Questo era uno studio prospettico osservazionale caso-controllo. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti. Non sono state apportate modifiche alle norme francesi di trattamento o di follow-up. L'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) è stata ottenuta dal Comitato per la protezione dei pazienti, Ile-de-France V (14944).
1. Selezione e preparazione dei tessuti
<ol><li>Selezionare le cornee del donatore.
	<ol><li>Trasferire le cornee del donatore conservate nel mezzo di coltura d'organo 26 al terreno di coltura d'organo integrato con destrano per 3 giorni per consentire la deturgescenza27 prima dell'imaging FF-OCM28 (vedere Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare i campioni.
	<ol><li>Posizionare la cornea, immersa nel supporto di conservazione, nel portacampioni con l'epitelio rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Posizionare un coprivetrino di silice pulito (fornito con il supporto del campione) sulla parte superiore della cornea e chiudere il supporto ruotando delicatamente la sua base fino a quando il campione è leggermente appiattito e immobilizzato sotto il coprivetrino fornendo una superficie di imaging relativamente uniforme. Prendere precauzioni per evitare bolle d'aria.</li>
		<li>Applicare uno spesso strato di gel oftalmico o ottico sul vetrino come mezzo di immersione.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inizializzazione, configurazione e acquisizione di immagini FF-OCM
<ol><li>Inizializzare il dispositivo.
	<ol><li>Accendere il dispositivo azionando l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo; l'illuminazione di un LED verde sulla parte anteriore del dispositivo indica che l'alimentazione è accesa.</li>
		<li>Accendere il computer dedicato e la sorgente luminosa alogena azionando l'interruttore di alimentazione sulla parte anteriore.</li>
		<li>Avviare il software di acquisizione (vedere Tabella dei materiali) facendo doppio clic sul collegamento sul desktop.</li>
		<li>Assicurarsi che la fase di imaging sia chiara ad eccezione del vassoio mobile. Quindi fare clic su "OK" per inizializzare i motori al prompt.</li>
		<li>Estrarre il vassoio e inserire il portacampioni nell'apposito contenitore, quindi spingere delicatamente indietro il vassoio.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurare il dispositivo.
	<ol><li>Inserire un "identificatore campione" nel campo designato e obbligatorio; Facoltativamente, inserire una "Descrizione del campione" e/o una "Descrizione dello studio".</li>
		<li>Fare clic su "Acquisisci immagine macro" quando si è pronti, per creare un'istantanea del campione che può essere utilizzata per scopi di posizionamento laterale e navigazione in un secondo momento; una volta soddisfatto, convalidare l'immagine al prompt facendo clic su "Sì", dopodiché il dispositivo sposta il vassoio del campione sotto l'obiettivo ed esegue una regolazione automatica.</li>
		<li>Assicurarsi che l'obiettivo del microscopio sia ben immerso nel gel ottico prima di procedere ulteriormente.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquisisci gli stack.
	<ol><li>Seleziona la scheda "Esplora" per preparare un'acquisizione.
		<ol><li>Prima di acquisire una pila di immagini, navigare verso il centro della cornea, tramite la traduzione del joystick o la selezione manuale sullo schermo (cioè, facendo clic e trascinando il quadrato rosso sull'immagine macro acquisita nella posizione desiderata).</li>
			<li>Variare la profondità dell'immagine tramite la rotazione del joystick, la regolazione del cursore o l'input manuale da tastiera nell'interfaccia utente grafica (GUI) e regolare il valore medio (una media di 40 è generalmente raccomandata per l'imaging corneale ottimale). NOTA: Questo viene fatto per determinare lo spessore del campione corneale e la media necessaria per l'immagine attraverso l'intero spessore corneale notando la prima e l'ultima posizione dell'immagine in profondità. La superficie inferiore del coprivetrino crea frange di interferenza parallele che si vedono sull'immagine tomografica (sul lato destro della GUI), che facilitano la localizzazione della superficie corneale.</li>
			<li>Inserisci il valore della superficie corneale o la prima posizione dell'immagine in profondità nel campo "Profondità".</li>
		</ol></li>
		<li>Seleziona la scheda "Acquisisci" per acquisire immagini.
		<ol><li>Selezionare la "Distanza tra le fette" (l'impostazione predefinita e consigliata è 1 μm, corrispondente alla risoluzione assiale del dispositivo) e inserire il valore dello spessore corneale di conseguenza, sotto "Numero di fette".</li>
			<li>Rivedere i parametri e il tempo di acquisizione e, quando soddisfatti, premere "OK" per avviare l'acquisizione.</li>
			<li>Durante l'acquisizione, evitare qualsiasi contatto con il tavolo su cui è posizionato FF-OCM.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Gestione delle immagini acquisite
<ol><li>Visualizza ed esporta immagini.
	<ol><li>Avviare il software di visualizzazione FF-OCM (vedi Tabella dei materiali) facendo doppio clic sul collegamento sul desktop; le immagini acquisite (identificate dall'ID campione) vengono visualizzate nell'elenco "Studi locali".</li>
		<li>Selezionare lo studio con l'ID campione corrispondente, che contiene sia l'immagine macro che lo stack di immagini acquisite, e "esportare" quest'ultimo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla serie di immagini e selezionando il formato "DICOM" per conservare i dati dei pixel grezzi e i metadati per ulteriori analisi.</li>
		<li>Visualizzare le pile di immagini 3D nelle viste en face e cross-sectional utilizzando la modalità di ricostruzione multiplanara (MPR), facendo doppio clic sulla serie di immagini; Naviga tra le immagini (ad esempio, tramite lo scorrimento della rotellina del mouse o la regolazione del cursore) e seleziona le viste rappresentative in faccia e in sezione trasversale di ciascuna pila.</li>
		<li>Esportare le viste selezionate facendo clic sull'icona in basso a destra della finestra, utilizzando il formato "DICOM".</li>
	</ol></li>
	<li>Importare immagini.
	<ol><li>Aprire il software di elaborazione delle immagini (vedere Tabella dei materiali) facendo doppio clic sul collegamento sul desktop e accedere a "Bio-Formats" "Importer" sotto "Plugin" per importare immagini DICOM; assicurarsi che "Raggruppa file con nomi simili" sia selezionato nella finestra "Opzioni di importazione bio-formati".</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi delle immagini: valutazione qualitativa e quantitativa della morfologia e delle caratteristiche stromali
<ol><li>Valutare lo spessore dello strato stromale e di Bowman.
	<ol><li>Misurare manualmente le distanze sulle sezioni trasversali corneali, ad esempio in cinque punti equidistanti attraverso la sezione trasversale25.<ol><li>Tracciare una linea tra due punti di distanza nota (ad esempio, da sinistra a destra dell'intera immagine, cioè secondo il campo visivo predefinito, 1.024 pixel o 780 μm), andare su "Analizza" e selezionare "Imposta scala", inserire "Distanza nota" e "Unità di lunghezza" nei campi appropriati e fare clic su "OK".</li>
			<li>Traccia una linea tra due punti di distanza sconosciuta; Leggere la lunghezza o la distanza misurata direttamente dalla barra di stato.</li>
		</ol></li>
		<li>Registrare la media e il coefficiente di variazione (COV). Lo spessore dello strato di Bowman inferiore a 6,5 μm e un COV superiore al 18,6% sono stati associati a stroma corneale anormale25.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinare la densità dei cheratociti.
	<ol><li>Seguendo la convenzione della microscopia confocale: sommare le immagini stromali e facciali in gruppi di 7 per produrre fette di spessore comparabile. Per questo, vai alla scheda "Immagine" e seleziona "Reslice Z" sotto "Stacks".</li>
		<li>Prendere in considerazione la diversa (decrescente) densità cellulare sulla progressione attraverso lo stroma24,25. Per questo, lo stroma può essere considerato come composto da 4 regioni in base alla profondità: (1) lo stroma molto anteriore sotto lo strato di Bowman, cioè il 2% dell'intero spessore stromale; lo stroma rimanente (cioè il 98% dell'intero spessore stromale), con tre zone di identico spessore: (2) stroma anteriore, (3) stroma medio e (4) stroma posteriore.</li>
		<li>Per ulteriori analisi, includere tutte le fette en face disponibili per lo stroma molto anteriore, 15 immagini per lo stroma anteriore, 5 immagini per lo stroma medio e 5 immagini per lo stroma posteriore (dove il numero di immagini per regione richiesto per un conteggio affidabile è stato determinato dall'analisi graduale29).</li>
		<li>Su ogni immagine facciale , selezionare una regione di interesse di 300 μm x 300 μm. Per migliorare la visualizzazione del nucleo, invertire l'immagine, utilizzando "Inverti" nella scheda "Modifica" e regolare il contrasto e la luminosità. Per quest'ultimo, vai su "Immagine" e vai su "Luminosità / Contrasto" sotto "Analizza".</li>
		<li>Contare manualmente i nuclei cellulari, usando ad esempio la funzione "contatore di cellule"25. Per questo, vai su "Plugin" e vai su "Cell Counter" sotto "Analizza". Premere "inizializza" e quindi selezionare un tipo di contatore. Quindi inizia a contare i nuclei cellulari facendo clic sulle caratteristiche ovali scure nell'immagine invertita, considerando quelle che atterrano su un bordo dell'immagine solo per due dei quattro lati dell'immagine25.</li>
		<li>Registrare la densità cellulare in termini di densità di area, cioè in cellule/mm² (dividere il numero di cellule contate per 0,09, per convertire da cellule/90.000 μm² a cellule/mm²), seguendo la convenzione di microscopia confocale in cui le densità dei cheratociti hanno dimostrato di essere inferiori nei pazienti (ad esempio, con cheratocono) rispetto ai soggetti sani e di essere correlate con la gravità della malattia25. NOTA: Sono necessari ulteriori studi clinici per determinare se è necessaria una soglia minima di densità cheratocitaria per ottenere un innesto corneale perfettamente chiaro dopo il trapianto.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutare la riflettività stromale.
	<ol><li>Generare profili di profondità di intensità media di stack di immagini stromali, utilizzando ad esempio la funzione "profilo asse Z" e / o il software personalizzato25,30,31. NOTA: Questi sono in realtà profili di profondità di ampiezza in quanto FF-OCM misura l'ampiezza della luce retrodiffusa dal campione piuttosto che la sua intensità.<ol><li>Calcola il livello medio di grigio per ogni pila en face .</li>
			<li>Sottrarre il valore di grigio minimo e normalizzarlo in base al valore di grigio massimo.</li>
			<li>Visualizzazione in scala logaritmica in funzione della profondità stromale (% dello spessore stromale).</li>
			<li>Approssimare il profilo logaritmico risultante mediante una linea di regressione lineare, che minimizzi la somma dei residui al quadrato (adattamento dei minimi quadrati).</li>
			<li>Registrare il valore R-quadrato (R²) come misura della linearità. Valori inferiori a 0,94 potrebbero essere un'indicazione di patologia corneale25. NOTA: Per differenziare l'inadeguatezza di un modello di regressione logaritmica lineare (o di un modello di decadimento mono-esponenziale) dovuta alla presenza di una patologia dal mero rumore di misura, può essere eseguita l'analisi del segnale mediante inferenza bayesiana31. Inoltre, nelle cornee con profili lineari logaritmici (o mono-esponenziali) di profondità stromale (ad esempio, rappresentati da valori R-quadrati30 o rapporti di Birge 31 vicini a 1), il calcolo del percorso privo medio di fotoni dal tasso di decadimento del segnale può essere utilizzato per quantificare ulteriormente il grado di trasparenza31.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Valutare la visibilità di altre caratteristiche stromali e indicatori di malattia.
	<ol><li>Verificare la presenza di cicatrici, tessuto fibrotico, laghi o strie di Vogt.</li>
		<li>Valutare lo spessore medio dei nervi nello stroma, se sufficientemente visibile per la misurazione24.<ol><li>Selezionare un'immagine en face in cui il nervo stromale è più visibile (generalmente nella regione medio-stromale).</li>
			<li>Misurare lo spessore del nervo, ad esempio in cinque punti24, quindi calcolare la media e la deviazione standard. Spessori nervosi superiori a 9 μm possono essere un ulteriore indicatore per la patologia, come il cheratocono24.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto per la valutazione qualitativa e quantitativa dello stroma del donatore corneale mediante FF-OCM si basa sull'analisi istologica delle caratteristiche macroscopiche e microscopiche indicative della condizione stromale, oltre le capacità dell'OCT nel dominio spettrale e della microscopia confocale21,24,25, e consente la differenziazione dei tessuti umani malati da quelli normali.
Oltre ad un'eccellente valutazione della qualità endoteliale delle cornee di donatori umani mediante microscopia speculare, la valutazione della qualità stromale è impegnativa nelle banche oculari e generalmente limitata a un'osservazione grossolana con biomicroscopia a lampada a fessura e/o microscopia ottica nei protocolli attuali. La mancanza di una risoluzione fine con i metodi esistenti non solo significa che possono essere selezionate cornee con qualche malattia stromale che compromettono il risultato della cheratoplastica, ma anche che le cornee possono essere rifiutate per opacità stromali che sono in realtà vincolate allo stroma anteriore o alle regioni epiteliali e potrebbero ancora essere utilizzate per procedure di cheratoplastica endoteliale14.
L'attuale protocollo eye-bank potrebbe essere integrato dall'aggiunta di FF-OCM, che grazie alla sua risoluzione superiore, costituisce uno strumento potente e non invasivo per completare la valutazione della qualità della cornea, in particolare dello stroma (incluso lo strato di Bowman). A differenza dell'esame con lampada a fessura, l'innesto rimane immerso in una camera chiusa riempita con supporto di memorizzazione durante l'acquisizione delle immagini FF-OCM, riducendo qualsiasi potenziale rischio di contaminazione.
Per una corretta acquisizione delle immagini con FF-OCM (vedi Tabella dei materiali), è importante che l'obiettivo del microscopio sia ben immerso nel gel ottico applicato sopra il vetrino del supporto del campione (passo 2.2.3). Si raccomanda inoltre di controllare regolarmente la calibrazione del dispositivo, una procedura da eseguire anche dopo la regolazione automatica non riuscita (punto 2.2.2) e accessibile tramite "Strumenti e opzioni" nel software di acquisizione (vedi Tabella dei materiali). La procedura, che prevede l'utilizzo di uno specchio di taratura nel portacampioni, è la stessa della normale preparazione del campione (vedi punto 1.2), tranne per il fatto che il gel ottico deve essere applicato sullo specchio prima del posizionamento del vetrino.
Una serie di innesti corneali di donatori, considerati come uno stroma normale secondo le procedure esistenti della banca degli occhi, sono stati utilizzati per descrivere il protocollo in questo manoscritto e dimostrare specificamente l'idoneità di FF-OCM per una valutazione precisa e affidabile della qualità stromale del donatore. Queste cornee normali del donatore sono state confrontate con cornee patologiche immerse nel supporto di conservazione, dimostrando che l'analisi istologica resa possibile con FF-OCM di diverse caratteristiche stromali (illustrate in Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8) negli innesti corneali consente di distinguere i tessuti corneali umani malati da quelli normali.
Oltre ai cambiamenti morfologici, come la presenza di cicatrici (Figura 5 e Figura 7), tessuto fibrotico (Figura 8), laghi (Figura 2), strie di Vogt (Figura 4) o aumento del diametro del nervo stromale (Figura 4), le caratteristiche stromali tipiche sono presenti nelle cornee malate. I parametri stromali particolarmente rilevanti nella valutazione della qualità stromale sembrano essere lo spessore dello strato di Bowman e la sua variabilità e la riflettività stromale. I passaggi critici all'interno del protocollo sono quindi i passaggi 4.1 e 4.3.
Mentre viene secreto durante lo sviluppo corneale umano, lo strato di Bowman, in particolare, diventa distinto da 19 settimane di gestazione e non si ripara mai dopo la nascita32. Il danno allo strato di Bowman è quindi irreversibile e serve come indicatore ideale di un precedente danno stromale nel tessuto corneale del donatore, compresi i danni causati da chirurgia refrattiva, cheratite infettiva, cheratocono. Tali malattie corneali, che costituiscono controindicazioni per l'uso della cornea del donatore, sono associate a uno spessore dello strato di Bowman ridotto e variabile a causa di interruzioni e cicatrici (Figura 5) e sono suscettibili di essere ignorate dagli attuali protocolli della banca degli occhi quando la storia del donatore non è nota con precisione.
Sebbene la trasparenza corneale sia compromessa dopo la morte del donatore a causa di edema corneale post mortem , la quantità di luce retrodiffusa o riflettività stromale dovrebbe diminuire esponenzialmente con la profondità nello stroma (vedi Figura 3 e Figura 4A); di conseguenza, il logaritmo della riflettività stromale normalizzata sarà una funzione lineare della profondità stromale nelle cornee normali del donatore, rappresentata da valori R-quadratici vicini a 1. Al contrario, la presenza di caratteristiche macroscopiche è associata a profili di profondità logaritmici non lineari e indicativi di malattia stromale (Figura 4B e Figura 7)25.
Poiché la densità dei cheratociti è responsabile della sintesi e del rinnovamento della fibrilla di collagene stromale e della matrice extracellulare, sembra ragionevole supporre che la densità dei cheratociti sia un altro parametro rilevante per valutare la qualità stromale del donatore e che i tessuti che presentano una conta cheratocitaria molto bassa non debbano essere trapiantati. Il protocollo include quindi un metodo preciso e affidabile per misurare la densità dei cheratociti da immagini FF-OCM che può essere facilmente utilizzato nelle banche degli occhi25 e segue la convenzione della microscopia confocale. Si noti che con FF-OCM, la densità dei cheratociti può anche essere determinata contando i cheratociti direttamente nella vista in sezione trasversale33, un potenziale vantaggio rispetto alla microscopia confocale, che richiede che i cheratociti siano contati su più fette en face. Tuttavia, a differenza dei pazienti viventi, dove è stato dimostrato che le densità dei cheratociti sono inferiori nei pazienti con malattia rispetto ai controlli normali 34,35,36,37 e sono correlate con la gravità della malattia 34,38, questo non è stato il caso nei campioni di tessuto umano ex vivo 25 , e sono necessari ulteriori studi per determinare se è necessario un numero minimo di cheratociti nelle cornee dei donatori per ottenere un buon recupero visivo dopo il trapianto. La bassa densità dei cheratociti nel tessuto donatore come nel tessuto patologico potrebbe essere spiegata dall'invecchiamento, dalla perdita post mortem di cellule indotta da ischemia e/o dalla conservazione del tessuto donatore 27,39,40,41. Va anche sottolineato che le cornee normali del donatore che sono state ottenute e visualizzate in questo protocollo sono state conservate ed edematose o de-gonfiate, o erano state scartate dalla banca degli occhi prima del trapianto a causa della scarsa qualità endoteliale secondo gli standard dell'Associazione europea delle banche degli occhi. Se l'imaging FF-OCM insieme al protocollo descritto fosse incluso nel setting della banca degli occhi, le cornee verrebbero tipicamente valutate in uno stato più fresco di quanto sia possibile qui, il che potrebbe influenzare le densità dei cheratociti.
Il protocollo qui descritto per l'analisi della qualità stromale potrebbe essere esteso per la valutazione della membrana di Descemet, che può anche essere risolta con FF-OCM in termini di spessore e struttura21,24. Ciò può rivelarsi utile per la selezione dei tessuti per la cheratoplastica endoteliale di membrana di Descemet, dove le membrane sottili di Descemet possono essere più difficili da separare dallo stroma.
In conclusione, FF-OCM consente una valutazione precisa e affidabile dello stroma corneale del donatore umano durante la conservazione. Migliorando la qualità dell'innesto, l'aggiunta di questo protocollo alle attuali procedure di banca degli occhi ha il potenziale per migliorare lo screening e la selezione dei tessuti donatori e quindi i risultati della cheratoplastica. L'integrazione nella vita reale del dispositivo FF-OCM nella routine della banca degli occhi dovrebbe essere facilitata dai recenti aggiornamenti tecnologici, tra cui l'acquisizione più rapida delle immagini e un campo visivo più ampio grazie allo sviluppo di una fotocamera CMOS personalizzata e la progettazione di cassette monouso sterili personalizzate per la conservazione e la manipolazione della cornea durante l'imaging.

Le malattie corneali sono tra le principali cause di cecità in tutto il mondo1. Alcune malattie possono essere trattate solo chirurgicamente, spesso comportando la sostituzione di una parte (ad esempio, cheratoplastica lamellare) o dell'intera (cioè cheratoplastica penetrante) cornea malata, con tessuto donato, l'innesto, prelevato da un individuo recentemente deceduto. Per le malattie corneali che non colpiscono l'endotelio (ad esempio, cheratocono, cicatrici stromali dopo cheratite infettiva, traumi e distrofie stromali), la cheratoplastica lamellare anteriore profonda (DALK) è attualmente considerata la tecnica chirurgica di scelta 2,3,4,5. Questa tecnica rende possibile la conservazione dell'endotelio corneale del ricevente, sostituendo solo l'epitelio corneale centrale e lo stroma, che è associato a una minore incidenza di rigetto del trapianto, assenza di rigetto endoteliale, minore perdita di cellule endoteliali e rapporto costo-efficacia favorevole 6,7,8,9,10,11 . DALK consente inoltre di utilizzare cornee con qualità dell'endotelio non ottimale come innesti, poiché questo strato compromesso non verrà trapiantato12. Al contrario, la qualità dello stroma corneale del donatore è probabilmente il principale fattore limitante per il successo dell'innesto e il recupero della vista perché lo stroma è l'unico strato corneale del donatore a rimanere, mentre l'epitelio del donatore sarà sostituito dall'epitelio ricevente. Sfortunatamente, i mezzi per valutare lo stroma corneale del donatore nelle banche degli occhi sono limitati. Di solito includono l'esame con lampada a fessura del bulbo oculare del donatore quando il recupero del tessuto viene effettuato mediante enucleazione e l'esame al microscopio ottico dello stroma del donatore13. Alcune banche oculari hanno iniziato a integrare tali procedure standard utilizzando la tomografia a coerenza ottica del dominio di Fourier (FD-OCT)14.
La tomografia a coerenza ottica oftalmica (OCT), un analogo ottico all'imaging a ultrasuoni15, utilizza l'interferenza della luce a banda larga o sintonizzabile per generare sezioni ottiche della retina 16 e del segmento anteriore17. Nell'OCT nel dominio del tempo, la base dei primi sistemi clinici, la posizione di uno specchio di riferimento è alterata, in modo che i modelli di interferenza si manifestino ogni volta che il fascio di riferimento ha viaggiato quasi la stessa quantità di tempo del fascio riflesso alle varie interfacce tissutali, con scansioni A generate in funzione del tempo. Nella FD-OCT (chiamata anche OCT nel dominio spettrale o nel dominio della frequenza), la base della maggior parte dei sistemi clinici moderni, lo specchio di riferimento è fissato in una posizione e un singolo A-scan, con tutti i modelli di interferenza mescolati insieme, viene acquisito alla volta e sezionato separatamente tramite l'analisi di Fourier.
Mentre i sistemi OCT clinici (tempo o dominio spettrale) consentono viste in sezione trasversale della cornea e la rilevazione di opacità stromali a una risoluzione assiale più elevata rispetto alla biomicroscopia a lampada a fessura, la loro risoluzione laterale è limitata. La microscopia confocale18 consente l'esame della cornea ad una risoluzione laterale che si avvicina al dettaglio istologico, ma è limitata assialmente.
La microscopia tomografica a coerenza ottica a pieno campo (FF-OCT o FF-OCM)19,20 combina elementi sia della microscopia confocale che dell'OCT, ottenendo una risoluzione laterale paragonabile alla risoluzione assiale di circa 1 μm. Più specificamente, FF-OCM utilizza sorgenti luminose a banda larga incoerenti (ad esempio, una lampada alogena) e ottiche ad alta apertura numerica per acquisire immagini tomografiche 2D en face senza scansione laterale. Scansionando nella direzione di profondità, FF-OCM consente l'imaging 3D non invasivo di campioni di tessuto biologico ex vivo freschi o fissi. È stato usato per visualizzare la cornea21,22,23. Fornendo viste ad alta risoluzione sia in faccia che in sezione trasversale, FF-OCM fornisce informazioni sia sulla struttura istologica che sui dettagli cellulari della cornea. Infatti, FF-OCM ha dimostrato di fornire informazioni strutturali superiori all'istologia ed è stato in grado di identificare più indicatori di malattia come era possibile con la combinazione di OCT nel dominio spettrale e microscopia confocale24,25.
Qui descriviamo un protocollo per la valutazione qualitativa e quantitativa dello stroma del donatore corneale utilizzando FF-OCM. Il metodo si basa sull'analisi istologica delle caratteristiche macroscopiche e microscopiche indicative della condizione stromale, inclusi tre parametri stromali quantitativi (cioè lo spessore dello strato di Bowman e la sua variabilità e la riflettività stromale). Il protocollo descritto viene quindi applicato ai tessuti corneali normali e anomali e consente la differenziazione dei tessuti corneali umani malati da quelli normali.

<table><tbody><tr><td>Light-CT Scanner</td><td>LLTech, Francia</td><td>http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/</td> <td>FF-OCM Dispositivo utilizzato in questo manoscritto per l'imaging</td></tr><tr><td>CorneaJet</td><td>EuroBio, Francia</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html</td><td>Terreno di coltura d'organo in cui sono conservate le cornee dei donatori</td></tr><tr><td>CorneaMax</td><td>EuroBio, Francia</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html</td><td>Terreno di coltura d'organo integrato con destrano utilizzato per la deturgescenza.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Software di elaborazione delle immagini open source</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA, USA</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Software di calcolo matematico</td></tr></tbody></table>

microscopia a coerenza ottica a campo intero per l'analisi istologica delle caratteristiche stromali negli innesti corneali

Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts

La qualità dello stroma corneale del donatore, che costituisce circa il 90% dello spessore corneale totale, è probabile che sia uno dei principali, se non il principale, fattore limitante per il successo della cheratoplastica lamellare anteriore profonda e penetrante. Si tratta di procedure chirurgiche che comportano la sostituzione di parte o di tutti gli strati corneali malati, rispettivamente, con tessuto donato, l'innesto, prelevato da un individuo recentemente deceduto. Tuttavia, i mezzi per valutare la qualità stromale degli innesti corneali nelle banche degli occhi sono limitati e mancano della capacità di una valutazione quantitativa ad alta risoluzione degli indicatori di malattia. La microscopia a coerenza ottica a campo intero (FF-OCM), che consente l'imaging 3D ad alta risoluzione di campioni di tessuto biologico ex vivo freschi o fissi, è una tecnica non invasiva adatta per la valutazione della cornea del donatore. Qui descriviamo un metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa dello stroma corneale utilizzando FF-OCM. Il protocollo è stato applicato con successo alle normali cornee del donatore e ai bottoni corneali patologici, e può essere utilizzato per identificare caratteristiche sane e patologiche sia a livello macroscopico che microscopico, facilitando così l'individuazione di disturbi stromali che potrebbero compromettere l'esito della cheratoplastica. Migliorando il controllo della qualità dell'innesto, questo protocollo ha il potenziale per portare a una migliore selezione (e rigetto) dei tessuti donatori e quindi a una riduzione del fallimento dell'innesto.

Il dispositivo FF-OCM (vedi Tabella dei materiali)28 e la configurazione generale utilizzata in questo manoscritto sono mostrati nella Figura 1. La Figura 2 mostra una cornea di donatore umano gonfiata dopo la conservazione in terreno di coltura d'organo, fornendo un modello fisiopatologico della cornea edematosa e impedendo l'acquisizione di immagini FF-OCM attraverso l'intero spessore corneale a causa della limitata profondità di penetrazione. Il trasferimento al terreno di coltura d'organo integrato con destrano provoca rigonfiamento e provoca cornee del donatore di spessore normale, come rappresentato nella Figura 3. Le cornee malate possono essere riconosciute dai cambiamenti morfologici e dalle caratteristiche stromali tipiche, tra cui uno spessore ridotto e variabile dello stroma (Figura 4) e / o dello strato di Bowman (Figura 5). La valutazione della densità dei cheratociti (Figura 6) e della riflettività stromale (Figura 7) può ulteriormente aiutare nell'analisi istologica e nella differenziazione dei tessuti corneali normali da quelli patologici con FF-OCM, oltre le capacità dei sistemi clinici OCT (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig1.jpg"> Figura 1: Schema e fotografie del setup generale e del dispositivo FF-OCM utilizzato in questo lavoro. (A) Fotografia del dispositivo FF-OCM (cfr. tabella dei materiali)28. (B) Configurazione schematica e ottica del dispositivo. (C) Fotografia di una cornea di un donatore umano nel portacampioni. (D) Zoom sull'obiettivo di immersione e sul portacampioni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig2.jpg"> Figura 2: Cornea umana normale coltivata in organi prima della deturgescenza. Sezione trasversale (A) e vista frontale (B, fetta attraverso lo stroma) della cornea gonfiata ("edematosa") causata dalla conservazione in terreno di coltura d'organo, dove i laghi possono essere visti come aree scure (come indicato dalle frecce). Lo spessore corneale è raddoppiato a oltre 1.100 μm, impedendo l'acquisizione delle immagini attraverso l'intera profondità. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig3.jpg"> Figura 3: Cornea umana normale in coltura d'organo dopo deturgescenza. Vista trasversale attraverso l'intera cornea (A) e vista stromale en face (B) della cornea de-gonfiata immersa in mezzo integrato con destrano, che mostra cheratociti iperriflettenti (bianchi) regolarmente distribuiti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig4.jpg"> Figura 4: Valutazione complessiva della morfologia e delle caratteristiche stromali, compreso lo spessore stromale. Rispetto alla cornea umana normale (A), le cornee con cheratocono (B) presentano uno spessore stromale ridotto e variabile, insieme a numerose strie di Vogt parallele che sono osservabili come bande verticali scure nelle viste trasversali e nervi stromali spessi che possono essere trovati nelle fette della faccia medio-stromale (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig5.jpg"> Figura 5: Valutazione dello spessore dello strato di Bowman, che è delineato anteriormente dalla membrana basale epiteliale iperriflettente e posteriormente dai cheratociti iperriflettenti nello stroma molto anteriore. Rispetto a una normale cornea umana (A), la cornea patologica (ad esempio, cheratocono) (B) presenta uno spessore dello strato di Bowman ridotto e variabile a causa di interruzioni e cicatrici. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig6.jpg"> Figura 6: Valutazione della densità dei cheratociti. (A) I nuclei dei cheratociti vengono contati manualmente su immagini en face migliorate e invertite dopo aver selezionato una regione di interesse di 300 μm x 300 μm. (B) I nuclei contati sono indicati da frecce. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig7.jpg"> Figura 7: Valutazione della riflettività stromale. La quantità di luce retrodiffusa diminuisce (esponenzialmente) con la profondità nello stroma delle cornee normali del donatore (vedi Figura 3 e Figura 4A), risultando in profili di profondità logaritmici lineari, rappresentati da valori R-quadratici vicini a 1 (traccia verde). Questo potrebbe non essere vero per le cornee patologiche caratterizzate da regioni stromali di maggiore retrodiffusione della luce (vedi Figura 4B). La presenza di tali caratteristiche macroscopiche, come nell'esempio di una cornea con cicatrice stromale dopo cheratite infettiva (raffigurata nell'inserto), creerà quindi profili di profondità di intensità logaritmica non lineare, rappresentati da un valore R-quadrato inferiore a una certa soglia (ad esempio, inferiore a 0,9425; traccia rossa). Si noti che i profili di profondità di ampiezza logaritmica sono infatti mostrati come FF-OCM misura l'ampiezza della luce retrodiffusa dal campione piuttosto che la sua intensità.  <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig8.jpg"> Figura 8: Dimostrazione dei benefici di FF-OCM rispetto all'istologia e all'OCT nel dominio spettrale. (A) Istologia e (B) corrispondente immagine di OCT nel dominio spettrale acquisita sulla stessa cornea in vivo prima della cheratoplastica. (C) Sezione trasversale FF-OCM corrispondente del pulsante corneale ex vivo post-cheratoplastica, che illustra una risoluzione superiore rispetto alle immagini OCT del dominio spettrale clinico. La fibrosi è anche più chiaramente visibile nelle immagini FF-OCM che nell'istologia. L'alta densità di cheratociti nello stroma superiore può essere chiaramente vista sia nella sezione trasversale (C) che nella vista (D) en face . <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Descriviamo l'uso della microscopia a coerenza ottica a campo completo come metodo per la valutazione di alta qualità dello stroma del donatore corneale. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare caratteristiche indicative di salute o malattia e mira a migliorare lo screening e la selezione dei tessuti donatori e quindi i risultati della cheratoplastica.

Microscopia a coerenza ottica a campo intero per l'analisi istologica delle caratteristiche stromali negli innesti corneali

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting ...

Questo metodo può migliorare lo screening e la selezione dei tessuti dei donatori corneali nelle banche degli occhi, migliorare i risultati del trapianto di cornea. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di valutazione ad alta risoluzione e che la cornea rimane immersa in una camera chiusa riempita con supporto di memorizzazione durante l'acquisizione delle immagini, riducendo qualsiasi potenziale rischio di contaminazione. A dimostrare la procedura sarà Maelle Vilbert, dottoranda del nostro laboratorio.Per iniziare, posizionare la cornea immersa nel supporto di conservazione nel supporto del campione con l'epitelio rivolto verso l'alto. Posizionare un vetrino di copertura in silice pulito fornito con il supporto del campione sulla parte superiore della cornea. Quindi, chiudere il supporto ruotando delicatamente la base fino a quando il campione non è leggermente appiattito e immobilizzato sotto il vetrino di copertura, fornendo una superficie di imaging relativamente uniforme.Prendere precauzioni per evitare bolle d'aria. Applicare uno spesso strato di gel oftalmico o ottico sul vetrino di copertura come mezzo di immersione. Inizializzare il dispositivo accendendo l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo.L'illuminazione di un LED verde sulla parte anteriore del dispositivo indica che l'alimentazione è accesa. Assicurarsi che la fase di imaging sia chiara, ad eccezione del vassoio mobile. Quindi fare clic su OK nel software di acquisizione per inizializzare i motori al prompt.Per configurare il dispositivo, immettere un identificatore di esempio nel campo designato e obbligatorio. E facoltativamente inserisci una descrizione di esempio e una descrizione dello studio. Quindi, fare clic su Acquisisci immagine macro per creare un'istantanea dell'esempio che può essere successivamente utilizzata per il posizionamento laterale e la navigazione.Una volta soddisfatta, convalidare l'immagine al prompt facendo clic su Sì. Dopodiché il dispositivo sposterà il vassoio del campione sotto l'obiettivo ed eseguirà una regolazione automatica. Assicurarsi che l'obiettivo del microscopio sia ben immerso nel gel ottico prima di procedere ulteriormente.Prepara l'acquisizione andando alla scheda Esplora. Prima di acquisire una pila di immagini, navigare verso il centro della cornea tramite il joystick o la selezione manuale sullo schermo. Varia la profondità dell'immagine tramite la rotazione del joystick, la regolazione del cursore o l'input manuale della tastiera nell'interfaccia utente grafica.Quindi regolare il valore medio a 40 per un'imaging corneale ottimale. Immettere il valore della superficie corneale o la prima posizione dell'immagine nel campo di profondità. Quindi selezionare la scheda Acquisisci per acquisire immagini.Selezionare e impostare la spaziatura delle sezioni corrispondente alla risoluzione assiale del dispositivo. Immettere il valore dello spessore corneale in Numero di fette. Rivedere i parametri e il tempo di acquisizione.E quando sei soddisfatto, premi OK per avviare l'acquisizione. Durante l'acquisizione, evitare il contatto con il tavolo su cui è posizionato il microscopio. Per valutare lo spessore dello strato stromale e di Bowman, misurare le distanze delle sezioni trasversali corneali.Ad esempio, aggiungete cinque punti equidistanti nella sezione trasversale come descritto nel testo manuscritto. Tracciare una linea tra due punti di distanza nota in base al campo visivo predefinito. Quindi vai alla scheda Analizza e seleziona Imposta scala.Immettere la distanza nota e l'unità di lunghezza nei campi appropriati. Impostate su 1024 pixel o 780 micrometri e fate clic su OK. Tracciare una linea tra due punti di distanza sconosciuta e leggere la lunghezza o la distanza misurata direttamente dalla barra di stato. Registrare la media e il coefficiente di variazione.Fare clic sulla scheda Immagine e selezionare Reslice Z in Stacks per determinare la densità dei cheratinociti. Questo sommare le immagini stromali en face in gruppi di sette per produrre fette di spessore comparabile. Per ulteriori analisi, includere tutte le fette en face disponibili per lo stroma più anteriore, 15 immagini per lo stroma anteriore, cinque immagini per lo stroma medio e cinque immagini per lo stroma posteriore.Su ogni immagine rivestita, seleziona una regione di interesse di 300 per 300 micrometri. Per migliorare la visualizzazione del nucleo, invertire l'immagine utilizzando Inverti nella scheda Modifica. Regola il contrasto e la luminosità facendo clic sulla scheda Immagine e passando a Luminosità-Contrasto.Per contare manualmente i nuclei delle cellule, vai su Plugin e vai a Contatore celle nella scheda Analizza. Premere Inizializza, quindi selezionare un tipo di contatore. Quindi conta i nuclei cellulari facendo clic sulle caratteristiche ovali scure nell'immagine invertita, considerando quelle che atterrano su un bordo dell'immagine solo per due dei quattro lati dell'immagine.La cornea del donatore umano selezionato era gonfia dopo la conservazione in terreno di coltura d'organo, fornendo un modello fisiopatologico della cornea edematosa e impedendo l'acquisizione di immagini attraverso l'intero spessore corneale a causa della limitata profondità di penetrazione. Il trasferimento al terreno di coltura d'organo integrato con destrina, ha ridotto il gonfiore e ha provocato cornee del donatore di spessore normale. Le cornee malate sono state riconosciute dai cambiamenti morfologici e dalle caratteristiche stromali tipiche, tra cui una diminuzione dello spessore stromale variabile o dello strato di Bowman.La valutazione della densità dei cheratinociti e della riflettività stromale ha ulteriormente aiutato nell'analisi istologica e nella differenziazione dei tessuti corneali normali da quelli patologici con microscopia a coerenza ottica a campo intero, che va oltre le capacità dei sistemi di tomografia a coerenza ottica clinica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi istologica qualitativa e quantitativa dello stroma corneale che consente di differenziare la malattia dai normali tessuti corneali umani.

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