Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave in biologia cellulare e biochimica, come ad esempio il modo in cui l'assemblaggio dinamico di proteine e complessi proteici controlla le vie di segnalazione e il comportamento cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare in modo specifico due proteine interagenti, escludendo singole proteine non complessate e partner di legame concorrenti. Sebbene utilizziamo questo metodo per fornire informazioni sulla dimerizzazione ricettiva della tirosin-chinasi nel carcinoma mammario, può essere applicato anche a qualsiasi altro contesto fisiologico o malattia.

Abbiamo avuto un'idea per questo metodo quando ci siamo resi conto che il nanocorpo GFP riconosceva l'epitopo tridimensionale della GFP e di altre proteine fluorescenti. Per iniziare, aggiungi 150 nanogrammi di vettore di ingresso, 150 nanogrammi di vettore di destinazione e otto microlitri di tampone TE, a un tubo da 0,2 millilitri. Quindi aggiungere due microlitri di ricombinasi e ZiMex e centrifugare brevemente i due.

Incubare la reazione per un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere un microlitro di soluzione di proteinasi K e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti per fermare la reazione. Quindi, scongelare le cellule competenti per lo shock termico sul ghiaccio. E trasferire 50 microlitri di cellule in un tubo di polipropilene a fondo tondo da 14 millilitri.

Aggiungere un microlitro di prodotto di reazione alle cellule e mescolare delicatamente. Incubare le cellule per 20 minuti con ghiaccio. Quindi lo shock termico delle celle in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 45 secondi prima di rimettere le celle nel ghiaccio.

Aggiungere un millilitro di terreno LB alle cellule. E incubare il campione con agitazione per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi, impiattare la trasformazione su una piastra di agar da 10 centimetri con ampicillina e incubare a 37 gradi Celsius per una notte.

Per iniziare la purificazione del plasmide, aggiungere ampicillina e 100 millilitri di terreno LB in un grande pallone conico. Quindi utilizzare un anello di inoculazione per rimuovere una singola colonia dalla piastra di agar. Immergere l'ansa di inoculazione in terreno LB e mescolare brevemente, quindi coprire la parte superiore del pallone con un foglio di alluminio e incubarlo per una notte, a 37 gradi Celsius con agitazione.

Da qui purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit standard di purificazione del DNA plasmidico Maxiprep, prima di procedere con la trasfezione. Innanzitutto, semina le cellule HEK 293T in piastre di 10 centimetri, contenenti 10 millilitri di DMEM. Quindi diluire 2,5 microgrammi di ciascun vettore di complementazione a fluorescenza bimolecolare in 500 microlitri di tampone di trasfezione.

Aggiungere 10 microlitri di reagente di trasfezione e agitare la miscela per 10 secondi. Quindi centrifugare brevemente i campioni e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungi la miscela di trasfezione del DNA goccia a goccia nel piatto.

Quindi incubare i campioni per otto-24 ore. Preparare un tampone di lisi cellulare e un tampone di lisi cellulare integrato come indicato nel protocollo di testo. Quindi lavare due volte le celle con PBS ghiacciato.

Aspirare il PBS e aggiungere un millimetro di tampone di lisi cellulare integrato con ghiaccio freddo. Quindi, metti il piatto sul ghiaccio e incuba per cinque minuti. Quindi utilizzare un raschietto per rimuovere le cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga refrigerata.

Centrifugare la provetta a 18.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius, per rimuovere i detriti cellulari, quindi trasferire il surnatante trasparente in una nuova provetta da microcentrifuga. Lavare un volume appropriato di perle di agarosio in un millilitro di PBS, quindi centrifugare le perle a 300 volte la gravità e rimuovere con cura il surnatante. Quindi aggiungere 20 microlitri di perle di agarosio a ciascun campione.

E incubare a quattro gradi Celsius per due ore, con rotazione end-to-end. Centrifugare le perle a 300 volte la gravità e lavarle tre volte nel tampone di lisi cellulare. Quindi risospendere le perle lavate in 50 microlitri di tampone diluito.

Infine, riscalda i campioni a 95 gradi Celsius per due o tre minuti. In questo studio, il metodo BiCAP viene utilizzato per osservare un'interazione positiva per diversi tipi di proteine circa 16 ore dopo la co-trasfezione di cellule HEK293T. La microscopia confocale viene utilizzata per osservare la dimerizzazione della RTKERBB2 sulla membrana plasmatica e il legame dell'ubiquitina alla ligasi E3 UBR5.

Dopo la purificazione per affinità con il nanocorpo GFB, nel campione di co-trasfezione possono essere rilevate solo la proteina di controllo di Venere a lunghezza intera e le proteine marcate V1 e V2 interagenti. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di ottimizzare il posizionamento del tag di complementazione della fluorescenza bimolecolare e l'estremità C-terminale o N-terminale della proteina di interesse. Questo è necessario per osservare un'interazione proteina/proteina positiva.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la tecnica BiCAP e di come applicarla all'interazione proteica di tuo interesse. Seguendo questa procedura, potrebbero essere impiegate molte delle tecniche di caratterizzazione a valle, come ChIPseek per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come la dimerizzazione dei fattori di trascrizione controlli il legame del DNA.