Name: Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri il metodo BiCAP per isolare specificamente proteine interagenti in complessi cellulari, escludendo proteine non complessate e partner competitivi. Questa tecnica avanzata fornisce approfondimenti sulle dinamiche delle interazioni proteiche in vari contesti biologici e patologici.

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RDC è un Cancer Institute NSW Fellow e D.N.S era precedentemente un Cancer Institute NSW Fellow. I risultati di ricerca presentati in questo manoscritto sono stati finanziati da Cancer Institute NSW (13/FRL/1-02 e 09/CDF/2-39), NHMRC (progetto Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), NSW Office of Science e ricerca medica, famiglia ospite Fellowship e Mostyn Family Foundation. J.f.h. e R.S. sono stati destinatari di un australiano premio post-laurea.

1. plasmide clonazione
Nota: Per generare vettori plasmidici con i tag V1 o V2 fusi al C-terminale del gene di interesse o del N-terminale, BiFC vettori di destinazione sono stati depositati con Addgene [tag N-terminale: del pDEST-V1-ORF (#73635), del pDEST-V2-ORF (#73636). Prodotto tag: C-terminale: del pDEST-ORF-V1 (#73637), del pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Il gene/s di interesse dovrà essere nella ricombinazione specifici vettori entrata compatibile (cioè, pDONR223 o pENTR221), la clonazione senza codoni di stop, per procedere con la clonazione. Molti cloni compatibili sono già disponibili all'interno di varie collezioni di plasmide, tra cui la collezione del genoma dei mammiferi (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
<ol><li>Eseguire una reazione di ricombinazione per inserire il gene di interesse tra i siti di attR del vettore di destinazione BiFC appropriato:<ol>
<li>In un tubo di 0,2 mL, aggiungere 150 vettoriale di voce ng, 150 ng BiFC destinazione vettore e 8 µ l di tampone di TE (pH 8.0).</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l ricombinasi enzima mix (Vedi Tabella materiali). Mescolare bene e centrifugare.</li>
		<li>Incubare la reazione per 1 h a temperatura ambiente o a 16 ° C durante la notte.</li>
		<li>Fermare la reazione aggiungendo 1 µ l di soluzione di proteinasi K e incubare a 37 ° C per 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasformare cellule calore-shock-competenti (Vedi Tabella materiali) con il prodotto di reazione di LR: Nota: Qualsiasi ceppo base sarà utilizzato presumibilmente a questo punto, purché non contenga l'antitossina Ccdb, che impedirebbe la selezione specifica di plasmidi contenenti l'inserto.<ol>
<li>Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio e trasferire 50 µ l di cellule in una provetta di polipropilene 14 mL a fondo tondo.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di prodotto di reazione alle celle e mescolare delicatamente. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
		<li>Colpo in bagnomaria a 42 ° C per 45 di calore s. immediatamente restituito al ghiaccio per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di LB media e incubare con agitazione a 37 ° C per 1 h.</li>
		<li>Piastra la trasformazione su una piastra di agar di 10cm contenente ampicillina (100 µ g/mL) e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione del plasmide BiFC.<ol>
<li>Per purificare il plasmide da una colonia di individuo, aggiungere 100 mL di LB media in una beuta da grande e aggiungere ampicillina (100 µ g/mL). Per selezionare più colonie, aggiungere 5 mL di LB media provette in polipropilene di 14 mL a fondo tondo e aggiungere ampicillina (100 µ g/mL).</li>
		<li>Con un'ansa sterile inoculazione, scegliere una singola Colonia dalla piastra di agar. Mettere l'ansa per inoculazione in media LB e mescolare brevemente.</li>
		<li>Coprire la parte superiore del matraccio conico con carta stagnola e incubare a 37 ° C in agitazione per una notte.</li>
		<li>Produrre la transfezione grado plasmide DNA usando un standard maxiprep o midiprep DNA plasmidico kit di purificazione (Vedi Tabella materiali)10. Valutare la qualità del DNA di spettri di assorbanza. Nota: DNA deve avere un rapporto A260/A280 &gt; 1.8 e un rapporto A260/A230 &gt; 2.0. A questo punto, si consiglia di schermo più diverse colonie verificare efficiente espressione dell'inserto e tag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultura e transfezione delle cellule
Nota: Per la transfezione dei vettori BiFC è importante ottenere un'alta efficienza e transfezione relativamente omogenea. I vettori sarà probabilmente compatibili con qualsiasi reagente di transfezione standard, e le condizioni di transfezione dovrebbero essere ottimizzate di conseguenza. Per eseguire la spettrometria di massa, abbiamo solitamente coltura cellule all'interno di piatti 10 cm, anche se questo può anche essere proporzionalmente ridotta a piatti più piccoli o piastre per esperimenti che richiedono meno materiale.
<ol><li>Seme 1.0 × 106 HEK293T cellule in un 10 cm piatto con 10 mL di terreno DMEM, completati con 10% FBS e penicillina/streptomicina (1: 100).</li>
	<li>Diluire 2,5 µ g di ogni vettore di BiFC in 500 µ l di tampone di transfezione (Vedi Tabella materiali) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Miscela di vortice per 10 s, quindi brevemente centrifuga. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere la miscela di transfezione del DNA alla piastra, goccia a goccia. Incubare le cellule per una lunghezza sufficiente di tempo per le proteine di fusione BiFC interagire e per Venus pieghevole e maturazione fluoroforo, generalmente ~ 8-24 h. Nota: L'eccitazione di picco per Venus è 515 nm e il suo picco di emissione è 528 nm, anche se questo è prontamente visto utilizzando un microscopio a fluorescenza standard impostato per visualizzare la fluorescenza di GFP.</li>
</ol>3. preparazione del campione
<ol><li>
Lisati di raccolta
	<ol>
<li>Prima della raccolta lisato, preparare il tampone di lisi delle cellule [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) detergente non ionico (Vedi Tabella materiali)]. Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Immediatamente prima della raccolta, supplemento 10 mL di tampone di lisi delle cellule con l'inibitore della proteasi e fosfatasi inibitore (Vedi Tabella materiali). Tenere il tampone di lisi delle cellule completati sul ghiaccio.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte in PBS ghiacciata. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di gelida completati Buffer di lisi delle cellule. Mettere la teglia sul ghiaccio, garantendo che il buffer si sviluppa su tutta la superficie.</li>
		<li>Incubare in ghiaccio per circa 5 minuti, quindi utilizzare un raschietto di cella (vedere Tabella materiali) per raschiare le cellule e trasferimento in una microcentrifuga da 1,5 mL pre-refrigerati.</li>
		<li>Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione i raccolti lisato a 18.000 × g per 5 min a 4 ° C e trasferimento deselezionata surnatante in fresco per microcentrifuga. Nota: A questo punto il lisato può essere utilizzato immediatamente, oppure conservato a-80 ° C. Si consiglia inoltre di mantenere un'aliquota del greggio lisato in modo che l'efficienza di trasfezione e la purificazione di affinità può essere convalidato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione di affinità Nota: Il passaggio di isolamento BiCAP viene eseguita utilizzando la GFP nanobody coniugato ai branelli di agarosio (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Preparare le perle dell'agarosi lavando un volume adeguato (20 µ l per campione) + 10 µ l in eccesso in 1 mL di PBS. Centrifugare le perline a 300 x g e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di ciascun campione lisato.</li>
		<li>Incubare i campioni per 2 h a 4 ° C con rotazione to-end. Nota: A questo punto i campioni possono essere preparati per SDS-PAGE e western blotting o analisi di spettrometria di massa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di BiCAP eluente per macchiarsi occidentale.
	<ol>
<li>Centrifugare le perline a 300 x g e lavare tre volte in tampone di lisi delle cellule.</li>
		<li>Risospendere le perline lavate in 50 µ l di tampone di campione opportunamente diluito (Vedi Tabella materiali) e riscaldare i campioni a 95 ° C per 2-3 min. Nota: I campioni preparati in questo modo possono essere conservati a-20 ° C per diversi mesi.</li>
		<li>Eseguire SDS-PAGE e western blotting11 per il tag V1 e V2 Tag (Vedi tabella dei materiali), come così come qualsiasi altre proteine di interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di BiCAP eluente per spettrometria di massa. Nota: Per l'analisi mediante spettrometria di massa (IFQ) privo di etichetta quantitativa si raccomanda di preparare i campioni in almeno quadruplicare per garantire potenza statistica robusta.<ol>
<li>Centrifugare le perline a 300 x g e lavare sei volte in tampone di lisi delle cellule senza detersivo. Ciò è necessario per rimuovere l'eccesso di proteine e anche il detersivo che interferisca con l'analisi di spettrometria di massa. Procedere al passaggio successivo immediatamente, o memorizzare le perline a-80 ° C.
</li>
		<li>Tripsinizzano perline in 60 µ l tampone 1 [2 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), tripsina di 5 µ g/mL]. Consentire le perline per digerire a 27 ° C in un thermomixer agitazione a 800 RPM per 30 minuti.</li>
		<li>Brevemente centrifugare perline, poi raccogliere il surnatante e trasferimento per microcentrifuga (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Lavare le perle in 25 µ l tampone 2 [urea M 2, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol], al fine di ridurre le proteine associate.</li>
		<li>Piscina le perle e il surnatante in una microcentrifuga. Consentire la digestione si verifica durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Alchilare i campioni con l'aggiunta di 20 µ l di iodoacetamide (5 mg/mL in acqua ultrapura) per ogni campione e incubare al buio per 30 min.</li>
		<li>Inibire la digestione trattando ogni campione con acido di 1 µ l trifluoroacetico (TFA). Questo passaggio sarà anche acidificare i campioni in preparazione per la fase di ribaltamento.</li>
		<li>Costrutto C18 fase punte di impilamento 6 strati di estrazione in fase solida 1mm C18 (ottadecil) dischi di membrana (Vedi Tabella materiali) in un suggerimento di una micropipetta 200 µ l. Preparare una punta singola per ogni campione.</li>
		<li>Bagnare le punte di fase con metanolo ed equilibrare con 50 µ l 0.1% (v/v) l'acido trifluoroacetico (TFA), 80% (v/v) acetonitrile.</li>
		<li>Lavare le punte con 50 µ l 0.1% (v/v) TFA.</li>
		<li>I peptidi acidificati sulle punte di fase di carico e quindi eluire utilizzando 0.1% (v/v) TFA, acetonitrile 80% (v/v) in due passaggi.</li>
		<li>Evaporare i campioni utilizzando un concentratore a vuoto.</li>
		<li>Se necessario, archiviare secchi peptidi a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. spettrometria totale.
<ol><li>Risospendere i campioni in 15 µ l di acido formico al 5%, 2% acetonitrile (in acqua ultrapura).</li>
	<li>Accuratamente caricare 6 µ l in un piatto di LC e posto in un sistema HPLC di nanoLC (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Confezione un 20 cm, la colonna diametro interno 75 µM con 1,9 particelle di fase stazionaria C18 µm (Vedi Tabella materiali). Caricamento del peptide su ogni colonna 5-µ l.</li>
	<li>Eluire peptidi utilizzando un gradiente lineare di acetonitrile 250 nL/min oltre 140 min e introdurre di nanoelectrospray in uno spettrometro di massa ibrido Quadropole trappola lineare (LTQ) accoppiato al sistema HPLC nanoLC.</li>
	<li>Raccogliere i dati di MS tandem per gli ioni più abbondanti di top 10 per scansione sopra una pendenza 140 minuti di tempo. Randomizzare l'ordine di raccolta di dati e di interscambio con BSA eseguita tra ogni campione per minimizzare la distorsione temporale.</li>
</ol>5. analisi
<ol><li>Elaborare i dati raw MS utilizzando impostazione predefinita all'interno di MaxQuant versione software 1.2.7.4 e analizzare MaxQuant output utilizzando una versione modificata del flusso di lavoro analisi statistica Perseo in ambiente software R3. Nota: Il flusso di lavoro di analisi statistica da questo punto è riassunto nella Figura 2. Brevemente, intensità di IFQ delle proteine identificate utilizzando MaxQuant sono trasformati e filtrata seguita dalla normalizzazione e imputazione. Proteine d'interazione di coppie di dimero sono identificati dal confronto con un controllo di Venus, per escludere i raccoglitori di sfondo non specifici, con test t Benjamini-Hochberg correzione per i confronti multipli e dello studente. Qualità dei dati è confermata dal confronto di singoli istogrammi, regressione multipla e clustering gerarchico.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig2.jpg"> Figura 2: struttura del flusso di lavoro di analisi statistica. Diagramma di flusso della pipeline di analisi statistica utilizzata per analizzare le intensità di IFQ di proteine identificate dai dati di spettrometria di massa grezza elaborati utilizzando MaxQuant. Verde caselle: filtraggio, scatole blu: trasformazione/normalizzare/scalatura, marrone scatole: caselle di controllo di qualità, giallo di dati: finestre di analisi, grigio semi-quantitativa di esclusione/comparativa: analisi statistica. Questa figura è ripubblicato fromCroucher et al.3 ristampato con il permesso di AAAS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

BiCAP è un potente metodo per isolare i dimeri di proteina specifica escludendo i singoli componenti e loro concorrenti associazione partner3. BiCAP si basa sull'adattamento di un'analisi di complementazione di fluorescenza della proteina chiamata BiFC6. I metodi esistenti, tra cui saggi di legatura BiFC e vicinanza, sono stati ampiamente utilizzati per visualizzare e quantificare le interazioni della proteina in cellule vive7, ma non hanno fornito u...

Assiemi complessi della proteina sono un processo chiave nel mantenimento della specificità spatiotemporal di molti segnalazione vie1,2. Mentre la natura critica di questo ruolo normativo è ampiamente riconosciuta, c'è una mancanza di tecniche sperimentali disponibili a scrutare questi complessi. Maggior parte degli studi interattomica concentrarsi sulle interazioni con singole proteine, o l'arricchimento sequenza dei singoli componenti complessi. Qui presentiamo una tecnica per l'isolamento di un dimero di proteina specifica mentre escluse le moiety individuali di proteine componente, nonché complessi formati con associazione partner3in competizione. Abbiamo chiamato questa tecnica di purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP), come esso è una combinazione di una precedentemente esistenti analisi di complementazione frammento della proteina, bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC), con l'uso novello di un nanobody ricombinante conformazione-specifici verso GFP e suoi derivati (vedere tabella materiali).
Un'analisi di complementazione del frammento proteico tipico si basa sull'espressione di proteine "esca" e "preda" fusa per dividere frammenti di giornalisti come luciferase4, β-galattosidasi5o la proteina fluorescente verde (GFP)6 ( Figura 1A). Attraverso l'interazione delle proteine esca e preda, i domini di reporter di Spalato sono incoraggiati a ripiegare in una struttura funzionale, consentendo l'interazione dell'esca e preda di proteine per essere visualizzati o quantificato. BiCAP è stato adattato da una versione di questa tecnica che ha fatto uso di frammenti della variante GFP Venus. Analisi di complementazione di proteina fluorescente sono un metodo popolare per la visualizzazione di interazioni proteina-proteina in una cellula viva, ma fino ad ora sono state limitate a questo una funzione7. BiCAP rappresenta un progresso significativo a questo proposito, come questa tecnica consente non solo per la visualizzazione, ma anche l'isolamento e interrogatori dell'interazione proteina-proteina risultante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig1.jpg"> Figura 1: lo strutturale principale dietro la tecnica BiCAP. (A) uno schema che illustra il principale dietro mostrando complementazione bimolecolare fluorescenza le proteine 'esca' e 'preda' contrassegnati con il N-terminale V1 o V2 del C-terminale frammenti della proteina Venus full-length. (B) analisi strutturale di (ciano) l'interfaccia di interazione tra la GFP nanobody (verde) e Venere ricombinata, indicante la posizione delle V1 (grigio) e V2 (arancione) frammenti (PDB adesione 3OGO). Questa figura è ripubblicato fromCroucher et al.3 ristampato con il permesso di AAAS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
BiCAP tecnica fa uso di due frammenti non fluorescente di Venere (denominato V1 e V2) che associano un basso grado di affinità, a meno che non si verifica un'interazione tra i loro soci di fusione. In questo caso, i domini di due split ripiegare nella struttura funzionale del β-barilotto del fluoroforo (Figura 1B)6. L'innovazione chiave di BiCAP deriva dall'introduzione del ricombinante nanobody GFP, che riconosce un epitopo tridimensionale sul β-barilotto di GFP (e varianti come Venus) che è presente il fluoroforo correttamente ricombinato e piegato ( solo Figura 1B)8. Fondamentalmente, il nanobody GFP non viene associato a uno dei singoli frammenti di Venus. Questo facilita l'isolamento dei dimeri della proteina solo dopo che le due proteine hanno formato un complesso di loro spontanea volontà, portando a risultati più rappresentativi che quelle acquisite da metodi che fanno uso di interazioni chimicamente indotto, forzato9.
BiCAP è una tecnica potente che si concentra in particolare sui complessi della multi-proteina, che potenzialmente possono essere combinati con un numero di applicazioni a valle per migliorare il livello di dettaglio della nostra comprensione del ruolo che questi complessi svolgere nella trasduzione del segnale . Esso comprende anche la caratteristica importante di permettendo visualizzazione di proteine interazioni in situ. Ad oggi, BiCAP è stata dimostrata come un efficace metodo di analizzare Interactoma dei recettori tirosina chinasi (RTK) dimeri3, ma l'adattabilità di questo metodo significa che possa essere adottata in qualsiasi contesto di interazione della proteina.

<table><tbody><tr><td>Enzima LR Clonasi II Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12538120</td><td>Enzima ricombinasi necessario per il clonaggio Gateway (Fase 1) in vettori di destinazione pDEST BiFC</td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, grado PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene a fondo tondo da 14 mL</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Roche Diagnostics Australia</td><td>10835242001</td><td>Soluzione madre preparata a 100 &mu; g/mL in acqua distillata.</td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Promega Corporation</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep</td><td>Life Technologies Australia</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies Australia</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Life Technologies Australia</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di trasfezione jetPRIME</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME reagente di trasfezione</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP (inibitore della fosfatasi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>cocktail di inibitori della proteasi cOmplete, Mini, EDTA-free Roche</td><td></td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek Gmbh</td><td>gta-100</td><td>nanocorpo GFP accoppiato a perle di agarosio</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale GFP N-terminale&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-118P</td><td>Rileverà il tag V1 all'interno dei vettori BiFC Anticorpo</td></tr><tr><td>monoclonale GFP C-terminale</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>Rileverà il tag V2 all'interno dei vettori BiFC Tampone</td></tr><tr><td>campione</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>Integrato con 1 mL di &beta;-mercaptoetanolo.</td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado di sequenziamento</td><td>Promega Corporation</td><td>V5117h</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga LoBind</td><td>Point of Care Diagnostics</td><td>0030 108 116</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149-5G</td><td>Preparato a 5 mg/mL in acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico - Thermo Fisher di grado sequanale</td><td></td><td>10628494</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore estrazione in fase solida Dischi C18 (ottadecile) - 4,7 cm</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-386-2</td><td>Per preparare le punte del palco, tagliare i dischi da 1 mm utilizzando un perforatore di dimensioni adeguate. In alternativa, è possibile acquistare anche punte di tappa pre-preparate, vedi sotto.</td></tr><tr><td>C18 Punte per tavoli, 10 &; micro; Letto a L</td><td>Thermo Fisher</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico OPTIMA per LC/MS grado 50mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>FSBA117-50</td><td></td></tr><tr><td>1.9 &mu; m Particelle C18 ReproSil</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.</td><td>Particelle in fase stazionaria</td></tr><tr><td>Acetonitrile OPTIMA LC/MS grado&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>FSBA955-4</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC HPLC&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergente non ionico (100%)</td></tr><tr><td>Celle DH5&alpha; Celle</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Celle competenti per shock termico</td></tr></tbody></table>

dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (bicap)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

L'assemblaggio dei complessi della proteina è un meccanismo centrale sottostante la regolazione di molte vie di segnalazione delle cellule. Degli obiettivi principali della ricerca biomedica è decifrare come questi complessi proteici dinamica agiscono per integrare i segnali provenienti da più origini per dirigere una specifica risposta biologica, e come questo diventa deregolamentato in molte impostazioni di malattia. Nonostante l'importanza di questo meccanismo biochimico chiave, c'è una mancanza di tecniche sperimentali che possono facilitare la deconvoluzione specifico e sensibile di questi complessi di segnalazione multi-molecolari.
Qui questa lacuna viene risolto mediante la combinazione di un'analisi di complementazione della proteina con un nanobody conformazione-specifici, che abbiamo chiamato purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP). Questa tecnica novella facilita l'isolamento specifico e caratterizzazione proteomica a valle di qualsiasi coppia di proteine interagenti, ad esclusione di ONU-complessato singole proteine e complessi formati con concorrenti partner di legame.
La tecnica di BiCAP è adattabile a una vasta gamma di analisi sperimentale a valle, e l'alto grado di specificità offerto da questa tecnica permette più sfumate indagini nelle meccaniche di assiemi complessi della proteina che è attualmente possibile utilizzando tecniche di purificazione di affinità standard.

Segue l'uso della clonazione di ricombinazione per generare delle V1 e V2 tagged geni di interesse con i plasmidi del pDEST BiFC, co-transfezione di due plasmidi contenenti una coppia di proteine interagenti comporterà la generazione di un segnale fluorescente Venus dopo circa 8-24 ore. In assenza di un segnale positivo, che è possibile che l'interazione di proteine non può che si verificano a causa della scelta della linea cellulare, un'efficienza di trasfezione bassa o che l'orientament...

Questo manoscritto descrive il protocollo per purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP). Questo metodo novello facilita l'isolamento specifico e caratterizzazione proteomica a valle di qualsiasi due proteine interagenti, mentre escluse ONU-complessato singole proteine, nonché complessi formati con concorrenti partner di legame.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave in biologia cellulare e biochimica, come ad esempio il modo in cui l'assemblaggio dinamico di proteine e complessi proteici controlla le vie di segnalazione e il comportamento cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare in modo specifico due proteine interagenti, escludendo singole proteine non complessate e partner di legame concorrenti. Sebbene utilizziamo questo metodo per fornire informazioni sulla dimerizzazione ricettiva della tirosin-chinasi nel carcinoma mammario, può essere applicato anche a qualsiasi altro contesto fisiologico o malattia.Abbiamo avuto un'idea per questo metodo quando ci siamo resi conto che il nanocorpo GFP riconosceva l'epitopo tridimensionale della GFP e di altre proteine fluorescenti. Per iniziare, aggiungi 150 nanogrammi di vettore di ingresso, 150 nanogrammi di vettore di destinazione e otto microlitri di tampone TE, a un tubo da 0,2 millilitri. Quindi aggiungere due microlitri di ricombinasi e ZiMex e centrifugare brevemente i due.Incubare la reazione per un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere un microlitro di soluzione di proteinasi K e incubare a 37

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La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

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Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il...

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In questo video, abbiamo dimostrato la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, BiCAP, per rilevare e isolare specifici dimeri proteici utilizzando anticorpi a dominio singolo specifici per la conformazione.

Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Scopri il metodo BiCAP per isolare specificamente proteine interagenti in complessi cellulari, escludendo proteine non complessate e partner competitivi. Questa tecnica avanzata fornisce approfondimenti sulle dinamiche delle interazioni proteiche in vari contesti biologici e patologici.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

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