Acido grasso 13C Isotopologue profilatura fornisce approfondimenti trasferimento trofico carbonio e metabolismo dei lipidi dei consumatori invertebrati marini

L'obiettivo generale di questo profilo isotologo è quello di seguire il trasferimento trofico degli acidi grassi alimentari nei consumatori di invertebrati, compresa la loro elaborazione e il metabolismo dei lipidi, come l'allungamento della catena o la beta ossidazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ecologia della rete alimentare, come ad esempio chi mangia chi, una domanda a cui non è facile rispondere in un ecosistema criptico, come il suolo. A dimostrare la tecnica sarà Dilara Simsek, studentessa del laboratorio della professoressa Liliane Ruess.

Per preparare microcosmi di plastica con coperchi ermetici, in una pentola di gesso, mescolare nove parti di gesso di Parigi e una parte di carbone attivo secco. Aggiungere 10 parti di acqua distillata e lasciare riposare il composto a temperatura ambiente senza mescolare per cinque minuti. Usa un cucchiaio da laboratorio per mescolare il composto in senso orario a velocità moderata per evitare bolle d'aria fino a raggiungere una consistenza densa e brodosa.

Quindi, versare il composto nei microcosmi ad un'altezza di circa un centimetro. Lisciare l'intonaco picchiettando delicatamente sul banco e facendo roteare. Si noti che i fori delle bolle d'aria e dei solchi, aggiunti con una spatola sterile, possono incoraggiare le Collembola fertili a deporre le uova lì.

Tuttavia, questo studio ha evitato buchi e solchi a favore di avere le stesse condizioni riproducibili. Dopo aver lasciato asciugare i microcosmi e averli inumiditi, utilizzare un tubo di aspirazione dotato di un piccolo pezzo di rete per trasferire 30 Collembola appena schiuse sulla base in gesso dei microcosmi. Fornisci circa la punta di un coltello di lievito di birra secco granulato come cibo e rinnovalo almeno due volte a settimana.

Pianificare tre repliche indipendenti per ogni giorno di campionamento. In questo studio, sono stati campionati i giorni da zero a sette e 14. Incubare i microcosmi al buio a 15 gradi Celsius e mantenere una temperatura costante, poiché gli acidi grassi vengono alterati dal metabolismo animale per soddisfare i requisiti di fluidità della membrana.

Per prelevare gli animali, subito dopo la pesatura secondo il protocollo di testo, trasferire con cura gli animali dai piatti della bilancia in provette di vetro da 10 millilitri. Utilizzare un millilitro di metanolo di grado HPLC per riempire le provette e conservarle a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Dopo aver preparato tre provette di vetro per ogni lotto di campioni e aver ridotto il metanolo applicato ai campioni per la conservazione, aggiungere cinque millilitri di solvente di estrazione monofase a ciascun campione, compresi i bianchi, ed estrarre i lipidi di Collembolan a temperatura ambiente agitando a 200 giri/min durante la notte.

Dopo aver estratto i campioni secondo il protocollo di testo, per eseguire l'analisi del modello di acidi grassi, precondizionare una colonna di acido di silice per ciascun campione aggiungendo due millilitri di cloroformio a ciascuna colonna. Dopo che il cloroformio è passato attraverso le colonne, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per rimuovere la fase inferiore di cloroformio dai campioni. Quindi, trasferiscilo in una singola colonna.

Utilizzare cinque millilitri di cloroformio per eluire i lipidi neutri, o NLFA, in frazioni in singoli recipienti di vetro. Quindi, utilizzare 10 millilitri di acetone per eluire i glicolipidi e cinque millilitri di metanolo per eluire gli acidi grassi fosfolipidi, o PLFA. Dopo l'estrazione, trasferire le provette aperte NLFA e PLFA in un concentratore rotazionale a vuoto, o RVC, e far evaporare i campioni a 60 gradi Celsius in un vuoto di 24 hPa per circa 90 minuti o fino a quando non si asciugano.

Dopo aver isolato e lavato gli esteri metilici degli acidi grassi, o FAME, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per trasferire la fase superiore contenente lipidi in una fiala di campione per cromatografia in vetro dotata di un setto di teflon. Incapsulare la fiala e conservarla a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Per identificare i FAME nei campioni NFLA e PLFA, su un GC-FID, impostare una sequenza con il rispettivo software dello strumento secondo le istruzioni del produttore.

Iniziare la sequenza con le miscele standard esterne, seguite dai campioni. Ci sarà un leggero ritardo nel tempo di eluizione degli acidi grassi dalla colonna GC ad ogni corsa. Includere uno standard ogni 10 cicli nella sequenza di campionamento o utilizzare il blocco del tempo di ritenzione per l'acido palmitico.

Impostare il programma e calcolare l'nmol di acido grasso secondo il protocollo di testo. Per effettuare l'analisi del carbonio-13 mediante profilazione isotopologa, utilizzare una colonna capillare polare, in quanto consente ulteriormente la separazione degli acidi grassi insaturi, anche con lo stesso numero di doppi legami. La scelta della colonna GC è fondamentale per i risultati, in quanto determina una buona rappresentazione dello ione molecola negli acidi grassi.

Per una colonna DB-23, avviare la temperatura del forno a 130 gradi Celsius e aumentarla di 6,5 gradi Celsius al minuto a 170 gradi Celsius. Seguire con un aumento di tre gradi Celsius al minuto a 203 gradi Celsius e mantenere la posizione per 1,9 minuti. Quindi, procedere con un aumento di 40 gradi Celsius al minuto a 230 gradi Celsius e mantenere la posizione per 8,3 minuti.

Impostare la temperatura della linea di trasferimento a 280 gradi Celsius. Dopo aver completato la configurazione del programma secondo il protocollo di testo, determinare l'incorporazione del carbonio-13 nello ione molecolare degli acidi grassi eseguendo prima una scansione iniziale per vedere cosa è presente. Quindi, eseguire il monitoraggio degli ioni selezionati, o SIM, sugli ioni appropriati e acquisire dati alle masse molecolari di interesse selezionando le finestre di scansione m/z o i gruppi SIM, che comprendono il tempo di picco cromatografico del rispettivo acido grasso.

In genere, monitorare da due a quattro ioni per analita e finestra temporale. Per lo sviluppo della massa, utilizziamo la conta ionica totale con standard di acidi grassi esterni. In base al tempo di ritenzione e agli ioni frammento, vengono scelti i segmenti di tempo.

Rileva lo ione molecolare, M più, del rispettivo acido grasso e di tutti i suoi isotopologi, M più uno, M più due, eccetera. Assegna il flusso trofico di carbonio, la posizione di incorporazione del carbonio-13 e calcola l'arricchimento del carbonio-13 secondo il protocollo di testo. Questa figura presenta uno spettro SIM-MS di acido palmitico puro da 16 a zero.

L'abbondanza naturale di carbonio-13 in questo composto diventa rilevabile dalla presenza di M più uno e M più due isotopologi oltre allo ione molecolare M più. In confronto, questo spettrogramma rappresenta l'intero acido palmitico marcato. Qui, la sola occorrenza dello ione M plus 16 riflette l'elevata purezza del composto marcato sinteticamente.

Le seguenti scansioni SIM sono derivate da quattro acidi grassi dominanti nella frazione PLFA di Heteromurus nitidus al primo giorno di campionamento dopo la marcatura. L'assimilazione della molecola marcatore marcata in acido palmitico diventa visibile dall'abbondanza dell'isotologo M più 16, in quanto rappresenta l'intero acido grasso marcato. Inoltre, è possibile assegnare una desaturazione da 16 a zero o un allungamento più desaturazione.

In tal modo, la rilevazione di isotopologi più grandi di M più 16, ad esempio M più 17 e M più 18, dimostra l'allungamento a catena del precursore marcato 16 a zero mediante l'uso di frammenti C2-13. Qui vengono presentate le porzioni relative degli ioni M più uno a M più tre e M più 16 a M più 20 dei cinque NLFA e PLFA più marcati da Protaphorura fimata, stimate il giorno zero e il giorno uno. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che i consumatori comprendono naturalmente alcuni isotopi C.

Questa quantità deve essere determinata in esperimenti di controllo senza dieta etichettante. Questo segnale C naturale viene sottratto come sfondo dai modelli di etichetta. Non dimenticare che lavorare con il solvente può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere precauzioni.