Name: Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dellorgano nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Scopri un approccio in due fasi per studiare l'organogenesi nel modello aviario, combinando coltura in vitro di 48 ore e innesto sulla membrana corioallantoide. Questo metodo permette di analizzare le fasi iniziali e tardive della formazione del timo e delle ghiandole paratiroidi.

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Gli autori sono grati a António Cidadão, Isabel Alcobia e Leonor Parreira per la lettura critica del manoscritto, a Padma Akkapeddi per video narrazione, e a Vitor Proa dal servizio istologia dell'Instituto de Histologia e fare Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con sistema video e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. l'incubazione di quaglia fertilizzato e uova di gallina
<ol><li>Incubare uova di pollo (Gallus gallus) fertilizzato e quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) per 3 e 8 giorni, rispettivamente.<ol>
<li>Sistemare le uova intere con camera d'aria (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto in un incubatore a 38 ° C.</li>
		<li>Per eseguire questo esperimento, utilizzare uova di quaglia circa 20 e 40 uova di gallina. Nota: Questi numeri dovrebbero essere raddoppiati quando si stabilisce la procedura per la prima volta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento di quaglia embrionale regione contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali
Nota: Eseguire uovo procedure di manipolazione in condizioni sterili, utilizzando materiali e strumenti sterilizzati e cappa a flusso laminare orizzontale.
<ol><li>Preparare una ciotola di vetro di borosilicato grande circa 3/4 riempito con soluzione fredda tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Aprire un uovo di quaglia dopo 3 giorni di incubazione toccando la shell e taglio di un'apertura circolare sul lato opposto della sua estremità smussata con forbici curve. Con attenzione rimuovere i pezzi di guscio e trasferimento dell'embrione nella ciotola di vetro riempita con PBS freddo.</li>
	<li>Tenere l'embrione di quaglia (q) all'E3 (qE3) (la fase di quaglia corrispondono alla HH-fase 21 del pollo) con l'aiuto di pinzette sottili. Fare un taglio nella membrana vitellina avvolgente il tuorlo utilizzando forbici curve. Continuare a tagliare intorno ed esternamente alla circonferenza dei vasi extra-embrionali.</li>
	<li>Trasferimento dell'embrione ad una piccola ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo con l'aiuto di pinzette sottili. Lavare accuratamente l'embrione dal restante tuorlo allegato.</li>
	<li>Utilizzare una schiumarola per trasferire l'embrione in un bicchiere di 100mm di Petri con base nera (Vedi Tabella materiali) contenente 10 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Posto di Petri sotto un microscopio stereoscopico. Nota: Da questo punto in avanti, eseguire le procedure di microchirurgia sotto un microscopio stereoscopico per ingrandimento progressivo. Come fonte di illuminazione, si consiglia di utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.</li>
	<li>Tenere l'embrione alla parte inferiore della piastra con spilli entomologici sottili. Posizionare i quattro perni formando una forma quadrata della regione extra-embrionali.</li>
	<li>Rimuovere le membrane extra-embrionali della regione cefalica con l'aiuto di pinze sottili e mettete un perno di quinto ci. Nota: Se l'embrione è correttamente posizionato, quindi la vescicola otica, il tubo di cuore e 1st, 2nde archi pharyngeal 3rd (PAs) dovrebbero essere visibili.</li>
	<li>Sezionare la regione embrionale di interesse, vale a dire, il 3rd e regione di Arco faringeo 4th (3/4PAR), usando le forbici Wecker occhio.<ol>
<li>Iniziare a tagliare longitudinalmente e parallelamente all'asse dell'embrione, tra la zona di tubo somite/neurale e la PAs.</li>
		<li>Rimuovere il tubo posizionato ventralmente cuore tagliandolo. Tenendo le forbici nella stessa posizione, ruotare la piastra di Petri per riposizionare l'embrione secondo la direzione del taglio.</li>
		<li>Taglio tra la 2nd e 3rd PAs e sotto il 4th PA</li>
		<li>Staccare le membrane rimanenti dal 3/4PAR con l'aiuto di pinzette sottili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirare l'organi isolati (il 3/4PAR) e trasferire loro di un piatto di vetro 3/4 riempita con PBS freddo utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL. Nota: D'ora in avanti, tessuti possono essere coltivato in vitro fino a 48 ore o immediatamente essere innestati la CAM di un embrione di pollo a E8.</li>
	<li>Tenere il piatto di vetro contenente l'isolato 3/4PAR sul ghiaccio durante la preparazione del test in vitro .</li>
</ol>3. in Vitro organotipiche Assay: cultura della regione embrionale contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali
<ol><li>Preparare il terreno di coltura con RPMI-1640 supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Nota: Solubili farmacologici reagenti possono essere aggiunti al supporto (ad esempio, LY-411.575 (Ly) e di-benzazepine o cyclopamine e vismodegib, per inibire la tacca e segnalazione percorsi, rispettivamente di Hedgehog (Hh). Per questo test, utilizzare 50-200 nM di Ly o 5-15 µM di-benzazepine per inibire la tacca di segnalazione in 3 / 4PAR. uso 20 µM di cyclopamine o 10 µM di vismodegib per inibire signaling di Hh in 3/4PAR5.</li>
	<li>Preparare la coltura in vitro del explant 3/4PP in una piastra a 6 pozzetti.<ol>
<li>Riempire un pozzo dalla piastra 6-pozzetti con 5 mL di terreno di coltura. Posizionare un 24 mm inserto di membrana in policarbonato (Vedi Tabella materiali) sul bene con l'aiuto di pinzette sottili.</li>
		<li>Sotto lo stereomicroscopio, trasferire l'espianto 3/4PAR dal piatto di vetro alla superficie della membrana facendo scorrere delicatamente con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungi fino a sette espianti per inserto di membrana. Procedere al punto 3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, cultura espianti in filtri a membrana di galleggiamento.<ol>
<li>Preparare una capsula di Petri con 5 mL di terreno di coltura da 35 mm. Con l'aiuto di pinze sottili, float una membrana filtro (Vedi Tabella materiali) e mantenere una superficie asciutta a contatto con l'aria.</li>
		<li>Sotto lo stereomicroscopio, trasferimento explant 3/4PAR dal piatto di vetro per la membrana filtrante in scorrimento delicato con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungere fino a 8 espianti per filtro a membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare con attenzione gli espianti preparati ai punti 3.2 e 3.3 in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Dopo un periodo di incubazione di 48 h, rimuovere la piastra a 6 pozzetti e il 35mm di Petri dall'incubatrice.<ol>
<li>Raccogliere gli espianti coltivati dall'inserto di membrana della piastra 6 pozzetti.<ol>
<li>Consente di aggiungere l'inserto di membrana PBS a temperatura ambiente (TA).</li>
			<li>Staccare gli espianti dalla membrana irrigando vigoroso utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.</li>
			<li>Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti coltivati per un piatto di vetro 3/4 pieni di PBS a TA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Allo stesso modo, è possibile raccogliere gli espianti coltivati dal filtro membrana galleggiante nella capsula di Petri in 35 mm.<ol>
<li>Trasferire la membrana filtrante con una pinza sottile per un nuovo piatto di Petri 35 mm riempito con PBS a TA.</li>
			<li>Staccare gli espianti della membrana filtrante vigoroso pipettaggio usando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.</li>
			<li>Con l'aiuto di pinzette sottili, scarico del filtro a membrana privo di espianto dopo conferma che nessun espianti è rimasto collegato ad esso.</li>
			<li>Con una spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti a un piatto di vetro riempito con PBS a TA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire 1 mL di un reagente per isolamento di RNA totale gli espianti coltivati con una spatola e utilizzare per gli studi di espressione genica. Attenzione: L'esposizione a questo reagente (Vedi Tabella materiali) può essere un pericolo per la salute gravi. Indossare guanti, indumenti e occhiali protettivi appropriati. Seguire le istruzioni di manipolazione e leggere le schede di sicurezza fornite dal produttore.</li>
	<li>In alternativa, dell'innesto di tessuti coltivati sul CAM di embrioni di pollo a E8. Seguire al passaggio 4.</li>
</ol>4. preparazione della camma
<ol><li>Rimuovere le uova di pollo con 8 giorni di sviluppo embrionale dall'incubatrice. Nota: Le uova sono state incubate con camera d'aria rivolto verso l'alto a 38 ° C in un incubatore.</li>
	<li>Coprire l'estremità smussata dell'uovo con nastro in plastica trasparente per impedire la caduta nella camera d'aria di pezzi del guscio. Toccare la shell e tagliare un'apertura circolare nell'uovo con forbici curve. La camera d'aria deve essere visibile.</li>
	<li>Rimuovere con cautela la membrana bianca della camera d'aria con le pinzette sottili. CAM è quindi visibile e accessibile per il trapianto di tessuto ectopico. Nota: Non utilizzare PBS per idratare la CAM, prima o dopo il trapianto, poiché promuove la PBS scorrevole e smarrimento degli espianti. Se la membrana si asciuga, scartare l'uovo.</li>
</ol>5. l'innesto degli espianti coltivati sul CAM
<ol><li>Creare piccole lesioni vascolari/ferite nei vasi più piccoli della camma con un microscalpel in un supporto. Nota: Utilizzare la punta di una pipetta di Pasteur per rimuovere il sangue per capillarità in caso di sanguinamento in eccesso.</li>
	<li>Utilizzare una spatola e sottile forcipe per trasferire explant coltivate per l'area ferita della camma.</li>
	<li>Tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente più grande l'espianto e posizionarlo sulla parte superiore l'espianto. Nota: La carta da filtro consente di tracciamento della posizione di espianto dopo il suo sviluppo nel CAM. Inoltre, permette una consegna giornaliera del farmaco per l'espianto durante in ovo lo sviluppo, se necessario (descritto al punto 5.6).</li>
	<li>Sigillare la finestra uovo con nastro in plastica trasparente e identificarlo con una matita di carbone di legna. Nota: Il nastro di plastica protegge l'embrione dalla disidratazione durante il periodo di incubazione.</li>
	<li>Incubare l'uovo manipolato per 10 giorni in un incubatore a 38 ° C. Seguire al passaggio 6.</li>
	<li>Passaggio facoltativo: Amministrazione della droga quotidiana durante il periodo di incubazione.<ol>
<li>Per accedere al filtro, sollevare parzialmente il nastro di plastica. Aggiungere 100 µ l di soluzione della droga, goccia a goccia, in cima alla carta. Richiudere e sigillare la finestra e inserire l'uovo indietro nell'incubatore umidificato a 38 ° C. Nota: Per questa analisi, la dose di 20 µM di cyclopamine inibirà signaling di Hh durante in ovo sviluppo5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ectopica organo formazione nel CAM dopo 10 giorni di sviluppo In Ovo
<ol><li>Dopo 10 giorni di incubazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice ed estrarre delicatamente il nastro di plastica.</li>
	<li>Tagliare il CAM intorno alla regione di filtro utilizzando forbici curve e trasferimento explant CAM-derivati con carta da filtro per un piccolo bicchiere ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo.</li>
	<li>Con l'aiuto del forcipe sottile trasferire explant CAM-derivato a un 100 mm di Petri con base nera contenente 10 mL di PBS. Rimuovere delicatamente la carta da filtro e l'eccesso di membrana utilizzando Wecker occhio forbici e pinzette sottili.</li>
	<li>Trasferimento CAM-explant a soluzione fissante (3,7% PFA in PBS) con una schiumarola. Eutanasia gli embrioni di pollo senza rimuoverli dall'uovo facendo un taglio preciso nella regione del collo dell'embrione con l'aiuto di forbici grandi.</li>
	<li>Valutare l'insorgenza di organo nelle sezioni della paraffina di espianti di CAM-derivato dall'esame immuno-istochimico e dall'istologia convenzionale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un aspetto cruciale per il successo di questo metodo è la qualità del pollo e quaglia uova. Considerando i periodi di incubazione lungo, particolarmente durante il dosaggio in ovo , una buona qualità di uova di gallina migliora la redditività prezzi (fino al 90%) entro la fine della procedura. Per raggiungere questo obiettivo, test di uova provenienti da fornitori diversi. Incubare uova unmanipulated per lunghi periodi (fino a 16-17 giorni) e controllare il loro sviluppo. Per essere considerato un batch di buona...

Embrioni aviari sono stati ampiamente utilizzati negli studi di biologia dello sviluppo seminale. I principali vantaggi del modello aviaria includono la possibilità di aprire l'uovo, l'accesso relativamente facile per l'embrione e la possibilità di eseguire micromanipolazione. Alcuni esempi comprendono il sistema classico pollo quaglia chimera per lo studio delle cellule destino1, applicazione di specifici fattori di crescita per l' embrione2e la crescita di strutture cellulari ectopici in CAM1,3, 4.
Per ottenere nuove intuizioni distinte fasi di formazione dell'organo, recentemente abbiamo sviluppato un metodo che combina le tecniche di innesto con la manipolazione in vitro di tessuti embrionali5. L'approccio in due fasi consente la discriminazione e l'esplorazione di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, che spesso sono limitate a causa di interazioni altamente dinamico e complesso tessuto2. Inoltre, la mancanza di idonei indicatori di tessuto-specifici spesso limita l'uso di organismi geneticamente modificati6modelli animali. Questo nuovo metodo dell'approccio in due fasi supera di gran lunga tali limitazioni.
Per studiare le prime fasi di formazione di organo, nel primo passaggio, territorio embrionali quaglia comprendente il rudimento di organo prospettico è isolato e coltivato in un sistema in vitro organotipiche per 48 h. Durante questo periodo, la modulazione farmacologica di specifiche vie di segnalazione può essere eseguita con l'aggiunta di farmaci per il terreno di coltura5,7. Inoltre, i tessuti coltivati possono essere raccolti in qualsiasi fase della crescita in vitro e sondati per espressione genica (utilizzando metodi quali qPCR, microarrays, ecc.).
Nel secondo passaggio, 48 h-coltivati tessuti sono poi innestate sulla CAM di un embrione di pollo (c) al giorno embrionale (E) 8 (cE8) (Hamburger e Hamilton (HH)-fasi 33-35)8. La camma si comporta come un fornitore vascolare di sostanze nutritive e permette gas scambi1,3,4 ai tessuti innestati abilitazione relativo sviluppo in ovo per lunghi periodi di tempo. Questa fase sperimentale è particolarmente adatta per studiare fasi ritardate di organogenesi, come organi completamente formati possono essere ottenuti dopo 10 giorni di ovo sviluppo5,9,10,11 . Analisi morfologica viene facilmente eseguita dall'istologia convenzionale per confermare formazione adeguato organo e origine del donatore di cellule possa essere identificati mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, MAb Quaglia perinucleare (QCPN)). Durante il periodo di incubazione di CAM, innesti possono anche essere sviluppati in presenza di agenti farmacologici e raccolti in qualsiasi fase di sviluppo per valutare la progressione dell'organogenesi.
L'approccio in due fasi, descritta qui in profondità, è già stata impiegata in Figueiredo et al. 5 per esplorare lo sviluppo di primordio aviaria paratiroidale/timo comune. Di conseguenza, di seguito saranno presentate le peculiarità intrinseche dei territori embrionali e fasi di sviluppo partecipano l'organogenesi del timo e le ghiandole paratiroidali.
Il timo e le ghiandole paratiroidali epiteli, anche se funzionalmente distinte, derivano dall'endoderma dei sacchetti pharyngeal (PP)12. In aviaria, gli epiteli di questi organi provengono dal terzo e quarto PP endoderma (3/4PP)12, mentre nei mammiferi l'epitelio timico deriva dal 3PP e l'epitelio delle ghiandole paratiroidali deriva dal 3PP e 3/4PP nel topo e umano, rispettivamente di13,14.
Una delle prime fasi nella formazione di questi organi è l'emergere di timo discreto e paratiroidale domini nel primordio comune. In pollo, questi domini possono essere identificati di ibridazione in situ , con marcatori molecolari specifici, E4.515. Come procede lo sviluppo, questi rudimenti di organo individuare e separano dalla faringe, mentre una sottile capsula mesenchymal, formata da cellule derivate dalla cresta neurale, li circonda (a E5; HH-stage 27). In seguito l'epitelio timico è colonizzato da cellule progenitrici ematopoietiche (presso E6.5; HH-stage 30)12.
Come in studi classici di quaglia-pollo1,12, l'approccio in due fasi è particolarmente utile per studiare la formazione degli organi ematopoietici/linfoidi, vale a dire il timo5. Come la quaglia explant, con il rudimento dell'organo, si innesta nell'embrione di pollo prima della colonizzazione delle cellule progenitrici ematopoietiche, timo chimerico è formata con pollo ematica del progenitor una controparte epiteliali timiche quaglia di infiltrazione. Questo metodo è, pertanto, uno strumento utile per esplorare il contributo delle cellule ematopoietiche nello sviluppo del sistema emato/linfoide aviaria.

<table><tbody><tr><td>Uova fecondate di gallina (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portogallo</td><td></td><td>Allevamento di pollame&nbsp;</td></tr><tr><td>Uova fecondate di quaglia (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portogallo</td><td></td><td>Allevamento di uccelli&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in PP da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in PP da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in pyrex da 60 x 20 mm</td><td>Gruppo Duran</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in pyrex da 100 x 20 mm</td><td>Gruppo Duran</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Inserto membrana in policarbonato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Pozzetto da 24 mm con inserto a membrana in policarbonato con pori da 0,4 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro a membrana</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Filtro a membrana Isopore</td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciotole in</td><td></td><td></td> pyrex <td>dal supermercato</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL pipetta in plastica</td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in vetro</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; carta da filtro qualitativa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Carta da filtro</td></tr><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td> di plastica trasparente <td>dal supermercato&nbsp;</td></tr><tr><td>Citocheratina (pan; acida e basica, citocheratine di tipo I e II), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Ciclopamina idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Inibitore farmacologico della trasduzione del segnale Hh</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td> 10010023 Studi sullo sviluppo <td>dell'anticorpo</td><td></td></tr><tr><td>QCPN QCPN</td> Banca dell'ibridoma <td></td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, integratore GlutaMAX</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010</td><td></td> Bluesil RTV141A<td></td></tr><tr><td>/B Elastomero siliconico Kit 1,1 kg</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Per preparare la base posteriore per la capsula di Petri</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Inibitore farmacologico della segnalazione Notch</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026 Reagente per l'isolamento totale dell'RNA</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Pinze sottili</td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini, curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Forbici curve</td></tr><tr><td>Perni per insetti&nbsp;</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatola&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Cucchiaio da trapianto</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microbisturi</td></tr><tr><td>Moria Nichelato Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Holder</td></tr><tr><td>Moria Cucchiaio perforato</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Microscopio Leica M80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

L'embrione aviaria, come modello sperimentale, è stato di fondamentale importanza per le scoperte seminale in biologia dello sviluppo. Tra i diversi approcci, la formazione di quaglia-pollo chimere e l'uso della membrana corio-allantoidea (CAM) per sostenere lo sviluppo di tessuti ectopici risalgono al secolo scorso. Al giorno d'oggi, la combinazione di queste tecniche classiche con recenti metodologie in vitro offre nuove prospettive per esplorare ulteriormente la formazione dell'organo.
Qui descriviamo un approccio in due fasi per studiare e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi. Brevemente, la regione embrionale che contiene il territorio presuntivo dell'organo è isolata da embrioni di quaglia e coltivati in vitro in un sistema organotipiche (fino a 48 ore). Tessuti coltivati vengono innestate sulla CAM di un embrione di pollo. Dopo 10 giorni di sviluppo in ovo , organi completamente formati sono ottenuti da tessuti innestati. Questo metodo consente anche la modulazione delle vie di segnalazione dell'amministrazione regolare di agenti farmacologici e manipolazione genetica dei tessuti durante fasi inerenti allo sviluppo in vitro e in ovo . Inoltre, lo sviluppo di tessuti possa essere raccolti presso qualsiasi intervallo di tempo per analizzare il loro profilo di espressione genica (mediante PCR quantitativa (qPCR), microarrays, ecc.) e la morfologia (valutato con immunochimica e istologia convenzionale).
La procedura sperimentale descritta utilizzabile come strumento per seguire la formazione dell'organo di fuori dell'embrione aviaria, dalle prime fasi dell'organogenesi a completamente formate di organi funzionali.

Quanto sopra descritto dettagli del protocollo un metodo che permette la ricerca di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, spesso limitata da complesse interazioni cellulari e molecolari.
Questo metodo è stato precedentemente impiegato in Figueiredo et al. 5 per svelare il ruolo della tacca e Hh segnalazione nello sviluppo paratiroidale aviaria/timo comune primordio.
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Questo articolo fornisce un approccio aggiornato al sistema classico pollo quaglia chimera di studiare la formazione di organo, combinando romanzo procedure sperimentali in vitro e in ovo .

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un approccio in due fasi per studiare le fasi precoci e tardive dell'organogenesi combinando la manipolazione in vitro di tessuti embrionali con tecniche di innesto in ovulo utilizzando il modello aviario. In questo metodo il territorio embrionale che comprende il potenziale rudimento dell'organo viene isolato e coltivato in un sistema organotipico per 48 ore. Imitando lo sviluppo normale, questo approccio in vitro consente un facile accesso ai territori embrionali senza la necessità di marcatori molecolari specifici e consente la manipolazione sperimentale delle prime fasi di sviluppo nella formazione degli organi che si basano su modifiche spaziali altamente dinamiche e complesse interazioni tissutali.Quindi i tessuti coltivati vengono innestati sulla membrana corioallantoidea di un embrione di pollo. La membrana corioallantoidea si comporta come un fornitore vascolare di nutrienti e consente scambi di gas ai tessuti innestati consentendone lo sviluppo in ovo. Questo passaggio è particolarmente adatto per studiare le fasi avanzate dell'organogenesi, poiché gli organi completamente formati possono essere raggiunti dopo 10 giorni di sviluppo in ovo.Inoltre, gli agenti farmacologici possono essere somministrati durante lo sviluppo in vitro e in ovo, consentendo la modulazione delle vie di segnalazione in modo specifico per lo stadio di sviluppo. In definitiva, i tessuti in via di sviluppo possono essere raccolti in qualsiasi finestra temporale per valutare la progressione dell'organogenesi e per essere analizzati per l'espressione genica e le caratteristiche morfologiche. Seguendo la formazione degli organi al di fuori dell'embrione aviario, questo metodo può aiutare a chiarire le questioni chiave della biologia dello sviluppo, come l'identificazione dei segnali coinvolti nelle fasi distinte della formazione degli organi.Questa procedura sperimentale sarà esemplificata dallo studio dell'organogenesi del timo e delle ghiandole paratiroidi. Negli uccelli gli epiteli di questi organi derivano da un primordio endodermico comune della terza e della quarta tasca faringea ed emergono come domini discreti intorno al quarto giorno embrionale nella quaglia e al quattro/quinto nel pollo. Man mano che lo sviluppo procede, i rudimenti dell'organo si individualizzano e si separano dalla faringe.Più tardi nello sviluppo, l'epitelio timico è colonizzato da cellule progenitrici ematopoietiche. Il metodo qui presentato inizia con l'isolamento del territorio embrionale della quaglia contenente il territorio presuntivo di questi organi, cioè la regione faringea contenente il terzo e il quarto arco al terzo giorno embrionale. Le uova di quaglia fecondate sono state incubate con la camera d'aria rivolta verso l'alto per tre giorni a 38 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata.Per iniziare, togliete le uova di quaglia dall'incubatrice. Eseguire procedure di manipolazione degli ovuli in condizioni sterili utilizzando una cappa a flusso laminare orizzontale e strumenti e materiali sterilizzati. Prepara una grande ciotola di Pyrex piena di PBS freddo.Con le forbici ricurve aprite l'uovo di quaglia picchiettando il guscio e tagliando un'apertura circolare sul lato opposto della camera d'aria. Versare con cura l'embrione nel piatto. Tenere l'esemplare all'interno di una pinza sottile e con l'aiuto delle forbici curve praticare un taglio nella membrana vitellina che circonda il giogo.Tagliare intorno ed esternamente alla circonferenza dei vasi extra embrionali con un movimento continuo. Trasferisci l'embrione in una piccola ciotola con PBS freddo. Quindi utilizzare uno schiumatoio per trasferire l'embrione in una piastra di Petri Pyrex con base nera contenente PBS freddo.Sotto uno stereomicroscopio, tenere l'embrione sul fondo della piastra con sottili spilli per insetti. Posizionare quattro spilli formando una forma quadrata nella regione extra embrionale. Con una pinza rimuovere le membrane embrionali extra della regione cefalica e mettere lì un quinto perno.Ora l'embrione è posizionato correttamente e sono visibili la vescicola otica, il tubo cardiaco e il primo, secondo e terzo arco faringeo. Inizia a sezionare la regione di interesse che è la terza e la quarta regione dell'arco faringeo usando le forbici per gli occhi di Wecker. Praticare un taglio longitudinale e parallelo all'asse dell'embrione tra l'area dei somiti e il tubo neurale e gli archi faringei.Quindi rimuovere il tubo cardiaco posizionato ventralmente tagliandolo. Mantenere le forbici nella stessa posizione, ruotare la capsula di Petri per riposizionare l'embrione in base alla direzione del taglio. Per finire, tagliare tra il secondo e il terzo arco faringeo e sotto il quarto arco faringeo.Aspirare i tessuti isolati e trasferirli in una capsula di vetro riempita di PBS freddo utilizzando una pipetta di plastica sterile. Conservarlo in ghiaccio durante la preparazione del test in vitro. Riempire un pozzetto da una piastra a sei pozzetti con 5 mL di terreno di coltura e posizionare un inserto a membrana in policarbonato sul pozzetto.Sotto lo stereomicroscopio trasferire l'espianto, facendo scorrere delicatamente con l'aiuto di una spatola e una pinza, dal piatto di vetro alla superficie della membrana. In alternativa, gli espianti possono essere coltivati in filtri a membrana galleggianti. Per questa procedura preparare una piastra di Petri da 35 millimetri con 5 ml di terreno di coltura.Utilizzare una pinza per far galleggiare il filtro a membrana mantenendo una superficie asciutta a contatto con l'aria. Come in precedenza, trasferire l'espiante dalla capsula di vetro alla superficie della membrana facendo scorrere delicatamente. Gli espianti devono essere posizionati con il lato ventrale rivolto verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana.Aggiungere fino a otto espianti per filtro a membrana. Posizionare con cura la piastra a sei pozzetti e la piastra di Petri contenente gli espianti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il cinque percento di anidride carbonica. Dopo un periodo di incubazione di 48 ore, rimuovere la piastra e la piastra di Petri dall'incubatrice.Per raccogliere gli espianti coltivati dalla piastra a sei pozzetti, aggiungere PBS a temperatura ambiente all'inserto della membrana. Staccare gli espianti coltivati dalla membrana mediante lavaggio energico con una pipetta di plastica sterile. Con spatola e pinze trasferire gli espianti coltivati in un piatto di vetro riempito di PBS a temperatura ambiente.Allo stesso modo, raccogliere gli espianti coltivati dal filtro a membrana galleggiante. In questo caso, trasferire il filtro a membrana con pinza in una nuova piastra di Petri riempita di PBS a temperatura ambiente. Staccare gli espianti dal filtro a membrana mediante pipettaggio vigoroso.Scaricare il filtro a membrana senza espianti dopo aver verificato che non vi rimangano espianti attaccati ad esso. Con una spatola e una pinza, trasferire con cura gli espianti in 1 mL di reagente di isolamento dell'RNA totale per eseguire studi di espressione genica. Gli espianti coltivati possono in alternativa essere coltivati in ovo per competere nella formazione degli organi.Per prima cosa preparare la membrana corioallantoica. Per questo togliete dall'incubatrice le uova di gallina con otto giorni di sviluppo. Le uova sono state incubate con la camera d'aria rivolta verso l'alto in un'incubatrice umidificata a 38 gradi centigradi.Copri l'estremità smussata dell'uovo con del nastro di plastica trasparente per evitare che pezzi di guscio cadano nella camera d'aria. Picchiettare il guscio e tagliare un'apertura circolare nell'uovo con le forbici curve. La camera d'aria dovrebbe diventare visibile.Rimuovere lentamente la membrana bianca della camera d'aria con una pinza. La membrana corioallantoidea è quindi visibile e accessibile per il trapianto di tessuto ectopico. Non utilizzare PBS per idratare la membrana corioallantoica prima o dopo il trapianto poiché il PBS favorisce lo scorrimento e il posizionamento errato degli espianti.Inizia eseguendo piccole lesioni vascolari nei vasi più piccoli della membrana. Per questa procedura utilizzare un microbisturi in un supporto. In caso di sanguinamento eccessivo dalla ferita, rimuovere il sangue per capillarità utilizzando la punta di una pipetta Pasteur.Trasferire l'espiante nell'area ferita della membrana con una spatola e una pinza. Tagliate un pezzo di carta da filtro di dimensioni leggermente superiori a quelle dell'espianto e mettetelo sopra l'espianto. La carta da filtro aiuta a tracciare la posizione dell'espianto dopo il suo sviluppo nella membrana corioallantoidea.Se necessario, la carta da filtro consente anche l'erogazione giornaliera del farmaco all'espiante durante lo sviluppo in ovo. Sigilla la finestra dell'uovo con del nastro di plastica trasparente e identificala usando una matita a carboncino. Il nastro di plastica protegge l'embrione dalla disidratazione durante il periodo di incubazione.Incubare l'uovo manipolato in un'incubatrice umidificata a 38 gradi centigradi. Dopo 10 giorni di incubazione, raccogliere l'uovo e ritirare con cura il nastro di plastica. Tagliare la membrana corioallantoica attorno alla regione del filtro usando le forbici curve e trasferire l'espiante con carta da filtro in una piccola ciotola di Pyrex riempita con PBS freddo.Con una pinza trasferire l'espiante in un piatto da 100 millimetri con base nera riempito di PBS. Rimuovere delicatamente la carta da filtro e l'eccesso di membrana utilizzando le forbici per gli occhi e le pinze Wecker. Con lo skimmer, trasferire gli innesti in una soluzione fissativa e valutare la formazione degli organi nelle sezioni di paraffina mediante istologia convenzionale, immunoistochimica.Qui è raffigurato il disegno sperimentale utilizzato per esplorare le prime fasi della formazione del timo e delle paratiroidi. Ad esempio, l'espressione di geni noti per essere coinvolti nello sviluppo della regione dell'arco faringeo è stata valutata durante il normale sviluppo mediante PCR quantitativa in tempo reale. I trascritti dei tre geni Tbx1, Six1 e Bmp4 sono stati rilevati in tessuti appena isolati e dopo 48 ore di coltura.Per studiare i ruoli delle vie di segnalazione di Notch e Hedgehog, sono stati aggiunti inibitori farmacologici al terreno di coltura durante lo sviluppo in vitro. I livelli di espressione dei tre geni erano significativamente ridotti nella terza e nella quarta regione dell'arco faringeo cresciuti per 48 ore in presenza di inibitore di Notch rispetto alle condizioni controllate. Al contrario, solo i trascritti di Bmp4 sono risultati significativamente ridotti nei tessuti in coltura quando la segnalazione di Hedgehog è stata bloccata.Per studiare gli stadi tardivi dell'organogenesi del timo e delle ghiandole paratiroidi, i tessuti in coltura sono stati innestati sulla membrana corioallantoidea e lasciati raddoppiare per altri dieci giorni. L'analisi morfologica degli organi è stata eseguita mediante istologia convenzionale e immunoistochimica. Alcuni risultati rappresentativi sono i seguenti: Gli innesti hanno mostrato un timo chimerico completamente formato con QCPN positivo, cellule di epitelio timico derivate dalla quaglia e cellule linfoidi di origine donatrice di pollo.Inoltre, gli epiteli timici e paratifoidi hanno mostrato caratteristiche morfologiche normali dopo il rilevamento della citocheratina. L'epitelio timico mostrava un'architettura reticolare mentre le cellule parenchimali paratiroidi erano di forma globulare disposte in grappoli e circondate da numerosi capillari. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'approccio in due fasi dello sviluppo in vitro e in ovo utilizzando il modello aviario per studiare il ruolo delle vie di segnalazione coinvolte nelle fasi distinte della formazione degli organi.

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Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dellorgano nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma (Video) | JoVE Journal

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

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