Name: Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Scopri come generare anticorpi monoclonali contro prodotti naturali mediante immunizzazione, fusione cellulare e screening ELISA. Questo protocollo migliora la sensibilità degli immunoassay per applicazioni cliniche.

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Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (sovvenzione numeri 81573573, 81473338 e 81503344) e il classico Team di ricerca base prescrizione presso l'Università di Pechino di medicina cinese.

Tutte le procedure animale effettuate in questo studio sono state approvate dal comitato di revisione etica presso l'Università di Pechino di medicina cinese (approvazione numero 2016BZYYL00109).
Nota: Topi BALB/c femmina (8 settimane) sono stati immunizzati con aptene-carrier proteico coniugati. Quando usato da solo, una piccola molecola (< Da 1.000) non può suscitare una risposta immunitaria. Tuttavia, coniugando la piccola molecola un risultati di macromolecola di vettore in sintesi di antigene. In questo contesto, la piccola molecola è etichettata un aptene. Coniugazione di aptene è una strategia necessaria ed efficace per la produzione di mAb. Per evitare la cross-reattività, due elementi portanti differenti della proteina, come albumina di siero bovino (BSA) e ovoalbumina (uova) o emocianina di keyhole limpet (KLH) e BSA, deve essere utilizzato come immunogeni (per l'immunizzazione degli animali) e gli antigeni di rivestimento (per rivestire la piastra per anti-siero rilevamento). BSA e gli ovuli vengono utilizzati come esempio nel presente protocollo.
1. preparazione dell'immunogeno e rivestimento antigene
Nota: Per sintesi artificiale dell'antigene, utilizzare il gruppo funzionale appropriato (ad esempio, dell'idrossile, solfidrilico carbossilico acido, o amminico) come il braccio laterale per il legame covalente con la proteina carrier. La coniugazione metodi includono Periodato di ossidazione, il metodo di carbodiimide, una reazione mista anidridi, una reazione di glutaraldeide e il metodo di succinato. Questo protocollo utilizza un glicoside del flavanone ben noto, la naringina (NAR), come un composto di esempio. NAR è un piccolo complesso (Da 581) presente in agrumi, nonché varie medicine cinesi tradizionali.
<ol><li>Utilizzare una procedura di ossidazione periodate per sintetizzare coniugati NAR-BSA e NAR-OVA.<ol>
<li>Sciogliere 50 mg di NAR in acqua ad una concentrazione finale di 1mg/mL22.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di sodio preparata al momento periodato soluzione (0,1 M) a 5 mL della soluzione NAR. Lavorare l'impasto a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sciogliere 4 mg di BSA e ovuli in 2,0 mL di tampone di carbonato 50 mM (pH 9,6). Aggiungere questa proteina soluzione al NAR/Sodio Metaperiodato miscela di reazione.</li>
	<li>Regolare la miscela a pH 9 con soluzione 1 M Na2CO3 e mescolare a temperatura ambiente per 6-8 h.</li>
	<li>Dializzare la miscela di reazione in tampone fosfato salino (PBS) utilizzando una membrana di dialisi (MWCO 10 kDa) per 3 giorni per lo scambio della CBS.</li>
	<li>Analizzare il coniugato aptene-carrier utilizzando matrix assistita laser desorbimento/ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF)-MS.<ol>
<li>Mescolare 1-10 pmol del coniugato con un 103-piegare eccesso molare di Acido sinapico in una soluzione acquosa contenente 0,15% acido trifluoroacetico (TFA). Asciugare il composto su un piatto di campione in aria.</li>
		<li>Eseguire l'analisi utilizzando un MALDI-TOF spettrometro di massa dotato di un laser pulsato azoto operati a 337 nm. Acquisire spettri di massa MALDI ioni positivi in modo lineare all'interno della gamma di massa (m/z) di 15.000-100.000 come descritto precedentemente22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. immunizzazione
Nota: Un totale di 5 topi femminili di BALB/c (8 settimane) sono stati utilizzati: 4 per NAR coniugato immunizzazione e 1 per l'immunizzazione di controllo (PBS).
<ol><li>Per la prima vaccinazione, mescolare 50 µ g di coniugato (diluito in 100 µ l di PBS) con un volume uguale di adiuvante completo di Freund (CFA) ed emulsionare completamente. Amministrare 100 µ l di questa miscela per ogni mouse via dorsale iniezione sottocutanea.</li>
	<li>Due settimane più tardi, consegnare un booster vaccinazione (100 µ l) tramite iniezione sottocutanea con la stessa quantità di coniugato mescolato con adiuvante incompleto (IFA).</li>
	<li>Estratto di 200 µ l di sangue dalla vena della coda di ogni mouse 7 giorni più tardi per ottenere siero.<ol>
<li>Centrifugare il sangue a 3.000 x g per 10 min. trasferire il siero surnatante in una nuova provetta.</li>
		<li>Analizzare il siero usando un ELISA come descritto in precedenza21. Scegliere il mouse con il più alto titolo del siero da utilizzare per la fusione delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In preparazione per la fusione cellulare, amministrare un'immunizzazione pulsata per il mouse selezionate tramite l'iniezione intraperitoneale di 50 µ g del coniugato a 300 µ l di PBS senza adiuvante 3 giorni prima della fusione. Nota: Questo passaggio può essere omesso se il titolo è abbastanza alto.</li>
</ol>3. preparazione per la fusione delle cellule
<ol><li>Preparazione delle cellule di fusione media<ol>
<li>Per il terreno selettivo di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello): sciogliere 50 x supplemento di media di cappello in 10 mL di RPMI-1640 e aggiungere questa miscela a 500 mL di RPMI-1640 che contiene 20% FBS. Nota: Quando 10 mL di concentrato 50x sono diluiti in 500 mL di terreno di coltura, le concentrazioni finali di ipoxantina, aminopterina e timidina sono 100 µM, 0,4 µM e 16 µM, rispettivamente.</li>
		<li>Per i media di ipoxantina-timidina (HT): sciogliere 50 x supplemento di media HT in 10 mL di RPMI-1640 e aggiungere questa miscela a 500 mL di RPMI-1640 che contiene 20% FBS. Le concentrazioni finali di ipoxantina e timidina sono 100 µM e 16 µM, rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltura le cellule Sp2/0-Ag14.<ol>
<li>Almeno 7 giorni prima della fusione, scongelare rapidamente una fiala di cellule di mieloma SP2/0-Ag14 del congelato in azoto liquide in acqua tiepida.</li>
		<li>Trasferire la soluzione di cella in 5 mL di terreno di coltura fresco (RPMI-1640) e centrifugare per 10 minuti a 1000 x g.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere il terreno di coltura e risospendere le cellule in RPMI-1640 fresco completati con 10% siero bovino fetale (FBS).</li>
		<li>Trasferire le cellule e le medie in un matraccio da2 di 25cm e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2.</li>
		<li>Espandere le celle a 3 o matracci2 4 75 cm prima della fusione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione delle cellule strato alimentatore addominale<ol>
<li>Sacrificare un mouse ICR 12-settimana-vecchio albino di dislocazione cervicale 1 giorno prima della fusione cellulare e immergerlo in etanolo di 75%.</li>
		<li>Dopo aver rimosso il pelo dall'addome con pinze emostatiche, disinfettare la zona con etanolo al 75%. Tagliare la pelle esterna per esporre la cavità addominale. Iniettare 3 mL di mezzo di RPMI-1640 sterile nell'addome e massaggiare l'addome per staccare le cellule supplementari nella soluzione. Aspirare la sospensione di cellule di alimentatore in una provetta da centrifuga da 15 mL.</li>
		<li>Dopo centrifugazione la sospensione cellulare per 10 minuti a 1000 x g, scartare il surnatante e risospendere le cellule di alimentatore in 20 mL di terreno selettivo HAT.</li>
		<li>Trasferire le cellule in piastre per colture cellulari di 96 pozzetti (100 µ l/pozzetto). Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fusione cellulare
<ol><li>Dopo il prescelto immunizzati mouse è stato preparato per fusione cellulare (Vedi punto 2.4), somministrare un'iniezione intraperitoneale dell'10% cloralio idrato (anestetico) e sacrificare il mouse immunizzato tramite dislocazione cervicale.</li>
	<li>Raccogliere ulteriori sangue dal cuore (1 mL) e preparare il siero come descritto al punto 2.3.1 da utilizzare come controllo positivo durante la selezione dell'ibridoma.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto della pelle e del muscolo, usando le forbici per esporre la milza.</li>
	<li>Isolare la milza con pinzette accuratamente e lavare la milza con RPMI-1640. Tagliate la milza a pezzi e lentamente Libbra della milza per triturare. Preparare una sospensione di cellule di milza premendo il tessuto della milza attraverso un colino di cella 800 maglia in una provetta da centrifuga 50 mL.</li>
	<li>Lavare la sospensione delle cellule della milza con medium RPMI-1640. Raccogliere le cellule di milza mediante centrifugazione (1000 x g, 10 min e a 4 ° C) e poi scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte.</li>
	<li>Rimuovere le cellule di mieloma coltivata e amplificato dall'incubatrice e delicatamente rubinetto/agitare le beute per ottenere una sospensione cellulare. Lavare questa sospensione con medium RPMI-1640 volte per rimuovere il FBS. Nota: Questo è un passo essenziale come FBS può influenzare la fusione cellulare.</li>
	<li>Contare le celle e regolare la concentrazione prima della miscelazione con le cellule della milza. Il rapporto finale delle cellule della milza a cellule di mieloma dovrebbe essere tra 1:5 e 01:10.</li>
	<li>Mescolare la cellula della milza cellule sospensione e mieloma. Centrifugare la miscela delle cellule (1000 x g, 10 min e a 4 ° C) e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di 50% glicole polietilenico (PEG) alle cellule e mescolare delicatamente a 37 ° C per 1 min. Lasciate riposare per 30 s. Nota: La soluzione di PEG impiegata in questa fase dovrebbe contenere 50% (p/v) di polietilenglicole 1500 e 10% (v/v) solfossido dimetilico (DMSO) in PBS senza calcio (Ca2 +).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno RPMI-1640 per 2 min terminare la reazione. Aggiungere un ulteriore 2 mL di medium RPMI-1640 per un altro 1 min e quindi aggiungere un ulteriore 10 mL di medium RPMI-1640.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 min. Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere la soluzione HAT e continuare a coltivare le cellule. Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare in tutti i pozzetti delle piastre strato dell'alimentatore, quindi incubare le piastre per 7 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Nota: In queste condizioni, le cellule di mieloma unfused morirà mentre le cellule di ibridoma continuerà a crescere nel mezzo di cappello. Dopo 7 giorni, Ibridoma monoclonale formerà come un singolo cluster di cellule nel pozzo, mentre pozzetti contenenti policlonale ibridoma avrà più mazzi delle cellule.</li>
	<li>Aspirare il supernatante per analisi e sostituire il mezzo con il mezzo di HT. Nota: Assicurarsi di sostituire il mezzo di cappello con HT medio primo come passare direttamente a mezzo senza aggiunte è dannosa per l'ibridoma.</li>
</ol>5. indiretta ELISA competitivo (icELISA)
<ol><li>Ricoprire una piastra a 96 pozzetti con NAR-OVA (1 µ g/mL, 100 µ l/pozzetto) e incubare per 1h a 37 ° C o una notte a 4 ° C.</li>
	<li>Bloccare la piastra con 300 µ l di GPBS (PBS contenente gelatina di 1% m/v) per 1 h a 37 ° C per impedire l'adsorbimento non specifico.</li>
	<li>Lavare la piastra tre volte con TPBS (PBS contenente 0,05% v/v Tween-20).</li>
	<li>Diluire NAR non coniugata in una serie di concentrazioni con 10% metanolo. Aggiungere 50 µ l di queste diluizioni per pozzetti separati. In altri pozzi, aggiungere 50 µ l di antisiero o ibridomi surnatante (contenente anticorpi monoclonali). Incubare la piastra per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di marcato con perossidasi anti-IgG di topo in ogni pozzetto e incubare per 1 h.</li>
	<li>Dopo aver lavato la piastra tre volte con TPBS, aggiungere 100 µ l di soluzione substrato (0,1 M citrato tampone (pH 4) contiene 0.015% v/v H2O2 e 2 mg/mL di 3, 3', 5, 5'-tetrametil benzidina (TMB)) a ciascun pozzetto ed incubare per 15 min.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 1 M H2così4 in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 450 nm. Scegliere gli ibridomi che secreto le più alte concentrazioni di anticorpi NAR in loro surnatante per ulteriore preparazione.</li>
</ol>6. preparazione di ibridomi monoclonale
<ol><li>Utilizzare il metodo di diluizione limitante per preparare gli ibridomi monoclonale.<ol>
<li>Dopo aver tolto il supporto HT gli ibridomi selezionati (cioè, quelli positivi per la secrezione dell'anticorpo NAR), risospendere le cellule in RPMI-1640 e contarli.</li>
		<li>Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 cella, 2 celle e 4 cellule per pozzetto in 100 µ l di RPMI-1640 in una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Dopo 7-10 giorni, è possibile rilevare gli anticorpi NAR nel surnatante mediante il protocollo icELISA (passo 5) della cultura. Trasferire le cellule da ibridomi che sono positivi per gli anticorpi NAR a 24 pozzetti, boccette2 25 cm e 75 cm2 boccette per coltivazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crioconservare gli ibridomi monoclonale.<ol>
<li>Raccogliere le cellule e trasferirli per provette da centrifuga.</li>
		<li>Dopo centrifugazione le cellule (800 x g, 10 min), rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in congelamento medio (RPMI-1640, 20% siero fetale del vitello (FCS) e 10% DMSO). Trasferire le sospensioni cellulari per provette per criogenia.</li>
		<li>Conservare le provette per criogenia in una scatola di raffreddamento gradiente a-80 ° C per 24 h. Quindi trasferire le provette per criogenia per azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo per il successo della produzione di anticorpi monoclonali contro naturale prodotto derivato di piccole molecole. I passi essenziali nella procedura sono stati delineati, e abbiamo dimostrato l'utilità di questo protocollo utilizzando NAR come una piccola molecola di esempio. Gli spettri di esempio, analisi di reattività e icELISA risultati tutti mostrano rappresentante sperimentale e dati di controllo che viene ottenuti utilizzando questo protocollo. Immagini di esempio degli ibridomi forni...

Gli anticorpi monoclonali (mAbs), noto anche come anticorpi mono-specifici, sono prodotte da un singolo clone di linfocita b e sono composti da monovalenti anticorpi che si legano al stesso epitopo1. Negli ultimi anni, molti prodotti medicinali vegetali naturali sono stati utilizzati nel trattamento di varie malattie2. Infatti, molti piccoli composti molecolari originariamente derivati da prodotti naturali vengono ora applicate come farmaci di prima linea, come ad esempio artemisinina per malaria e paciltaxel (taxolo) per cancro2,3. Lo studio di prodotti naturali ha fatto rapidi progressi, in gran parte dovuto l'enorme sviluppo e l'ottimizzazione delle tecniche di analisi convenzionali, tra cui la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni connesse con questi metodi, quali i loro complessi protocolli pretrattamento e costi associati per quanto riguarda il tempo, manodopera/competenze e strumenti necessari4.
Recentemente, sono stati applicati i saggi basati su mAb enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) analizzare qualitativamente e quantitativamente il cibo e prodotti naturali. In realtà, questo metodo è stato applicato per analisi di campioni biologici e per la sperimentazione clinica e ha dimostrato di essere accurati, sensibili e altamente efficiente, evitando anche le fasi di pretrattamento noiose connesse con altre analisi5, 6.
Quando si utilizza basato su mAb ELISAs per studiare prodotti naturali complessi, preparazione degli anticorpi monoclonali è uno dei passi fondamentali. Purtroppo, i mAbs specifici per i piccoli componenti bioattivi presenti in questi tipi di sostanze6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sono spesso limitati rispetto agli antigeni della proteina. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per generare specificamente mAbs contro piccoli composti. Il protocollo presentato qui include sintesi artificiale dell'antigene, mouse immunizzazione, fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto e preparazione di ibridoma monoclonale.
In particolare, il nostro gruppo di ricerca ha studiato la formazione di anticorpi monoclonali contro piccoli composti bioattivi da medicine cinesi tradizionali e sviluppare le proprie applicazioni per anni. Nei nostri studi in corso, abbiamo sviluppato anticorpi monoclonali contro baicalin16, puerarin17, acido glicirrizico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e molte altre piccole molecole. I nostri protocolli di ELISA basati su questi anticorpi monoclonali sono stati utilizzati in una serie di studi per valutare la farmacocinetica di queste piccole molecole, come pure le loro interazioni con altri composti bioattivi. Inoltre, usando questi mAbs, abbiamo anche sviluppato metodi di cromatografia di immunoaffinità per la separazione di analoghi strutturali, inclusi epimers. Recentemente, abbiamo preparato un immunoassay di flusso laterale utilizzando il nostro mAb anti-puerarin che è stato successivamente utilizzato per il rilevamento rapido, in loco di questo composto. I nostri risultati indicano che la nostra analisi di mAb-based sono strumenti indispensabili e conveniente per studiare la biologia e la qualità dei composti naturali-prodotto-derivati, in particolare quelli utilizzati nelle medicine cinesi tradizionali.

<table><tbody><tr><td>800 maglie (40 &mu; m nylon) filtro&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 24 pozzetti</td><td>NUNC</td><td>119567</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Flask</td><td>Labserv</td><td>310109016</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5'-Tetramethylbenzidine(TMB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>860336 1G</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Flask</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 96 pozzetti</td><td>NUNC</td><td>117246</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>colino cellulare</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga 15 mL</td> Provetta da centrifuga <td>Corning</td><td>430645</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td></td><td>Corning 430828</td><td></td></tr><tr><td>crioprovette, 1 mL</td><td>Coltivatore Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DRP-9082&nbsp;</td><td>Membrana</td> per dialisi Samsung <td></td></tr><tr><td>(10kDa)</td><td>Bilancia elettronica Heng Hui</td><td>45-10000D</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsolfossido</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>DH105-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BS124-S&nbsp;</td>Piastre ELISA <td>Sartorius</td><td></td></tr><tr><td>, 96 pozzetti</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>etanolo, 96%</td><td>Sinopharm Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale di vitello</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; coadiuvante, completo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBM2183V</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s adiuvante, incompleto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBL0210V</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>AMRESCO</td><td>9764-500g</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di raffreddamento a gradiente</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di terreni HAT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0262-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di anticorpi IgG di capra anti-topo coniugati HRP</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>HT</td><td>Microscopio invertito Sigma Aldrich</td><td>H0137-10VL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IX73</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>patella buco della serratura emocianina Sigma</td><td>Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF-MS</td><td>Axima-CFR &nbsp;</td><td>Axima&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>BioTex</td><td>ELX-800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>topo</td><td>Vital River&nbsp;</td><td>BALB/c</td><td></td></tr><tr><td>ovoalbumina</td><td>Pechino BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina & Soluzione di streptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 10 mL</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 25 mL</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>latte scremato</td><td>applygen</td><td>P1622</td><td></td></tr><tr><td>periodato di sodio</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germania</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Punte 1.000 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

L'analisi dei componenti bioattivi presenti negli alimenti e prodotti naturali è diventata una popolare area di studio in molti campi, compreso il tradizionale cinese medicina e cibo sicurezza/tossicologia. Molte delle tecniche di analisi classica richiedono attrezzature costose e/o competenze. In particolare, le analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono diventati un metodo emergente per l'analisi di alimenti e prodotti naturali. Questo metodo si basa sulla rilevazione dell'anticorpo-mediata dei componenti di destinazione. Tuttavia, come molti dei componenti bioattivi in prodotti naturali sono piccole (< Da 1.000) e non indurre una risposta immunitaria, creazione di anticorpi monoclonali (mAbs) contro di loro è spesso difficile. In questo protocollo, forniamo una spiegazione dettagliata dei passaggi necessari per generare anticorpi monoclonali contro molecole bersaglio, nonché quelli necessari per creare l'associato indiretta competitivo (ic) ELISA per l'analisi rapida del composto nei campioni multipli. La procedura descrive la sintesi dell'antigene artificiale (cioè, il coniugato aptene-carrier), immunizzazione, fusione cellulare, preparazione di ibridoma monoclonale, caratterizzazione del mAb e l'applicazione basata su ELISA del mAb. Il coniugato aptene-carrier è stato sintetizzato dal Sodio Metaperiodato metodo e valutati mediante MALDI-TOF-MS. Dopo immunizzazione, splenocytes sono stati isolati dal mouse immunizzato con il più alto titolo dell'anticorpo e fuso con il deficit di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello) - linea cellulare di mieloma mouse sensibile Sp2/0 - Ag14 utilizzando un polietilene glicole (spina)-metodo basato. Gli ibridomi secernenti anticorpi monoclonali reattivi all'antigene bersaglio sono stati selezionati dall'icELISA per la specificità e la reattività crociata. Inoltre, è stato applicato il metodo di diluizione limitante per preparare ibridomi monoclonale. MAbs finale sono stati ulteriormente caratterizzata da icELISA e poi utilizzate in un'applicazione basata su ELISA per la rilevazione rapida e conveniente dell'aptene esempio (naringina (NAR)) nei prodotti naturali.

Generazione di ibridomi monoclonale
Il peso molecolare del coniugato aptene-carrier è stato confermato da analisi MALDI-TOF-MS. Come il peso molecolare di BSA e la NAR sono noti, potrebbe essere calcolato il numero di piccole molecole coniugate con BSA. La figura 1 Mostra i risultati rappresentativi spettrali per NAR-BSA22, che consente di ...

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Gli anticorpi monoclonali sono noti come anticorpi monospecifici prodotti da un singolo clone di linfociti B e dagli anticorpi monovalenti che si legano allo stesso epitopo. Recentemente, l'ELISA a base di anticorpi monoclonali è diventata la nostra piattaforma emergente per l'analisi qualitativa o quantitativa di alimenti o prodotti naturali. Questo metodo è un metodo accurato, sensibile ed efficace senza noiosi passaggi di pretrattamento.Questo è l'essenziale per i campioni biologici e le future applicazioni cliniche. La preparazione degli mAB di TCM è un passo vitale negli studi sulle caratteristiche complesse del sistema della formula TCM. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare mAB contro i piccoli composti molecolari, tra cui la sintesi artificiale dell'antigene, l'immunizzazione del topo e la fusione cellulare.L'hapten è collegato con la proteina portante per sintetizzare l'antigene artificiale. L'antigene artificiale e i coadiuvanti completi sono misti ed emulsionati. Il topo è stato immunizzato per iniezione sottocutanea.Eseni la milza del topo immunizzato e fai una sospensione a cella singola. Mescolare le cellule del mieloma. Gli splenociti sono isolati e fusi con

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un metodo di generazione di anticorpi da cellule di mammifero introducendo vettori plasmidici con geni a catena pesante e leggera. Questi vettori interagiscono con la polietilenimmina ed entrano nelle cellule formando poliplessi; Successivamente, vengono tradotte in singole proteine e assemblate in anticorpi completi, che vengono secreti nel mezzo extracellulare.

Generazione di anticorpi monoclonali ricombinanti da colture cellulari di mammifero

Il video mostra una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche. I vettori di espressione eucariotici che codificano per le catene pesanti e leggere di anticorpi, clonati da cellule B isolate antigene-specifiche, vengono introdotti nelle cellule di mammifero utilizzando poliplex. Una volta all'interno delle cellule, questi vettori subiscono la traduzione e i peptidi a catena pesante e leggera risultanti si assemblano in anticorpi, che vengono successivamente...

Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).

Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per studiare la patogenesi Hc e fornire il modello migliore. Stiamo esplorando i potenziali benefici dell'immunità umorale contro questo fungo e ha generato anticorpi monoclonali diversi [di istone H2B e 60kDa Heat Shock Protein] che abbiamo testato per la loro efficacia protettiva dopo la somministrazione intraperitoneale.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

Un metodo semplice macchia di slot è stato sviluppato per la quantificazione del emoagglutinina e neuraminidasi dell'influenza virale utilizzando anticorpi universali indirizzare le proprie sequenze più conservate identificate attraverso l'analisi bioinformatica. Questo approccio innovativo può fornire una valida alternativa alla determinazione quantitativa di tutti i emoagglutinina e neuraminidasi virale.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Un saggio parassita-salvataggio e di trasformazione con THP1 cellule...

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Le condizioni di conservazione dei prodotti piastrinici creano un ambiente ideale per la moltiplicazione dei contaminanti batterici a livelli pericolosi.  L'obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare un saggio di formazione di colonie per valutare un processo di riduzione dei patogeni a base di riboflavina contro la contaminazione batterica ad alto titolo nei prodotti piastrinici umani.

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

Scopri come generare anticorpi monoclonali contro prodotti naturali mediante immunizzazione, fusione cellulare e screening ELISA. Questo protocollo migliora la sensibilità degli immunoassay per applicazioni cliniche.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

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