Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare è quello di generare colture altamente pure di microglia da roditori in via di sviluppo o adulti che possono essere mantenute senza esposizione al siero. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze relative alla morfologia della microglia, alla chetosi fibrosa e all'interazione della microglia con altri tipi di cellule del SNC. Il vantaggio principale di questo protocollo è che le microglia possono essere rapidamente isolate da tessuti di roditori di qualsiasi età e coltivate senza esposizione al siero.

Per rimuovere il cervello, tagliare il condilo occipitale dal midollo spinale di un animale su entrambi i lati con le forbici da dissezione, facendo attenzione a non danneggiare il cervello. Quindi, tagliare la pelle lungo la parte superiore del cranio e tagliare un lato lungo l'osso parietale e frontale verso l'osso nasale. Tirare indietro con cautela la parte superiore del cranio con una pinza, rimuovere rapidamente il cervello e metterlo in DPBS preraffreddato su ghiaccio.

Ripetere la procedura per tutti gli animali rimanenti. Dopo che i cervelli sono stati raccolti in DPBS freddo, tagliare ogni cervello in pezzi di un cubo di millimetro in una capsula di Petri su ghiaccio con una lama di bisturi fredda e trasferirli in un omogeneizzatore dounce ghiacciato con cinque-sette millilitri di tampone douncing ghiacciato. Quindi, utilizzare un omogeneizzatore a balza larga per dissociare il tessuto con 10-20 passaggi delicati e incompleti.

Fare attenzione a non schiacciare direttamente il fazzoletto sul fondo dell'omogeneizzatore. Invece, spingere il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore. È importante omogeneizzare lentamente il tessuto con più cicli di douncing per preservare la vitalità della microglia.

Successivamente, rimuovere con cautela il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Lasciare che i pezzi di tessuto scarsamente dissociati si depositino sul fondo dell'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri raffreddata. Successivamente, sostituire il volume rimosso con un tampone di douncing fresco e ripetere la procedura di dissociazione per un totale di tre o quattro cicli, o fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato.

In questa procedura, aggiungere un tampone douncing ghiacciato al tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare e regolare il volume totale a 33,5 millilitri. Quindi, aggiungere 10 millilitri di MSB alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo più volte. Ciò si tradurrà in una concentrazione finale del 23% di MSB in un volume di 43,5 millilitri.

Dopodiché, centrifugare le celle per 15 minuti a 500 x g a 4 gradi Celsius con una frenata lenta. Quindi, rimuovere lo strato superiore di mielina e detriti e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per assicurarsi che venga rimosso il più possibile.

Successivamente, risospendere il pellet della cella in 12 millilitri di tampone di panning. Triturare delicatamente la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule rimanenti. In questa fase, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri per rimuovere detriti o grumi cellulari di grandi dimensioni.

Sciacquare tre volte la teglia rivestita OX42 con DPBS. Non lasciare che la piastra si asciughi completamente tra un lavaggio e l'altro. Versare l'ultimo lavaggio DPBS e applicare la sospensione cellulare filtrata sulla pirofila.

Agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule. Quindi, incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Non incubare per più di 20 minuti, altrimenti le cellule diventeranno molto difficili da recuperare dalla capsula.

Successivamente, sciacquare la teglia con DPBS 10 volte per rimuovere le cellule non aderenti. La microglia sarà saldamente attaccata alla piastra, quindi agitare la piastra ad ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti. Versare l'ultimo lavaggio DPBS e sostituirlo con 15 millilitri di DPBS e 200 microlitri di tripsina.

Per tripsinizzare le cellule, incubare la capsula per meno o uguale a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di tripsinizzazione, la microglia sarà ancora attaccata alla piastra. Versare il composto e lavare delicatamente la piastra due volte con DPBS per rimuovere la tripsina.

Quindi, sostituire con 12 millilitri di MGM ghiacciato. Successivamente, posizionare la pirofila sul ghiaccio per due minuti per indebolire l'interazione tra cellula e substrato e assicurarsi che la pirofila sia piatta per evitare che le aree della pirofila si secchino. Successivamente, pipettare energicamente con una pipetta da 10 millilitri e un controller per pipette ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto di cottura.

Disegna una griglia 16 per 16 con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule. È importante trovare un equilibrio tra il recupero cellulare generale e la salute della coltura. Il pipettaggio ripetuto del surnatante cellulare contro la piastra di panning comporterà una riduzione della vitalità della coltura.

Controllare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 20x per assicurarsi che si siano staccate dalla piastra. Contrassegnare i punti sulla parte superiore della piastra in cui sono bloccate le cellule e ripetere il pipettaggio in quelle aree. Raccogliere la sospensione cellulare e allocare da tre a quattro millilitri di surnatante in ciascuna provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare per 15 minuti a 500 x g a quattro gradi Celsius con una frenata lenta. Dopo 15 minuti, aspirare il surnatante, lasciando 0,5 millilitri di MGM con il pellet cellulare. Quindi, risospendere ogni pellet nell'MGM rimanente ed estrarre le celle da tutte le provette.

Successivamente, contare le cellule con un emocitometro. Ora, piastreggiare 15 microlitri di rivestimento IV di collagene direttamente al centro di una piastra di coltura tissutale rivestita cationica anionica a 24 pozzetti e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, diluirle a 2,3 x 10 fino a cinque per millilitro in MGM.

Aspirare il collagene IV e preparare immediatamente 15 microlitri di sospensione cellulare in questo punto per ottenere 3,5 x 10 alle tre cellule per punto. Quindi, incubare per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire. Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di TIC bilanciato con CO2 al pozzetto.

Se si esegue la placcatura sui vetrini, rivestire prima i vetrini di vetro sterili con 10 microgrammi per millilitro PDL in acqua per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavateli tre volte con acqua e lasciateli asciugare in una cappa sotto la luce UV prima di procedere con la placcatura a punti sui vetrini. Al fine di dimostrare il successo dell'isolamento e della coltura di microglia altamente pure, abbiamo isolato le microglia da ratti P21 e abbiamo coltivato queste cellule in TIC o TIC integrate con FCS al 10% per otto giorni.

Le cellule sono state quindi fissate e colorate con marcatori microgliali e marcatori di proliferazione. Le cellule coltivate in TIC mostrano una morfologia ramificata, bassi livelli di proliferazione ed espressione di marcatori microgliari. In confronto, le cellule coltivate in TIC integrate con il 10% di FCS sono anche colorate per marcatori microgliali, ma mostrano alti livelli di proliferazione e morfologia ameboide, proprietà spesso osservate nelle microglia attivate.

Oltre alla colorazione per i marcatori cellulari, l'RNA-Seq sulle cellule appena isolate può fornire uno strumento potente e sensibile per valutare il profilo RNA delle cellule e può aiutare a informare la purezza iniziale delle colture. Il micropanning CD11b determina tipicamente una piccola percentuale di neutrofili CD11b positivi e di carryover di monociti, oltre alla microglia CD11b positiva. Queste cellule moriranno in TIC dopo pochi giorni, ma possono complicare l'analisi dei punti temporali precedenti.

Ecco un filmato in time lapse della microglia di ratto P21 dopo 14 DIV in TIC. Dopo due settimane, le colture prive di siero mostrano un comportamento di sorveglianza dinamico con rapide estensioni e retrazioni del processo in tutta la piastra. Ecco un filmato in time lapse della microglia di ratto P21 dopo cinque DIV in TIC prima e dopo l'esposizione al siero fetale di vitello.

Un rapido cambiamento morfologico è evidente dopo l'esposizione al siero. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in quattro o cinque ore, se eseguito correttamente. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti altri test per monitorare la fagocitosi, la chemiotassi, la sopravvivenza, il rilascio di citochine, le risposte trascrizionali agli stimoli, al fine di rispondere a ulteriori domande sulla funzione della microglia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come isolare rapidamente le microglia dal tessuto di roditore adulto e coltivarle in condizioni di assenza di siero.