Name: Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Impara a isolare e coltivare microglia pura da roditori in mezzo senza siero. Questo metodo preserva la morfologia ramificata e supporta lo studio delle interazioni cellulari nel sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Christopher e Dana Reeve Foundation International Research Consortium sulla ferita del midollo spinale, il Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondazione di JPB, la Novartis Istituto di ricerca di base, generosi contributi da Vincent e Stella Coates e il Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Tutte le procedure che coinvolgono roditori conformano alle linee guida della Stanford University, conformi alle politiche e nazionali e le leggi dello stato. Tutte le procedure di animali sono state approvate dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali di laboratorio.
Nota: Tutte le composizioni di soluzione e buffer sono fornite nella Tabella materiali.
1. preparare una piastra di Petri per CD11b Immunopanning (giorno 0)
Nota: Preparare 1 immunopanning piatto per ogni cervello di ratto giovanile di 1-2.
<ol><li>Aggiungere 25 mL di 50 mM Tris soluzione pH 9.5 a una capsula di Petri 15 cm.</li>
	<li>Aggiungere anti-topo di capra IgG (catene di H + L) al piatto per una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Turbinio piastra per distribuire uniformemente.</li>
	<li>Incubare il piatto per 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Piatti di lavare tre volte con DPBS ++ (tampone fosfato salino (PBS) con Ca2 + e Mg2 +), quindi sostituire con una soluzione di panning tampone contenente 1 µ g/mL OX42 anticorpo. Lasciare i piatti durante la notte a temperatura ambiente su una superficie piana.</li>
</ol>2. tessuto collezione (giorno 1)
Nota: Questo protocollo dovrebbe prendere circa 3-4 h.
<ol><li>Prima di iniziare, verificare che tutte le soluzioni sono sterili e refrigerati sul ghiaccio. Tutti gli strumenti sul ghiaccio di chill e sterilizzare con etanolo prima dell'uso.</li>
	<li>Seguenti procedure regolamentari appropriate, sacrificare un topo di laboratorio giovanile da asfissia di anidride carbonica. Nota: In alternativa, gli animali più giovani possono essere sacrificati con una dose letale di chetamina/xilazina (100-200 µ l di 24 mg/mL di ketamina, xilazina 2,4 mg/mL). Chetamina/xilazina deve essere utilizzato se gli animali sono meno di 14 giorni di età. Se si utilizza più animali, estrarre il tessuto da un animale e inserirlo pre-refrigerati DPBS ++ sul ghiaccio prima di procedere alla successivi animali.</li>
	<li>Pizzicare un hindpaw e garantire l'apatia completa dall'animale prima di procedere.</li>
	<li>Via irrorare l'animale con 10-30 mL di buffer di aspersione ghiacciata utilizzando un ago 27½-G fino a quando il buffer viene eseguito chiaro. Nota: Il Volume di tampone di aspersione variano a seconda la dimensione/età dell'animale.</li>
	<li>Subito dopo aspersione rimuovere la testa dell'animale. Provenienti dal midollo spinale tagliato il condilo occipitale su ogni lato con le forbici di dissezione, fare attenzione a non danneggiare il cervello. Dopo aver tagliato attentamente ogni lato, tagliare un lato lungo parietali e osso frontale verso l'osso nasale. Con il forcipe attentamente tirare indietro la parte superiore del cranio, rimuovere rapidamente il cervello (o strutture CNS di interesse) e mettere in pre-refrigerati DPBS ++ sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere per tutti gli animali restanti. Nota: Tutte le fasi del procedimento dovrebbero essere eseguite in una cappa a flusso laminare in adeguate condizioni di sterilità.</li>
</ol>3. meccanica dissociazione (giorno 1)
<ol><li>Dopo tutti i cervelli sono stati raccolti, tritare un cervello tocchetti3 a 1 mm in una capsula Petri sul ghiaccio con un bisturi freddo e trasferire a un omogeneizzatore lisata ghiacciata con 5-7 mL di tampone douncing ghiacciata. Dissociare un cervello alla volta.</li>
	<li>Dissociare il tessuto usando tratti di dolce e incomplete di 10-20 con un omogeneizzatore lisata larghi. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il tessuto nella parte inferiore dell'omogeneizzatore, ma invece spingono il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Consenti blocchi di tessuto scarsamente dissociato a stabilirsi a fondo l'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da refrigerata 50 mL.</li>
	<li>Sostituire il volume rimosso con buffer di douncing fresco e ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per un totale di 3-4 giri, o fino a quando tutto il tessuto è stato dissociato. Ripetere la procedura per ogni cervello.</li>
</ol>4. mielina rimozione (giorno 1)
Nota: Rimozione di mielina è utilizzato per l'isolamento di microglia da animali più vecchi di P12.
<ol><li>Misurare il volume della sospensione cellulare in tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, quindi aggiungere tampone douncing ghiacciata per regolare il volume totale di 33,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone di separazione della mielina (MSB) sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di 23% di MSB in un volume di 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta. Nota: La centrifuga dovrebbe prendere circa 1.5-2 min per decelerare. Questo genererà uno strato superiore di mielina e detriti cellulari morti, un surnatante un po' torbida e una più piccola a pellet che si arricchisce di cellule vive.</li>
	<li>Rimuovere lo strato superiore di residui del myelin e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per garantire come gran parte di essa viene rimosso come possibile.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di tampone di panning. Delicatamente e triturare la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule che potrebbero rimanere.</li>
</ol>5. Immunopanning (giorno 1)
<ol><li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule.</li>
	<li>Risciacquare il piatto panning rivestite con OX42 tre volte con DPBS ++. Non fate la piastra completamente asciutto tra i lavaggi.</li>
	<li>Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS ++ e applicare la sospensione cellulare filtrata al piatto panning. Delicatamente la piastra per distribuire le cellule di turbinio, quindi incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Incubare per non più di 20 min o cellule diventerà molto difficile recuperare dal piatto.</li>
	<li>Risciacquare il piatto panning con DPBS ++ 10 volte per rimuovere le cellule non-aderenti. Microglia sarà così saldamente fissato alla piastra, agitare la piastra con ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti.</li>
	<li>Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS ++ e sostituire con 15 mL DPBS ++ e 200 μL tripsina (1,25% soluzione di riserva).</li>
	<li>Incubare il piatto per ≤ 10 min a 37 ° C con 10% CO2 per tripsinizzano. Nota: Non continuare più di 10 min o microglia diventerà difficile da rimuovere.</li>
	<li>Dopo 10 min di trypsinization, microglia sarà ancora bloccata alla piastra. Versare fuori tripsina/DPBS ++ e lavare delicatamente 2x con DPBS ++ per rimuovere la tripsina, sostituire con 12 mL di terreno di coltura di microglia ghiacciata (MGM).</li>
	<li>Posto panning piatto sul ghiaccio per 2 min per indebolire l'interazione cellula/substrato e assicurarsi che il piatto è piatto per evitare zone del panning piatto dall'asciugarsi.</li>
	<li>Pipettare vigorosamente con un controller di pipetta e dispensare 10 mL ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto panning. Disegnare una 16x16 griglia con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.</li>
	<li>Controllare le cellule al microscopio a 20 ingrandimenti per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra. Mark macchie sulla parte superiore del piatto dove le cellule sono ancora bloccate e ripetere il pipettaggio in quelle zone.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare e aliquota 3-4 mL di surnatante per provetta conica da 15 mL. Spin per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta. Nota: Microglia attraverso un piccolo volume di filatura consente il massimo recupero delle cellule.</li>
	<li>Aspirare il supernatante, lasciando 0,5 mL di MGM con il pellet cellulare.</li>
	<li>Ogni risospendere in MGM rimanenti e le cellule da tutti i tubi della piscina.</li>
	<li>Contare le celle con un emocitometro.</li>
	<li>Cellule di piastra come descritto nei passaggi 6 - 7 a seconda dell'applicazione.</li>
	<li>Cellule di coltura a 37 ° C con 10% CO2. Nota: Le cellule possono essere cultura per fino a 3-4 settimane con le modifiche di supporto regolare o una settimana senza modifiche di media.</li>
</ol>6. posto rivestimento piastre/lamelle di coltura tissutale (giorno 1)
<ol><li>Piastra 15 µ l di rivestimento di collagene IV direttamente nel centro di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici (per dettagli, vedere Tabella materiali ) e incubare per 15 min a 37 ° C con 10% CO2.</li>
	<li>Dopo il conteggio di cellule con un emocitometro diluire le cellule a 2.3 x 105/ml in MGM. Aspirare il collagene IV spot e immediatamente piastra 15 µ l di sospensione cellulare fino a questo punto; Questo vi darà 3,5 x 10 cellule/spot3 . Incubare per 5-10 min a 37 ° C con 10% CO2 per consentire alle cellule di aderire, aggiungere 500 µ l di CO2 -equilibrata contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) delicatamente al pozzo.</li>
	<li>Se placcatura sulle lamelle, primo cappotto sterile vetrini coprioggetti con 10 µ g/mL stratagemma-D-lisina (PDL) in H2O per 1h a RT, lavare 3 volte con H2O e lasciare asciugare in una cappa sotto luce UV. Una volta che le lamelle sono asciutte, procedere con spot placcatura su lamelle come descritto al punto 6.2.</li>
</ol>7. placcatura per isolamento di RNA/proteine
<ol><li>Il giorno 1, cappotto l'intera area di un 24 pozzetti anionici/cationici rivestite in lamiera di coltura del tessuto con rivestimento in collagene IV e incubare per 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO2, quindi rimuovere e immediatamente piastra 3-5 x 104 cellule/pozzetto in CO2 equilibrato Media TIC.</li>
	<li>Il giorno 2, eseguire una variazione media del 50% per ogni bene il giorno dopo la preparazione. Le cellule morte tendono a cluster al centro del pozzo, così prendono i media da lì.</li>
	<li>Eseguire una modifica di media 50% ogni 2-3 giorni per mantenere le culture. Se le modifiche di supporto introducano una variabile di indesiderate per le culture, le cellule possono sopravvivere per circa una settimana, senza alcuna modifica di media, al contrario di oltre 3 settimane con una manutenzione regolare.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Poiché microglia fungono da cellule immunitarie sentinella del SNC, sono altamente sensible a reagire ai cambiamenti ambientali; di conseguenza, molta cura è necessaria per ridurre le risposte infiammatorie all'interno delle cellule durante il loro isolamento e cultura8. Questa operazione viene eseguita in questo protocollo attraverso velocità e temperatura. Ogni qualvolta possibile riduce notevolmente l'attivazione, quindi tutte le fasi di centrifugazione prendere posto a 4 ° C, mantenendo le cel...

Come i macrofagi del parenchima CNS, microglia interagire con una vasta gamma di circuiti neuronali e gliali reti di segnalazione. Essi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella omeostasi del cervello attraverso potatura sinaptica, liquidazione delle cellule apoptotiche e transitorie interazioni con processi neuronali1,2. Le microglia sono primi radar-risponditore a lesioni neurologiche, estendendo le proprie procedure lunghe e sottili ai siti di lesione per coordinare le risposte infiammatorie e limitare il sanguinamento3,4. Cambiamenti nella morfologia microglial e funzione sono onnipresenti nelle lesioni di CNS sia acute che croniche, e microglia espositivo alterata morfologia, localizzazione ed espressione dei mediatori infiammatori in una vasta gamma di Stati di malattia1. Gli studi genetici umani indicano che le mutazioni che alterano il rischio per le malattie neurodegenerative sono espressi spesso prevalentemente o esclusivamente da microglia nel SNC intatto, che punta a un ruolo critico di microglia nella patogenesi della malattia o la progressione5 . Dato loro risalto nella ferita e nella malattia, favorire la comprensione della biologia microglial è una priorità per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Molti avanzamenti critici per la comprensione della biologia microglial sono sorti estrapolando meccanismi scoperti negli studi di altre popolazioni del macrofago, inclusi i metodi di coltura, profili di espressione genica e definizioni di funzionali e tecniche / morfologica degli Stati. Anche se generalizzato del macrofago funzioni spesso giocano fuori in modo sorprendente all'interno del paesaggio di CNS, microglia sono essi stessi altamente specializzata, che esibiscono una morfologia ramificata e una firma di espressione genetica unica che li distingue da altri tessuti macrofagi6. Microglia hanno un lignaggio che è distinto dalla maggior parte degli altri macrofagi dei tessuti; Essi colonizzano SNC durante un'ondata di embrionale precoce dell'emopoiesi primitivo e auto-rinnovarsi per tutta la vita, indipendente di contributi da ematopoiesi definitivo7. La firma di espressione genica pienamente matura di microglia adulta non viene raggiunta fino alla seconda settimana postnatale8. Stimoli ambientali dal tessuto circostante ha un ruolo importante nel dettare tessuto-specifica del macrofago caratteristiche6, che nel SNC comprende limitata esposizione ai fattori ematica concesso dalla barriera emato - encefalica9.
Un ostacolo alla piena comprensione microglial contributi al CNS omeostasi e malattia è la difficoltà di ricapitolare le proprietà specializzate di microglia maturo visto nel vivo con le cellule purificate in vitro. Sono stati sviluppati molti metodi per isolare e cultura intatta microglia, ma la maggior parte degli approcci si basano su siero per sostenere la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dimostrato che l'aggiunta di siero, che è un reagente intrinsecamente variabile contenente una vasta gamma di molecole bioattive, è particolarmente problematico quando lavoro con microglia perché promuove una morfologia ameboide, aumento della proliferazione, e fagocitosi aumentata9 spesso visto in vivo quando microglia sono esposti a fattori di ematica dopo l'interruzione della barriera sangue - cervello. Di queste metriche, le cellule esposte al siero assomigliano microglia in lesioni o Stati di malattia, ma tali alterazioni sono ridotti quando microglia sono coltivate in mezzo di sviluppo definito contenente CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterolo e selenite.
Questo protocollo fornisce dettagli per la coltura di microglia giovanile del ratto nelle circostanze senza siero, relazionati al lavoro recentemente pubblicato9. Questo protocollo è stato ottimizzato per i ratti da giorno postnatale 21-30 (P21 - P30), ma può essere adattato per isolare microglia da ratti e topi di qualsiasi età, anche se resa e redditività complessiva varia a seconda della specie e l'età dell'animale. Maximal cede e redditività ottimale è raggiunta quando si utilizza un po' immatura microglia (~ P9), con rendimenti e vitalità si assottiglia gradualmente per un po ' i livelli più bassi negli animali adulti. Microglia può anche essere isolata dai topi, ma abbiamo trovato che le cellule del ratto mostrano significativamente più alti rendimenti, attuabilità e la complessità delle morfologie ramificate, rispetto alle cellule di topo in culture senza siero. Gli animali di età compresa tra maggiore di P50 non sono state valutate con questo protocollo. Questa procedura di isolamento di immunopanning è stata ottimizzata per minimizzare i cambiamenti nei profili trascrizionali microglial durante l'isolamento e per massimizzare a valle vitalità delle cellule. Utilizzando queste tecniche e formulazioni di media, alta redditività colture primarie possono essere sostenuti per settimane. Microglia in coltura in queste condizioni presentano una morfologia altamente ramificata che coinvolgono rapida estensione e retrazione dei processi e relativamente basso tasso di proliferazione. Evidenziamo il significato di siero-esposizione su queste proprietà e discutere i punti di forza e di debolezza di questo metodo rispetto altri approcci.

<table><tbody><tr><td>Ratto: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>topo anti-ratto CD11b monoclonale (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1.000; Colorazione: 1:500</td></tr><tr><td>Capra policolonale anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Colorazione: 1:500</td></tr><tr><td>Coniglio policlonale anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Macchia: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Colorazione: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-capra 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Colorazione: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Colorazione: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergente in colorazione ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan solfato</td><td>Galeno Forniture da laboratorio</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone da solidi del latte</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Lana di Pecora Colesterolo</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Cat # 354233</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat # 90260</td><td></td></tr><tr><td>11 (Z) Eicosadienoic (Gondoic) Acido</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Gatto # 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calceina AM colorante</td><td>Invitrogen Gatto</td><td># C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Etidio omodimero-1</td><td>Invitrogeno</td><td>Gatto # E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Gatto # DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Gatto # 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Gatto # T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>Gatto # 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>Gatto # 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Gibco</td><td>Gatto # 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil cisteina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat # A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Cat # 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat # T1147</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>Cat # S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alto glucosio)</td><td>Gibco</td><td>Cat # 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat # 0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina&nbsp;</td><td>Piastre Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagenti di riserva&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 10 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Selenito</td><td></td><td></td> di sodio <td>Ricostituzione: 2,5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:25.000 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Collagene IV</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 200 &mu; g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -80&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 2 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 200 &mu; g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -80&deg; C</td></tr><tr><td>Lana di pecora colesterolo</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 1,5 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Eparan solfato</td><td></td><td></td><td>Ricostituzione: 1 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Acido oleico/Acido</td><td></td><td></td> gondoico <td>Ricostituzione: Gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Stoccaggio: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Ricostituzione dell'eparina</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; Ricetta tampone </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion:</td><td></td><td></td><td>50 &mu; g/mL di eparina in DPBS++ (PBS con Ca++ e Mg+ +) Commenti: Utilizzare quando ghiacciato</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Ricetta: 200 &mu; L di 0,4% DNaseI in 50 mL di DPBS++ Commenti: Utilizzare quando il Panning ghiacciato</td></tr><tr><td>Ricetta del tampone</td><td></td><td></td><td>: 2 mg/mL di peptone da solidi del latte in DPBS++</td></tr><tr><td>Terreno di crescita della microglia (MGM)</td><td></td><td></td><td>Ricetta: DMEM/F12 contenente 100 unità/mL di penicillina, 100 &mu; g/mL di streptomicina, 2 mM di glutammina, 5 &mu; g/mL di N-acetil cisteina, 5 &mu; g/mL di insulina, 100 &mu; g/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di selenito di sodio Commenti: Utilizzare MGM ghiacciato per estrarre la microglia dal piatto di immnopanning.</td></tr><tr><td>Ricetta del rivestimento</td><td></td><td></td> di collagene IV<td>: MGM contenente 2 &mu; g/mL di collagene IV</td></tr><tr>Tampone <td></td><td></td> di<td>separazione della mielina</td><td>Ricetta: 9 mL di Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS senza Ca++ e Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 Commenti: Mescolare bene dopo l'aggiunta di&nbsp; CaCl2 e MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Colesterolo contenente mezzi di crescita (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ricetta: MGM contenente 2 ng/mL di TGF-b2 umano, 100 ng/mL di IL-34 murino, 1,5 &mu; g/mL di colesterolo della lana ovina, 10 &mu; g/mL di eparan solfato, 0,1 &mu; g/ml di acido oleico e 0,001 &mu; g/ml di acido gondoico Commenti: Assicurati di aggiungere colesterolo ai terreni riscaldati a 37 gradi C e non aggiungere più di 1,5 &mu; g/mL o precipiterà fuori. Non filtrare i terreni contenenti colesterolo. Equilibrare il terreno TIC con il 10% di CO2 per 30 minuti-1 ora prima di aggiungerlo alle cellule per assicurare un pH ottimale.</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in medium senza siero

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia rappresentano il 5-10% di tutte le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e sono di disegno sempre più attenzione grazie al loro contributo durante lo sviluppo, l'omeostasi e la malattia. I macrofagi sono stati studiati in dettaglio per decenni, caratteristiche specializzate di microglia, i macrofagi residenti in tessuto del SNC, sono rimaste in gran parte misterioso, in parte a causa di limitazioni nella capacità di ricapitolare microglial maturo Proprietà nella cultura. Qui, vi illustriamo una procedura semplice per l'isolamento rapido di microglia pura da roditore cervello maturo. Descriviamo anche condizioni di coltura privo di siero che supportano alti livelli di redditività microglial nel corso del tempo. Microglia coltivate in queste condizioni definite e medie mostre elaborati processi ramificati e comportamento dinamico sorveglianza. Illustriamo alcuni effetti di esposizione sierica sulla microglia coltivate ed discutere come queste culture senza siero confrontare culture siero-esposti così come il microglia in vivo.

Questo protocollo descrive un metodo di cultura elevata purezza ramificata microglia da ratti giovani. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando animali immaturi, perinatali e adulti, come discusso di seguito. Poiché gli isolamenti delle cellule includono spesso sottili sfumature e molte opportunità per cellule di morire, abbiamo usato i punti di controllo di controllo di qualità per aiutare a determinare il successo alle varie fasi. Abbiamo controllato in genere sospensioni ce...

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare è quello di generare colture altamente pure di microglia da roditori in via di sviluppo o adulti che possono essere mantenute senza esposizione al siero. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze relative alla morfologia della microglia, alla chetosi fibrosa e all'interazione della microglia con altri tipi di cellule del SNC. Il vantaggio principale di questo protocollo è che le microglia possono essere rapidamente isolate da tessuti di roditori di qualsiasi età e coltivate senza esposizione al siero.Per rimuovere il cervello, tagliare il condilo occipitale dal midollo spinale di un animale su entrambi i lati con le forbici da dissezione, facendo attenzione a non danneggiare il cervello. Quindi, tagliare la pelle lungo la parte superiore del cranio e tagliare un lato lungo l'osso parietale e frontale verso l'osso nasale. Tirare indietro con cautela la parte superiore del cranio con una pinza, rimuovere rapidamente il cervello e metterlo in DPBS preraffreddato su ghiaccio.Ripetere la procedura per tutti gli animali rimanenti. Dopo che i cervelli sono stati raccolti in DPBS freddo, tagliare ogni cervello in pezzi di un cubo di millimetro in una capsula di Petri su ghiaccio con una lama di bisturi fredda e trasferirli in un omogeneizzatore dounce ghiacciato con cinque-sette millilitri di tampone douncing ghiacciato. Quindi, utilizzare un omogeneizzatore a balza larga per dissociare il tessuto con 10-20 passaggi delicati e incompleti.Fare attenzione a non schiacciare direttamente il fazzoletto sul fondo dell'omogeneizzatore. Invece, spingere il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore. È importante omogeneizzare lentamente il tessuto con più cicli di douncing per preservare la vitalità della microglia.Successivamente, rimuovere con cautela il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Lasciare che i pezzi di tessuto scarsamente dissociati si depositino sul fondo dell'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri raffreddata. Successivamente, sostituire il volume rimosso con un tampone di douncing fresco e ripetere la procedura di dissociazione per un totale di tre o quattro cicli, o fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato.In questa procedura, aggiungere un tampone douncing ghiacciato al tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare e regolare il volume totale a 33,5 millilitri. Quindi, aggiungere 10 millilitri di MSB alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo più volte. Ciò si tradurrà in una concentrazione finale del 23% di MSB in un volume di 43,5 millilitri.Dopodiché, centrifugare le celle per 15 minuti a 500 x g a 4 gradi Celsius con una frenata lenta. Quindi, rimuovere lo strato superiore di mielina e detriti e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per assicurarsi che venga rimosso il più possibile.Successivamente, risospendere il pellet della cella in 12 millilitri di tampone di panning. Triturare delicatamente la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule rimanenti. In questa fase, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri per rimuovere detriti o grumi cellulari di grandi dimensioni.Sciacquare tre volte la teglia rivestita OX42 con DPBS. Non lasciare che la piastra si asciughi completamente tra un lavaggio e l'altro. Versare l'ultimo lavaggio DPBS e applicare la sospensione cellulare filtrata sulla pirofila.Agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule. Quindi, incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Non incubare per più di 20 minuti, altrimenti le cellule diventeranno molto difficili da recuperare dalla capsula.Successivamente, sciacquare la teglia con DPBS 10 volte per rimuovere le cellule non aderenti. La microglia sarà saldamente attaccata alla piastra, quindi agitare la piastra ad ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti. Versare l'ultimo lavaggio DPBS e sostituirlo con 15 millilitri di DPBS e 200 microlitri di tripsina.Per tripsinizzare le cellule, incubare la capsula per meno o uguale a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di tripsinizzazione, la microglia sarà ancora attaccata alla piastra. Versare il composto e lavare delicatamente la piastra due volte con DPBS per rimuovere la tripsina.Quindi, sostituire con 12 millilitri di MGM ghiacciato. Successivamente, posizionare la pirofila sul ghiaccio per due minuti per indebolire l'interazione tra cellula e substrato e assicurarsi che la pirofila sia piatta per evitare che le aree della pirofila si secchino. Successivamente, pipettare energicamente con una pipetta da 10 millilitri e un controller per pipette ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto di cottura.Disegna una griglia 16 per 16 con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule. È importante trovare un equilibrio tra il recupero cellulare generale e la salute della coltura. Il pipettaggio ripetuto del surnatante cellulare contro la piastra di panning comporterà una riduzione della vitalità della coltura.Controllare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 20x per assicurarsi che si siano staccate dalla piastra. Contrassegnare i punti sulla parte superiore della piastra in cui sono bloccate le cellule e ripetere il pipettaggio in quelle aree. Raccogliere la sospensione cellulare e allocare da tre a quattro millilitri di surnatante in ciascuna provetta conica da 15 millilitri.Centrifugare per 15 minuti a 500 x g a quattro gradi Celsius con una frenata lenta. Dopo 15 minuti, aspirare il surnatante, lasciando 0,5 millilitri di MGM con il pellet cellulare. Quindi, risospendere ogni pellet nell'MGM rimanente ed estrarre le celle da tutte le provette.Successivamente, contare le cellule con un emocitometro. Ora, piastreggiare 15 microlitri di rivestimento IV di collagene direttamente al centro di una piastra di coltura tissutale rivestita cationica anionica a 24 pozzetti e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, diluirle a 2,3 x 10 fino a cinque per millilitro in MGM.Aspirare il collagene IV e preparare immediatamente 15 microlitri di sospensione cellulare in questo punto per ottenere 3,5 x 10 alle tre cellule per punto. Quindi, incubare per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire. Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di TIC bilanciato con CO2 al pozzetto.Se si esegue la placcatura sui vetrini, rivestire prima i vetrini di vetro sterili con 10 microgrammi per millilitro PDL in acqua per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavateli tre volte con acqua e lasciateli asciugare in una cappa sotto la luce UV prima di procedere con la placcatura a punti sui vetrini. Al fine di dimostrare il successo dell'isolamento e della coltura di microglia altamente pure, abbiamo isolato le microglia da ratti P21 e abbiamo coltivato queste cellule in TIC o TIC integrate con FCS al 10% per otto giorni.Le cellule sono state quindi fissate e colorate con marcatori microgliali e marcatori di proliferazione. Le cellule coltivate in TIC mostrano una morfologia ramificata, bassi livelli di proliferazione ed espressione di marcatori microgliari. In confronto, le cellule coltivate in TIC integrate con il 10% di FCS sono anche colorate per marcatori microgliali, ma mostrano alti livelli di proliferazione e morfologia ameboide, proprietà spesso osservate nelle microglia attivate.Oltre alla colorazione per i marcatori cellulari, l'RNA-Seq sulle cellule appena isolate può fornire uno strumento potente e sensibile per valutare il profilo RNA delle cellule e può aiutare a informare la purezza iniziale delle colture. Il micropanning CD11b determina tipicamente una piccola percentuale di neutrofili CD11b positivi e di carryover di monociti, oltre alla microglia CD11b positiva. Queste cellule moriranno in TIC dopo pochi giorni, ma possono complicare l'analisi dei punti temporali precedenti.Ecco un filmato in time lapse della microglia di ratto P21 dopo 14 DIV in TIC. Dopo due settimane, le colture prive di siero mostrano un comportamento di sorveglianza dinamico con rapide estensioni e retrazioni del processo in tutta la piastra. Ecco un filmato in time lapse della microglia di ratto P21 dopo cinque DIV in TIC prima e dopo l'esposizione al siero fetale di vitello.Un rapido cambiamento morfologico è evidente dopo l'esposizione al siero. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in quattro o cinque ore, se eseguito correttamente. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti altri test per monitorare la fagocitosi, la chemiotassi, la sopravvivenza, il rilascio di citochine, le risposte trascrizionali agli stimoli, al fine di rispondere a ulteriori domande sulla funzione della microglia.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come isolare rapidamente le microglia dal tessuto di roditore adulto e coltivarle in condizioni di assenza di siero.

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Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Questo video mostra un metodo per isolare e coltivare microglia da cervelli di ratto. Comporta la separazione della microglia da altre cellule neuronali e non neuronali utilizzando piastre rivestite con un anticorpo monoclonale specifico per la microglia.

Isolamento e coltura di microglia da cervelli di ratto utilizzando terreni privi di siero

Questo video dimostra una tecnica per la rimozione selettiva della microglia da una coltura neuronale primaria di ratto. I neuroni dei granuli cerebellari vengono trattati con un antimetabolita per eliminare le cellule gliali proliferanti. Inoltre, vengono trattati con agenti mirati ai lisosomi per esaurire la microglia dalla coltura.

Rimozione selettiva della microglia da una coltura di neuroni di granuli cerebellari di ratto

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.

Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.

Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo

Impara a isolare e coltivare microglia pura da roditori in mezzo senza siero. Questo metodo preserva la morfologia ramificata e supporta lo studio delle interazioni cellulari nel sistema nervoso centrale.

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

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