Name: Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nellintero tessuto dello SNC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Scopri i metodi psPACT e mPACT per la rapida trasparenza ottica del tessuto SNC intero nei roditori. Queste tecniche innovative accelerano l'analisi microscopica della vascolarità cerebrale senza danni elettroforetici.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto cervello Corea 21 PLUS per la scienza medica, Università di Yonsei. Inoltre, questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca appropriato presso Yonsei University College of Medicine. Tutti gli animali sperimentali sono sacrificati in conformità con le linee guida del Comitato di cura degli animali di laboratorio presso Yonsei University College of Medicine.
1. preparazione dei reagenti
Attenzione: Paraformaldeide (PFA), acrilammide e sodio dodecil solfato (SDS) sono irritanti tossici e quindi deve essere maneggiato in una cappa con appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE; camice da laboratorio, guanti, occhiali protettivi).
<ol><li>soluzione di acrilammide (Agosta) 4% (A4P0): aggiungere 20 mL della soluzione di 40% di acrilammide a 180 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>0,25% VA-044 soluzione: aggiungere 0,5 g di 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dicloridrato (VA-044) polvere a 200 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS). Mentre la polvere VA-044 può essere conservata a temperatura ambiente, esso deve essere conservato a 4 ° C su solubilizzazione in PBS. Per risultati ottimali, è necessario preparare solo la quantità di soluzione necessaria per l'esperimento.</li>
	<li>Soluzione cocktail patto: aggiungere 10 g di acrilammide a 225 mL di soluzione al 4% paraformaldeide (PFA) e regolare il volume a 200 mL con 4% PFA. Prima dell'uso, aggiungere 100 mg di polvere di VA-044 a 40 mL della miscela in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>PATTO di cancellazione soluzione buffer: aggiungere 40 g di sodio dodecil solfato (SDS) a 350 mL di PBS 0.1 M e regolare il volume a 500 mL con 0.1 M PBS. Per mPACT deselezionando la soluzione, aggiungere 0,5% α-thioglycerol il patto cancellazione soluzione buffer.</li>
	<li>I topi utilizzati in questo studio erano topi maschii di BALB 2-settimana-vecchio; i ratti utilizzati in questo studio erano SD-ratti maschii di 2 settimane di età.</li>
</ol>2. anestesia e chirurgia di perfusione
Attenzione: PFA e acrilammide sono irritanti tossici e così deve essere gestite in una cappa aspirante con PPE appropriato.
<ol><li>Anestetizzare l'animale in una stanza senza agente patogeno con 30 mg/kg di zoletil utilizzando una siringa da 1 mL con ago 26-gauge. Monitorare l'animale per 5-10 min.</li>
	<li>Una volta che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia, è possibile utilizzare il metodo di risposta di punta-pizzico per determinare la profondità dell'anestesia. Confermare l'apatia. Nota: La seguente procedura che coinvolge la chirurgia di topo e di ratto seguire un simile protocollo usato in un precedente studio11.</li>
	<li>Fare un'incisione di 5-6 cm sotto la gabbia toracica, attraverso il tegumento e la parete addominale.</li>
	<li>Usare le forbici curve, smussate per fare un'incisione nel diaframma, palpare la zona toracica per individuare il sito di incisione in anticipo.</li>
	<li>Estendere l'incisione su tutta la lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.</li>
	<li>Spostare con cautela i polmoni. Fare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Utilizzando le forbici iris, praticare una piccola incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro. Inserire un ago calibro 18 con punta blunt o d'oliva aspersione nell'aorta ascendente, passando attraverso il ventricolo di taglio.</li>
	<li>Fissare l'ago ed evitare dispersioni di bloccaggio il cuore con una pinza emostatica. In alternativa, utilizzare una pinza emostatica modificata per bloccare l'aorta intorno alla punta dell'ago.</li>
	<li>Fare una grande incisione nell'atrio di destra, avendo cura di assicurare il minimo danno all'aorta discendente. Il ratto è ora pronto per aspersione.</li>
</ol>3. intera aspersione e dissezione del ratto
Attenzione: PFA e acrilammide sono irritanti tossici e così deve essere gestite in una cappa aspirante con PPE appropriato.
Nota: I seguenti passaggi di aspersione intero sono un simile a un protocollo utilizzato in uno studio precedente di Woo et al. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Collegare l'atrio destro del cuore a un ago calibro 18, avendo cura di non introdurre eventuali bolle d'aria.</li>
	<li>Usando una siringa da 50 mL, rapidamente e in modo uniforme pompa 50 mL di soluzione di PBS 0.1 M fredda contenente eparina (10 unità/mL).</li>
	<li>Collegare l'ago calibro 18 al tubo della pompa peristaltica.</li>
	<li>Lavare con 200 mL di soluzione di PBS 0.1 M fredda contenente eparina (10 unità/mL) ad una velocità di circolazione di 10 mL/min.</li>
	<li>Difficoltà con 250 mL di soluzione fredda di PFA 4% ad una velocità di circolazione di 10 mL/min. In questa fase, il topo deve essere rigido.</li>
	<li>Raccogliamo e memorizziamo la soluzione rimanente PFA per lo smaltimento.</li>
	<li>Per patto, irrorare i tessuti con una soluzione di cocktail patto refrigerato di 4% PFA, 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 polvere con un ago calibro 18 e quindi rimuovere la testa e la spina dorsale. Esporre il cranio con un'incisione del midline dal collo al naso. Questo passaggio aggiuntivo aspersione è inutile per i metodi psPACT e mPACT; Dopo la fissazione, immediatamente isolare la testa e la colonna vertebrale e il cranio di esporre.</li>
	<li>Esporre la base del cranio, eliminando qualsiasi residuo collo e muscoli della colonna vertebrale.</li>
	<li>Utilizzare Pinze ossivore e forbici per staccarsi il cranio. Rimuovere il cervello e il midollo spinale.</li>
	<li>Conservare il tessuto in 4% PFA a 4 ° C; tessuti possono essere memorizzati fino a 1 settimana.</li>
</ol>4. idrogel monomero infusione e polimerizzazione del Mouse e del ratto SNC
Attenzione: Acrilamide, SDS, α-thioglycerol e PFA sono irritanti e così deve essere gestito in una cappa aspirante e con la pipì appropriato.
<ol><li>
PATTO (passivo tecniche di taglio)
	<ol>
<li>Isolare e cultura SNC intero (cervello e midollo spinale) da fissi topi e ratti a un tubo da 50 mL contenente una soluzione di cocktail patto refrigerata di 4% PFA, 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 polvere e conservare a 4 ° C per 24 h. Assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nella s oluzione.</li>
		<li>Incorporare il campione in gas di azoto per 10 min utilizzando un tessuto gel sistema di ibridazione collegato ad un serbatoio di azoto: impostare il sistema a 37 ° C. Transfer tessuti a un tubo da 50 mL contenente freddo fresco (4 ° C) patto soluzione cocktail e connetterti con cappuccio del tubo, quindi applicare il vuoto.</li>
		<li>Per polimerizzare l'idrogel, posto nella provetta contenente il campione in un incubatore d'agitazione (150 giri/min, 37 ° C) per 3 ore, o fino a quando la polimerizzazione è completa.</li>
		<li>Utilizzando la carta assorbente (Vedi Tabella materiali), Rimuovi il restante idrogelo polimerizzato i tessuti circostanti.</li>
		<li>Trasferire il tessuto a un tubo da 50 mL contenente soluzione di schiarimento (8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>Il campione viene posto in un'incubatrice agitazione impostata a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 20 giorni per il mouse CNS per raggiungere piena chiarezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (tecnica di compensazione passiva separata di processo)
	<ol>
<li>Isolare l'intero CNS (cervello e midollo spinale) con osso cutter e forbici da PFA-fisso di topi e ratti su un banco pulito.</li>
		<li>Tessuti di trasferimento di un tubo da 50 mL contenente 4% PFA e conservare a 4 ° C per 24 h. garantire che il tessuto è completamente immerso nel fissativo.</li>
		<li>Lavare il tessuto fisso per 1 h in 0.1 M PBS e poi il trasferimento a A4P0 soluzione (4% di acrilammide in 0.1 M PBS). Negozio a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Lavare il tessuto per 5 min in 0.1 M PBS.</li>
		<li>Immergere il tessuto in 0,25% VA-044 in 0.1 M PBS. Conservare a 37 ° C per 6-24 ore e poi il trasferimento al soluzione fresca di VA-044/PBS 0,25%.</li>
		<li>Incorporare il campione in gas di azoto per 10 min utilizzando un tessuto di ibridazione del gel sistema (Vedi Tabella materiali) collegato ad un serbatoio di azoto: Transfer tessuti a un tubo da 50 mL contenente freddo fresco (4 ° C) 0,25% soluzione VA-044/PBS e connetterti con tappo della provetta. Applicare il vuoto.</li>
		<li>Trasferire il tessuto a compensazione soluzione (8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>Incubare il campione in un incubatore agitazione impostato a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 17 giorni per mouse SNC a raggiungere piena chiarezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MPATTO (tecnica di compensazione passiva modificata)
	<ol>
<li>Isolare l'intero CNS (cervello e midollo spinale) con osso cutter e forbici da PFA-fisso di topi e ratti su un banco pulito.</li>
		<li>Seguire i passaggi 4.2.2 - 4.2.8 del protocollo psPACT.</li>
		<li>Trasferire la soluzione di compensazione il tessuto. Si noti che, diversamente dai protocolli di patto e psPACT, mPACT richiede una soluzione di schiarimento composto da 0,5% α-thioglycerol oltre 8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol è un agente delle Nazioni Unite-doratura più rapido ed efficace nell'eliminazione del tessuto. Assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nella soluzione.</li>
		<li>Il campione viene posto in un'incubatrice agitazione impostata a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 2 settimane per mouse SNC a raggiungere piena chiarezza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. indice di rifrazione di corrispondenza e Immunostaining del CNS deselezionata
Nota: cerchi n(soluzione basata su Nycodenz indice di rifrazione di corrispondenza) è composto di 0,8 g/mL Nycodenz polvere sciolta in 30 mL di tampone di base (0,01% sodio azide e Tween-20 in PBS di 0,1 M, pH 8.0). È consigliabile che la soluzione sia collocata in un 37 ° C in agitazione incubatore per consentire adeguata solvatazione della polvere.
<ol><li>Incubare tessuti nello 0,1% Triton X-100 in 0.1 M PBS per 2 h, quindi bloccare con 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 0.1 M PBS per 6 h.</li>
	<li>Lavare sezioni tre volte in PBST (0.1% Tween-20 in 0.1 M PBS) per 2 h. macchia sezioni con gli anticorpi primari (in questo caso, un anticorpo anti-coniglio PECAM-CD31, che le macchie di vasi sanguigni) per 2 giorni.</li>
	<li>Macchia di sezioni con anticorpi secondari (in questo caso, un capra anti-coniglio Cy3 IgG coniugato fluorescente) nel 2% BSA per 2 giorni.</li>
	<li>Lavare con etichetta tessuti tre volte in PBST per 2 h e negozio in 15 mL ncerchi per 2-10 giorni.</li>
	<li>Prima di formazione immagine, spostare con etichettate tessuti una piccola quantità di ncerchi su piastre di coltura del tessuto di 35 o 60 mm. Difficoltà con il silicone intorno al bordo inferiore del piatto.</li>
	<li>Aggiungere 1,5-2 mL di fresco ncerchi.</li>
</ol>6. image processing
<ol><li>Acquisire immagini dei tessuti sgomberati con mattonelle scansione utilizzando un ingrandimento di 10x microscopewith scansione laser confocale (Vedi Tabella materiali). Del tessuto Cy3-etichetta, utilizzare lunghezze d'onda di 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre i metodi di estrazione passivo, elettroforesi-impiegato nel patto ha migliorato significativamente la consistenza realizzata con tessuto precedente schiarimento metodi ad esempio chiarezza2,3,4,7 , 8, la tecnica porta ancora varie carenze, la più urgente delle quali è la lunghezza del tempo necessario per raggiungere il tessuto massima chiarezza<sup cla...

Un obiettivo fondamentale di indagine scientifica e clinica coinvolge il raggiungimento di una completa comprensione della struttura dell'organo e funzione; Tuttavia, la natura estremamente complessa di organi mammiferi spesso funge da barriera per realizzare pienamente questo obiettivo1. CHIAREZZA (chiaro del lipido-scambiati acrilamide-ibridato rigida Imaging-compatibile tessutale-idrogel)2,3,4, che prevede la costruzione di un ibrido di idrogel a base di acrilammide dai tessuti intatti, raggiunge gioco ottico di una varietà di organi, compreso il cervello, il fegato e la milza, preservando la loro integrità strutturale5. CHIAREZZA così ha permesso non solo la visualizzazione, ma anche la possibilità di sezionare finemente complesse reti cellulari e morfologie di tessuto senza l'esigenza di sezionamento.
Al fine di ottenere la liquidazione del tessuto, chiarezza impiega i metodi elettroforetici per rimuovere il contenuto lipidico del campione a portata di mano. Mentre la chiarezza è stato notato per la produzione di ibridi fisicamente stabile del tessuto-idrogel, studi hanno dimostrato che l'uso di metodi di schiarimento (ecc) di tessuto elettroforetica produce risultati variabili in termini di qualità dei tessuti, tra cui browning, epitopo danni, e proteina perdita5,6. Per risolvere questi problemi, protocolli modificati come patto (passivo chiarezza tecnica), che sostituisce il trattamento ecc con una tecnica passiva, ionico-detergente delipidizzazione base, sono stati sviluppati7,8,9. Malgrado il raggiungimento di una maggiore coerenza nei risultati, tuttavia, il patto richiede più tempo per ottenere la massima altezza. Inoltre, nessuna di queste tecniche sono ancora stata applicata per l'intero modulo di CNS, o nei modelli più grandi roditori quali ratti e cavie.
Il presente studio cerca di affrontare queste limitazioni, proponendo nuove metodologie, psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), per facilitare il gioco veloce del SNC intero e organi interni nel topo e ratto modelli10. In particolare, psPACT processi tessuti in 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 in due passaggi separati durante la formazione di idrogel; MPATTO essenzialmente coinvolge la stessa procedura, ma integra la soluzione basata su SDS schiarimento con 0,5% α-thioglycerol come reagente chiave. Entrambe le tecniche sfruttano sistemi circolatorio sistemici e cerebrospinali endogeni per ridurre significativamente il tempo necessario per produrre gioco ottico. Come prova di principio, dimostriamo l'uso della microscopia confocale per analizzare modelli di vaso sanguigno nei tessuti sgomberati10.

<table><tbody><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Soluzione di pulizia</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>soluzione nRIMS</td></tr><tr><td>40% soluzione di acrilammide</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polimerizzazione (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&acuto;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] Dicloridrato</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polimerizzazione (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Tioglicerina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Soluzione di chiarificazione (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>Soluzione nRIMS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno Colorazione</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Eparina immunocolorante</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusione (PBS)</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Soluzione nRIMS</td></tr><tr><td>Anticorpo PECAM-CD31 Santa</td><td>Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Colorazione</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio-IgG Cy3 coniugato fluorescente</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immuno Colorazione</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusione, Polimerizzazione</td></tr><tr><td>20X Soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4)</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusione, tampone</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Trasferimento di soluzione</td></tr><tr><td>Provetta da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Tubo di compensazione</td></tr><tr><td>35 mm Piatto per coltura cellulare</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Piatto confocale</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anestetizzare&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusione</td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polimerizzazione (A4P0)</td></tr><tr><td>Carta Whatman 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Carta assorbente per la rimozione del gel</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Sistema di ibridazione su gel tissutale</td></tr></tbody></table>

romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello snc

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Poiché lo sviluppo di chiarezza, un bioelectrochemical tecniche di taglio che consente per la mappatura tridimensionale fenotipo all'interno dei tessuti trasparenti, una moltitudine di schiarimento romanzo metodologie tra cui CUBIC (imaging cerebrale chiaro, senza ostacoli cocktail e analisi computazionale), SWITCH (tutto il sistema di controllo del tempo di interazione) e cinetica di sostanze chimiche, mappa (ingrandita analisi del proteoma) e patto (tecnica passiva chiarezza), sono stati istituiti per espandere ulteriormente il toolkit esistente per l'analisi microscopica dei tessuti biologici. Il presente studio mira a migliorare e ottimizzare la procedura di patto originale per una matrice di tessuti roditore intatti, compreso l'intero sistema nervoso centrale (CNS), reni, milza ed embrioni del mouse intero. Denominato psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), queste nuove tecniche forniscono altamente efficace mezzo di mappatura circuito di cella e la visualizzazione di strutture subcellulari nei tessuti normali e patologici intatti. Nel seguente protocollo, forniamo un contorno dettagliate su come raggiungere la distanza massima del tessuto con l'invasione minima della loro integrità strutturale tramite psPACT e mPACT.

Generazione di un modello trasparente dello SNC intero utilizzando tecniche di compensazione passiva ottimizzata
Ottica clearance di topo e ratto tessuti dello SNC interi rapidamente è stata ottenuta utilizzando varie tecniche di compensazione passiva (Figura 1). Un disegno schematico del tessuto di compensazione nel corso del tempo è mostrato nella Figura 2A</s...

Qui, presentiamo due nuove metodologie, psPACT e MPATTO, per raggiungere la massima trasparenza ottica e la successiva analisi microscopica del sistema vascolare del tessuto nel roditore intatto tutta CNS.

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

L'obiettivo generale di questi metodi psPACT e mPACT è la rapida eliminazione dell'intero tessuto del SNC senza la necessità di un sistema di pulizia del tessuto elettroforetico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei modelli di ricerca sulle malattie umane, come il morbo di Alzheimer o le lesioni, la degenerazione e la tumorigenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto del SNC del topo non viene danneggiato dalla pulizia elettroforetica del tessuto e viene rapidamente eliminato dalla pulizia passiva modificata.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo aver utilizzato il PACT originale e il metodo precedente per la pulizia del cervello. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i metodi psPACT e mPACT sono difficili da eseguire perché questo metodo prevede più fasi di preparazione del campione. Inizia preparando la soluzione del cocktail PACT aggiungendo la polvere di VA-044 a una soluzione di PFA al 4% e all'acrilammide al 4% a una concentrazione finale dello 0,25%Dopo aver perfuso i tessuti con la soluzione PACT, immergere completamente l'intero cervello e il midollo spinale in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione PACT refrigerata e conservare a quattro gradi Celsius per 24 ore.24 ore dopo, trasferire il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione PACT fresca e fredda e collegare il tappo della provetta a un sistema di ibridazione su gel tissutale, collegato a un serbatoio di azoto e impostato a 37 gradi Celsius. Quindi, accendere il vuoto e gasare per 10 minuti per incorporare il campione nell'azoto gassoso. Per polimerizzare l'idrogel, posizionare la provetta contenente il campione in un incubatore di agitazione impostato a 150 giri/min e 37 gradi Celsius per tre ore o fino al completamento della polimerizzazione.Dopo l'incubazione, utilizzare carta assorbente per rimuovere l'idrogel polimerizzato rimanente che circonda i tessuti. Quindi, trasferire il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione schiarente. Posizionare il campione in un incubatore di agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato eliminato.In media, il SNC del topo impiega circa 20 giorni per raggiungere la piena chiarezza. Iniziare psPACT con il SNC da un topo perfuso con il 4% di PFA che è stato post-fissato in 4% di PFA a quattro gradi Celsius per 24 ore. Lavare il tessuto fissato per un'ora in PBS 0,1 molare.Dopo il lavaggio, trasferire il fazzoletto nella soluzione A4P0 e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, dopo aver lavato il fazzoletto in PBS per cinque minuti, immergere il fazzoletto in 0,25% VA-044 in PBS e incubare a 37 gradi Celsius per sei-24 ore. La separazione dell'acrilammide e la successiva fase VA-044 evitano la necessità di rimuovere i residui di monomeri di idrogel non polimerizzati che circondano il tessuto, che possono compromettere l'integrità finale del tessuto dopo aver raggiunto la trasparenza con PACT.Dopo l'incubazione, trasferire i tessuti nella soluzione VA-044 fresca e fredda. Quindi, incorporare il campione in azoto gassoso per 10 minuti. Trasferire il fazzoletto nella soluzione di pulizia.Quindi, incubare il campione in un incubatore con agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato pulito. In media, il SNC del topo impiega circa 17 giorni per raggiungere la piena chiarezza. Per mPACT, seguire il protocollo per psPACT fino al passaggio della soluzione di compensazione.Quindi, immergere completamente la soluzione per la pulizia dei tessuti contenente lo 0,5% di alfa-tioglicerolo, un agente anti-imbrunimento, oltre all'8% di SDS in PBS 0,1 molare. Posizionare il campione in un incubatore di agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato eliminato. In media, il SNC del topo impiega solo due settimane per raggiungere la piena chiarezza utilizzando mPACT.Nel presente studio, i campioni di cervello di topo trattati tramite il protocollo mPACT hanno raggiunto la trasparenza ottica dopo 14 giorni, prima dei campioni trattati tramite i protocolli PACT e psPACT. I campioni interi del SNC di ratto eliminati con mPACT hanno raggiunto la massima clearance in 20 giorni. Il cervello di ratto adulto da solo, al contrario dell'intero SNC, è stato eliminato con mPACT in soli cinque giorni.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane con il topo con l'intero SNC se viene eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze e dell'anatomia per esplorare le malattie fisiopatologiche, come le lesioni tissutali, le malformazioni dello sviluppo, il cancro e le malattie neurodegenerative nei modelli di SNC dei mammiferi.

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Le tecniche di pulizia ottica stanno rivoluzionando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. In questo rapporto descriviamo le modifiche del protocollo originale Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Acrylamide-hybridized Imaging compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) che produce risultati più coerenti e meno costosi.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

ACT-PRESTO (attivo chiarezza tecnica pressione legati trasferimento efficiente e stabile delle macromolecole in organi) consente una rapida, efficace, ma poco costoso compensazione dei tessuti e la penetrazione degli anticorpi rapida nei tessuti liberata da diffusione passiva o la consegna a pressione assistita. Utilizzando questo metodo, una vasta gamma di tessuti può essere cancellato, immunolabeled da più anticorpi e volume-ripreso.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

Gli sferoidi tumorali stanno diventando sempre più utilizzati per valutare le interazioni cellula tumorale-microambiente e la risposta terapeutica. Il presente protocollo descrive un metodo robusto ma semplice per l'imaging semi-ad alto rendimento di sferoidi tumorali 3D utilizzando la rapida compensazione ottica.

Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Questo protocollo combina la chiarificazione ottica e l'immunomarcatura per l'imaging confocale a volume completo di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva la struttura 3D, consentendo la visualizzazione dettagliata dei percorsi neuronali chiave, migliorando lo studio della maturazione retinica, l'organizzazione spaziale e le sue potenziali applicazioni nella modellazione delle malattie e nella medicina personalizzata.

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Le tecniche di chiarificazione ottica, come l'assorbimento di soluzioni molecolari, riducono temporaneamente la dispersione della luce per migliorare l'imaging biologico e offrire strategie di imaging in vivo biocompatibili e reversibili per organi profondamente incorporati. Questo protocollo presenta procedure sperimentali dettagliate e un'elaborazione avanzata delle immagini per ottenere immagini dinamiche di alta qualità per la dinamica in tempo reale negli animali vivi.

Clearing ottico transitorio utilizzando molecole assorbenti per l'imaging ex vivo e in vivo

Scopri i metodi psPACT e mPACT per la rapida trasparenza ottica del tessuto SNC intero nei roditori. Queste tecniche innovative accelerano l'analisi microscopica della vascolarità cerebrale senza danni elettroforetici.

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

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