Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC
8 maggio 2018
Qui, presentiamo due nuove metodologie, psPACT e MPATTO, per raggiungere la massima trasparenza ottica e la successiva analisi microscopica del sistema vascolare del tessuto nel roditore intatto tutta CNS.
L'obiettivo generale di questi metodi psPACT e mPACT è la rapida eliminazione dell'intero tessuto del SNC senza la necessità di un sistema di pulizia del tessuto elettroforetico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei modelli di ricerca sulle malattie umane, come il morbo di Alzheimer o le lesioni, la degenerazione e la tumorigenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto del SNC del topo non viene danneggiato dalla pulizia elettroforetica del tessuto e viene rapidamente eliminato dalla pulizia passiva modificata.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo aver utilizzato il PACT originale e il metodo precedente per la pulizia del cervello. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i metodi psPACT e mPACT sono difficili da eseguire perché questo metodo prevede più fasi di preparazione del campione. Inizia preparando la soluzione del cocktail PACT aggiungendo la polvere di VA-044 a una soluzione di PFA al 4% e all'acrilammide al 4% a una concentrazione finale dello 0,25%Dopo aver perfuso i tessuti con la soluzione PACT, immergere completamente l'intero cervello e il midollo spinale in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione PACT refrigerata e conservare a quattro gradi Celsius per 24 ore.
24 ore dopo, trasferire il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione PACT fresca e fredda e collegare il tappo della provetta a un sistema di ibridazione su gel tissutale, collegato a un serbatoio di azoto e impostato a 37 gradi Celsius. Quindi, accendere il vuoto e gasare per 10 minuti per incorporare il campione nell'azoto gassoso. Per polimerizzare l'idrogel, posizionare la provetta contenente il campione in un incubatore di agitazione impostato a 150 giri/min e 37 gradi Celsius per tre ore o fino al completamento della polimerizzazione.
Dopo l'incubazione, utilizzare carta assorbente per rimuovere l'idrogel polimerizzato rimanente che circonda i tessuti. Quindi, trasferire il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente una soluzione schiarente. Posizionare il campione in un incubatore di agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato eliminato.
In media, il SNC del topo impiega circa 20 giorni per raggiungere la piena chiarezza. Iniziare psPACT con il SNC da un topo perfuso con il 4% di PFA che è stato post-fissato in 4% di PFA a quattro gradi Celsius per 24 ore. Lavare il tessuto fissato per un'ora in PBS 0,1 molare.
Dopo il lavaggio, trasferire il fazzoletto nella soluzione A4P0 e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, dopo aver lavato il fazzoletto in PBS per cinque minuti, immergere il fazzoletto in 0,25% VA-044 in PBS e incubare a 37 gradi Celsius per sei-24 ore. La separazione dell'acrilammide e la successiva fase VA-044 evitano la necessità di rimuovere i residui di monomeri di idrogel non polimerizzati che circondano il tessuto, che possono compromettere l'integrità finale del tessuto dopo aver raggiunto la trasparenza con PACT.
Dopo l'incubazione, trasferire i tessuti nella soluzione VA-044 fresca e fredda. Quindi, incorporare il campione in azoto gassoso per 10 minuti. Trasferire il fazzoletto nella soluzione di pulizia.
Quindi, incubare il campione in un incubatore con agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato pulito. In media, il SNC del topo impiega circa 17 giorni per raggiungere la piena chiarezza. Per mPACT, seguire il protocollo per psPACT fino al passaggio della soluzione di compensazione.
Quindi, immergere completamente la soluzione per la pulizia dei tessuti contenente lo 0,5% di alfa-tioglicerolo, un agente anti-imbrunimento, oltre all'8% di SDS in PBS 0,1 molare. Posizionare il campione in un incubatore di agitazione impostato a 37 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando il tessuto non è stato eliminato. In media, il SNC del topo impiega solo due settimane per raggiungere la piena chiarezza utilizzando mPACT.
Nel presente studio, i campioni di cervello di topo trattati tramite il protocollo mPACT hanno raggiunto la trasparenza ottica dopo 14 giorni, prima dei campioni trattati tramite i protocolli PACT e psPACT. I campioni interi del SNC di ratto eliminati con mPACT hanno raggiunto la massima clearance in 20 giorni. Il cervello di ratto adulto da solo, al contrario dell'intero SNC, è stato eliminato con mPACT in soli cinque giorni.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane con il topo con l'intero SNC se viene eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze e dell'anatomia per esplorare le malattie fisiopatologiche, come le lesioni tissutali, le malformazioni dello sviluppo, il cancro e le malattie neurodegenerative nei modelli di SNC dei mammiferi.
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Panoramica
Questo studio presenta due metodologie innovative, psPACT e mPACT, per migliorare la trasparenza ottica e facilitare l'analisi microscopica della vascolarizzazione intatta del sistema nervoso centrale (SNC) di roditore. Le tecniche mirano a chiarificare rapidamente l'intero tessuto del SNC senza danneggiarlo, affrontando questioni fondamentali relative ai modelli di malattie umane come la malattia di Alzheimer e la tumorigenesi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di chiarificazione dei tessuti
- Immagini microscopiche
Sfondo
- Lo studio si basa su metodi precedenti, evidenziando i limiti della chiarificazione tissutale elettroforetica.
- Sottolinea la necessità di processi di chiarificazione rapidi ed efficaci per il tessuto del SNC di roditori.
- Offre soluzioni sia per la ricerca di base che per le implicazioni cliniche in neuroscienze.
Scopo dello studio
- Sviluppare e validare psPACT e mPACT come protocolli efficienti per la chiarificazione dei tessuti del sistema nervoso centrale.
- Ampliare le capacità a disposizione dei ricercatori che studiano condizioni neuropatologiche.
- Facilitare una migliore visualizzazione della vascolarizzazione tissutale nel sistema nervoso centrale.
Metodi Utilizzati
- I metodi prevedono un protocollo multistadio per la preparazione e la chiarificazione di tessuti del sistema nervoso centrale mediante soluzioni PACT.
- I modelli biologici chiave includono campioni di sistema nervoso centrale di topo e ratto, con un focus sul raggiungimento della trasparenza ottica.
- Il metodo psPACT richiede in genere circa 20 giorni per ottenere una chiarezza completa, mentre mPACT può raggiungere questo risultato in circa 14 giorni.
- Vengono impiegate soluzioni specializzate e ambienti di incubazione specifici per i processi di polimerizzazione e chiarificazione.
Risultati principali
- mPACT offre una riduzione significativa del tempo di chiarificazione dei tessuti rispetto ai metodi tradizionali.
- I campioni trattati con mPACT hanno mostrato trasparenza ottica in un periodo di tempo più breve, suggerendo un'efficienza maggiore per le applicazioni di ricerca.
- Le tecniche si rivelano efficaci nel facilitare lo studio di varie condizioni neurologiche.
Conclusioni
- Questo studio consente una chiarificazione rapida ed efficiente del tessuto del sistema nervoso centrale, migliorando le capacità di ricerca nel campo delle neuroscienze.
- Le nuove metodologie rappresentano strumenti preziosi per esplorare i meccanismi delle malattie e i danni tissutali.
- Le implicazioni per la comprensione delle malattie neurodegenerative e per il miglioramento degli studi patologici mediante tecniche di imaging avanzate sono notevoli.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Metodi passivi di chiarificazione innovativi come psPACT e mPACT risolvono un collo di bottiglia critico nella ricerca e sviluppo in neuroscienze, consentendo una trasparenza ottica rapida e ad alta fedeltà di tessuti interi del sistema nervoso centrale senza danni elettroforetici. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei modelli di malattie neurodegenerative, preservando al contempo l'architettura subcellulare e accelerando i tempi di acquisizione delle immagini. Queste tecniche aumentano la fiducia predittiva negli studi preclinici sui modelli di Alzheimer, tumorigenesi e lesioni grazie a una migliore visualizzazione dei fenotipi neuropatologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche in modelli del sistema nervoso centrale integro, preservando le strutture subcellulari e i circuiti cellulari per studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: Riduce gli artefatti di lavorazione dei tessuti associati alla rimozione elettroforetica, migliorando la riproducibilità dei risultati dello screening fenotipico.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli fornendo letture più chiare della progressione neurodegenerativa in sistemi pertinenti alla malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera preparati del SNC standardizzati e trasparenti, adatti all'analisi con imaging ad alta risoluzione di biomarcatori subcellulari e della modulazione di percorsi metabolici.
- Valore operativo: Elimina la necessità di apparecchiature elettroforetiche specializzate, riducendo le barriere all'implementazione del saggio tra diversi gruppi di ricerca.
- Scalabilità: mPACT consente di ottenere la trasparenza del SNC del mouse in circa 14 giorni, permettendo tempistiche prevedibili per le campagne di screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Facilita la transizione senza soluzione di continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, mantenendo l'integrità del tessuto per studi longitudinali sulla tumorigenesi e sulle malformazioni dello sviluppo.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Permette la visualizzazione di strutture subcellulari in tessuti patologici, riducendo l'ambiguità nell'interpretazione del meccanismo del bersaglio.
- Fedeltà del modello di malattia: Consente una chiarificazione CNS coerente tra specie di roditori (topo/ratto), migliorando la comparabilità tra studi in farmacologia della sicurezza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
psPACT e mPACT si inseriscono nel continuum dalla scoperta precoce alla fase preclinica, supportando in particolare la validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, fornendo modelli del SNC quantificabili e pronti per l'imaging.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi mediante la mappatura tridimensionale dell'espressione proteica e della distribuzione cellulare in tessuti integri, chiarificando il coinvolgimento di vie molecolari in modelli di malattia.
- Screening: Fornisce preparazioni tissutali quantitative e riproducibili che supportano la valutazione standardizzata degli effetti di composti sull'architettura del sistema nervoso centrale.
- Analisi: Genera immagini ad alta risoluzione che permettono ai gruppi di lavoro di confrontare i cambiamenti strutturali tra diverse condizioni di trattamento con un rapporto segnale-rumore migliorato.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la continuità proteomica e strutturale dalla fase di scoperta a quella preclinica, favorendo l'allineamento di biomarcatori in modelli di neurodegenerazione e lesione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di chiarificazione del sistema nervoso centrale applicabile a diversi progetti nello studio della neuropatologia, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie alla visualizzazione del tessuto integro.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità evitando parametri elettroforetici variabili e la dipendenza da apparecchiature specifiche.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione accelerando la generazione di dati preclinici per candidati mirati al sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei programmi su neurodegenerazione e oncologia grazie a letture fenotipiche più rapide e chiare.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia dei tessuti, chimica degli idrogeli e gestione di protocolli di incubazione per eseguire la preparazione multistadio del campione.
- Dipende da incubatori orbitali, sistemi a gas azoto e ambienti a temperatura controllata per le fasi di polimerizzazione e chiarificazione dell'idrogel.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione delle soluzioni (ad esempio, concentrazioni di VA-044, SDS) e nei tempi di incubazione, al fine di garantire la riproducibilità tra laboratori.
- L'adattamento a tessuti non-CNS (ad esempio, rene, milza) richiede la validazione dei tempi di chiarificazione e della conservazione della struttura, come indicato nella fonte.
- Limite pratico: il successo del protocollo dipende da un'esecuzione meticolosa a causa delle numerose fasi di preparazione, con il rischio che eventuali deviazioni portino a una chiarificazione incompleta o a danni al tessuto.
