Name: Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Scopri il metodo di microdiluzione del brodo per lo screening di composti antifungini naturali o sintetici. Questa tecnica modificata permette di valutare rapidamente l'attività antimicotica con piccoli volumi e automazione.

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Ringraziamo CAPES-Brasile, CNPq-Brasile, FAP/DF per il sostegno finanziario. Siamo grati al Dr. Hugo Costa Paes di revisione del manoscritto.

1. soluzioni e Media
<ol><li>Preparare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medie, tamponato fosfato salino (PBS), brodo di Sabouraud destrosio e Sabouraud agar destrosio come da tabella 1.</li>
</ol>2. condizioni di crescita fungine inoculo
<ol><li>Memorizzare tutti i ceppi fungini come gli stock congelati in 35% glicerolo a-80 ° C, fino a quando necessario.</li>
	<li>Attenersi alla seguente procedura prima di ogni esperimento.<ol>
<li>Per i ceppi di Candida albicans :<ol>
<li>Scongelare una fiala di magazzino e trasferire 200 µ l a 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in un tubo in polipropilene sterile 50 mL con tappo e coltura durante la notte a 30 ° C con agitazione (200 giri). Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione della cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per i ceppi di Cryptococcus neoformans :<ol>
<li>Raschiare la superficie ghiacciata di un flaconcino stock. Piastra le cellule su piastre di agar Sabouraud destrosio e incubare per 48 h a 30 ° C. Dopo visibile crescita di colonie isolate, tenere le piastre in frigorifero (4 ° C) sigillato con la pellicola di paraffina per fino a 15 giorni.</li>
			<li>Raccogliere una colonia isolata di medie dimensioni dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile o sterile ansa da inoculo e inoculare 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in una provetta conica sterile 50 mL. Incubare per circa 24 h a 30 ° C sotto agitazione (200 giri).</li>
			<li>Non superare le 24 ore di incubazione. Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione. È sempre buona standardizzare la fase di crescita delle cellule prima di ogni prova, poiché questo è un fattore importante che interessa la resistenza antimicrobica. Nota: Entrambi funghi sono stati coltivati a 30 ° C per propagazione rapida nei nostri esperimenti, ma la temperatura può essere modificata per riflettere gli obiettivi dello studio, il trattamento ad esempio clinico (37 ° C). La cosa più importante, questo tempo di incubazione iniziale dovrebbe essere stabilito in anticipo per ogni isolato fungina e mantenuto durante tutti i test per garantire la riproducibilità.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la crescita di funghi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione le provette coniche a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e aggiungere 10 mL di PBS.</li>
	<li>Risospendere le cellule e centrifugare nuovamente a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ripetere il lavaggio con PBS e centrifugazione di altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 5 mL (secondo il formato della pallina) di 2 X RPMI-1640 medi.</li>
	<li>Preparare 1 mL di una diluizione 1: 100 o 1:1,000 in un tubo del microcentrifuge (a seconda la torbidità della sospensione delle cellule).</li>
	<li>Aliquotare 10 µ l di questa diluizione, metterlo in una camera di un emocitometro e contare il numero totale delle cellule nei quadranti quattro angolo sotto il microscopio. Calcolare la concentrazione dalla formula: (totale cella numero/4) x diluizione fattore x 104 (costante di diluizione di camera).<ol>
<li>Considera una redditività del 100% se le condizioni di conteggi e crescita di redditività sono stati sistematicamente correlate per l'isolato oggetto di studio. Nota: La standardizzazione e il controllo di qualità dei conteggi di redditività può essere fatto da retro-placcatura in accordo con il Comitato europeo sul metodo di concentrazione inibitoria minima (MIC) antimicotico test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) per lieviti10 .</li>
		<li>Se la correlazione di crescita/redditività non è stata stabilita per l'isolato sotto studio, misurare la redditività fungina contando le cellule vive in un emocitometro con l'ausilio di coloranti che colorano in modo selettivo le cellule morte, come Floxina B11, trypan blu 12, o Janus Green13. Utilizzare le cellule fungine per questo protocollo solo se la vitalità della popolazione a questo punto è 90% o superiore. Nota: Morti/vivi coloranti potrebbero non funzionare bene con il fungo di scelta. Si prega di testarli prima dell'uso. Ad esempio, il colorante trypan blu non funziona bene con c. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo di che, preparare le sospensioni delle cellule in 2 X RPMI-1640 medi (2 X regolata inoculo nel medium RPMI-1640). Per piastre da 96 pozzetti considera un volume di 5 mL per ogni piatto.<ol>
<li>Per tutti i ceppi di c. albicans , preparare una sospensione di cellule stock di 4 x 103 cellule/mL. Questa concentrazione è di 2 volte della concentrazione finale delle cellule in ogni pozzetto (2 x 103 cellule/mL).</li>
		<li>Per i ceppi di c. neoformans , preparare una cultura stock di cellule 2 x 104 cellule/mL. Questa concentrazione è due volte la concentrazione di cella finale in ogni pozzetto (1 x 104 cellule/mL).</li>
		<li>Per altri funghi, prova con un antimicotico noto che la concentrazione sarà ideale per studio particolare per quanto riguarda il tempo di incubazione. Prendere tempo metabolismo e duplicazione del fungo in considerazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptidi (agente sconosciuto)
<ol><li>Memorizzare i peptidi liofilizzati a-20 ° C e scioglierle in acqua deionizzata prima di ogni esperimento. Il tempo massimo di conservazione una volta dissolto in acqua dipenderà la natura di ciascun peptide.</li>
	<li>Preparare le aliquote di due volte la più alta concentrazione finale nel test (2 X). Idealmente, preparare un piccolo numero di aliquote con abbastanza peptide per utilizzare una sola volta evitare cicli di gelo-disgelo. Nota: La scelta della concentrazione dovrebbe essere basata sulla letteratura e sulle proprietà del peptide. Si consiglia di iniziare le diluizioni seriali con circa 100 µM del peptide e quindi diminuire o aumentare la gamma di concentrazione a seconda dei risultati ottenuti.</li>
</ol>4. riferimento antimicotici (controlli positivi)
<ol><li>Per quelli diluiti in acqua: preparare una soluzione di 2 X di più alta concentrazione di analisi (vedere sezione 5: saggio di antimicotico per i passaggi di diluizione).<ol>
<li>Per i ceppi di c. albicans , preparare una soluzione di 128 µ g/mL di fluconazolo o 128 µ g/mL di caspofungin. La concentrazione di piastra per entrambi sarà 64 µ g/mL.</li>
		<li>Per i ceppi di c. neoformans , preparare una soluzione di 32 µ g/mL di amfotericina B (soluzione solubile in acqua). La concentrazione di piastra sarà 16 µ g/mL. Nota: Normalmente la amfotericina B è diluita in dimetilsolfossido (DMSO), poiché questo Antifungini è scarsamente solubile in acqua. Tuttavia, ci sono preparazioni solubili in acqua amfotericina B disponibile in commercio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per gli antimicotici diluiti in un solvente organico: preparare una soluzione di riserva in DMSO a 100x, quindi diluirlo a 10 volte di acqua per uso. Nota: Così, nel pozzo, la concentrazione finale di DMSO non supererà 1%. Un pozzo dove il fungo crescerà in media che contengono 1% DMSO come controllo è obbligatorio, dato che alcuni funghi non tollerano bene questa concentrazione del solvente. Ricordate che DMSO è fotosensibile, quindi coprire la piastra con un foglio o posizionarlo in una camera oscura per tutta la durata del periodo d'incubazione.</li>
</ol>5. antifungino Assay
Nota: In vitro Antifungini saggi vengono eseguite in base al test di suscettibilità di microdilution brodo da linee guida di Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con alcune modifiche.
<ol><li>Preparare una diluizione seriale di duplice di ciascun peptide e antimicotico in piastre microtiter da 96 pozzetti polistirolo ad un volume finale di 50 µ l di controllo.<ol>
<li>Utilizzando una pipetta aggiungere 100 µ l di antimicotico/peptide nella concentrazione X 2 dei più alti desiderata concentrazione finale nelle colonne 1-3, in fila A.</li>
		<li>Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di acqua sterile negli altri pozzetti, nelle righe B-H.</li>
		<li>Rimuovere 50 µ l di pozzi con la più alta concentrazione (riga A), trasferire a altro bene della concentrazione prossima (riga B) e omogeneizzare.</li>
		<li>Ripetere i passaggi precedenti fino al pozzo con la più bassa concentrazione e scartare 50 µ l di questo pozzo (fila H). Lasciare le colonne 11 e 12 (righe A, B, C) con solo acqua per controllo vuoto o controllo negativo/crescita.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di 2x regolato inoculo nel medium RPMI-1640 ad ogni pozzetto (colonne 1-3 più colonna 11 (controllo negativo/crescita)); la concentrazione finale per c. albicans sarà 2 x 103 cellule/mL e la concentrazione finale di ceppi di c. neoformans sarà 104 cellule/mL.</li>
		<li>Preparare i controlli vuoti (50 µ l acqua + 50 µ l 2 medium RPMI-1640 X senza cellule) controllo negativo/crescita (50 µ l acqua + 50 µ l regolata inoculo 2 X RPMI-1640 medium senza antimicotico) e carico nella piastra ben come descritto sopra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere la procedura per ogni composto da testare e selezionato controllo antimicotico (colonne 4-10). Nota: Le diluizioni seriali possono essere fatto verticalmente come l'esperimento qui sotto, o orizzontalmente nella piastra (cioè, se il numero di diluizioni del composto/estratto dato che deve essere testato è otto o più).<ol>
<li>Se i composti, fare riferimento a farmaci, o ad uno qualsiasi dei suoi componenti sono fotosensibili, eseguire l'analisi in luce ridotta, coprire le piastre con un foglio o posto in una camera oscura durante le incubazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considerare le seguenti raccomandazioni opzionale.<ol>
<li>Sigillare la piastra con un coperchio trasparente che consente lo scambio di gas, come questo aiuta a ridurre l'evaporazione.</li>
		<li>Posizionare la piastra in una camera umida; aiuterà anche a ridurre l'evaporazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore o 48 ore per tutti i ceppi di c. albicans e per 48 h con 200 giri/min agitazione per c. neoformans. Il volume finale inferiore (100 µ l) garantisce che nessuna ricaduta si verifica. Nota: Nessuna differenza significativa è stata osservata fra MIC letture a h 24 e 48 ore per i ceppi di c. albicans . Ciò nonostante, letture a 48 h sono più facili da visualizzare.</li>
	<li>Osservare tutti i pozzetti, con l'aiuto di un microscopio ottico invertito, prima del periodo di incubazione e dopo per verificare i cambiamenti nella morfologia anche per verificare eventuali segni di contaminazione. Nota: Le letture possono essere fare visivamente e fotografate alla fine dell'esperimento. Prima di ogni lettura, omogeneizzare leggermente la piastra. Le letture possono essere eseguite anche misurando la sua OD a 600 nm, se cella ciuffi e filamentazione non vengano rispettate.</li>
	<li>Eseguire gli esperimenti almeno tre volte in date separate.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Test di microdilution può analizzare le potenziali attività antifungina di un target composto utilizzando piccole quantità del composto e allo stesso tempo testarlo in un intervallo di concentrazioni. Di conseguenza, questo protocollo è consigliato come un primo passo nello screening per potenziali nuovi composti antifungini. Il protocollo qui presentato è basato sul protocollo M27-A3, inizialmente progettato per aiutare nella selezione della terapia antifungosa in cliniche e può essere adattato ad una varietà di nuovi c...

Le infezioni fungine sono diventati un'importante preoccupazione medica negli ultimi decenni, avendo aumentato considerevolmente principalmente a causa di un aumento del numero di individui immunocompromessi, come quelli sottoposti a trattamento del cancro e coloro che vivono con l'HIV/AIDS o trapiantati organi1,2. Tuttavia, una gamma molto limitata di farmaci antifungini disponibili e il numero aumentante dei rapporti sulla resistenza fungina a loro contribuiscono ai grandi problemi per quanto riguarda la terapeutica di micosi sistemiche3.
Una potenziale fonte di nuovi composti antifungini sono peptidi antimicrobici (amp), piccoli peptidi cationici prodotte da molti organismi come parte della loro risposta immunitaria innata a infezione4. Tuttavia, il metodo di screening per testare questi composti contro i patogeni fungini non è standardizzato. Le procedure differenti sono state usate per valutare l'attività antifungina di ampere, a volte per il modello stesso microrganismo5,6,7. Queste differenze e la mancanza di dettaglio in alcuni protocolli complicare i confronti tra composti e ostacola riproducibilità.
Un modo per standardizzare la sperimentazione di nuovi farmaci candidati è quello di seguire le linee guida utilizzate per definire antifungosa di predisposizione nelle regolazioni cliniche, quali la clinica e linee guida Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Tuttavia, questi test di sensibilità antifungini sono troppo restrittivi e non prendono in variazione di considerazione nel metabolismo tra le specie, come essi sono stati stabiliti soltanto per alcuni agenti selezionare. Ad esempio, non prendono in considerazione le esigenze metaboliche dei lieviti non fermentanti.
Questo protocollo permette la valutazione dell'attività dei potenziali composti antifungine e viene implementato qui per la ricerca di peptidi antimicotici. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dalle linee guida CLSI M27-A3 con modifiche che ottimizzano lo screening di nuovi composti8,9. Queste modifiche consentono l'uso di piccole quantità di composto, variazioni di temperatura o inoculo iniziale e media diversi per la crescita ottimale di pre-test, standardizzando i risultati con l'uso di antimicotici di riferimento come controlli. Questo metodo, con l'uso di piastre multi-pozzetto cultura, rende possibile rapidamente e in modo affidabile a schermo un gran numero di composti.
Grazie alla sua flessibilità intrinseca, questo protocollo può essere usato con differenti classi chimiche dei composti e contro altri microrganismi, con alcuni adattamenti.

<table><tbody><tr><td><forte>Terreni e reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreno con l-glutammina, senza bicarbonato di sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) acido propano solfonico (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Utilizzare per tamponare 2X RPMI medio</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Din&acirc; mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud brodo di destrosio</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud destrosio agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% per (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> sterile <td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td>Farmaci antifungini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provetta</td> <td>conicaSarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Piatto petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio soluzione sterile</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Utilizzare per pippet le soluzioni utilizzando il multicanale pippet</td></tr><tr><td>Equipment e altri materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Impostato a 37&deg; C</td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>impostato a 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Camera di conteggio delle cellule, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

microdilution del brodo in vitro screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti antifungini

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Le infezioni fungine sono diventati un'importante condizione medica negli ultimi decenni, ma il numero di farmaci antifungini disponibili è limitato. In questo scenario, è necessaria la ricerca di nuovi farmaci antifungini. Il protocollo qui riportato i dettagli di un metodo a peptidi di schermo per le loro proprietà antifungine. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dagli orientamenti Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con modifiche per soddisfare la ricerca di peptidi antimicrobici come potenziale nuovi anti-fungine. Questo protocollo descrive un'analisi funzionale per valutare l'attività dei composti Antifungini e può essere facilmente modificato per soddisfare una particolare classe di molecole in esame. Poiché le analisi vengono eseguite in piastre da 96 pozzetti utilizzando piccoli volumi, uno screening su larga scala può essere completato in un breve lasso di tempo, soprattutto se effettuate in un contesto di automazione. Questa procedura illustra come un protocollo clinico standardizzato e regolabile può aiutare il banco di lavoro perseguimento di nuove molecole per migliorare la terapia di malattie fungine.

Il MIC è definito come la più bassa concentrazione di composta antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo d'incubazione. Poiché l'obiettivo del presente protocollo è quello di avere un metodo veloce per potenziali antimicotici schermo, qualsiasi bene con Chiara media simili ai pozzetti del bianco è considerato un risultato positivo, considerando che qualsiasi bene con torbidità analoga per i pozzetti di controllo negativo/crescita è conside...

Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.

Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare l'attività di potenziali composti antifungini, utilizzando una modifica del test di suscettibilità alla microdiluizione del brodo, utilizzato nei laboratori clinici. Questo metodo viene utilizzato per valutare l'attività fungina di composti naturali o sintetici, uno dei primi test nello sviluppo di terapie antifungine. Forniamo istruzioni per uno screening iniziale di nuovi antimicotici utilizzando piccoli volumi in breve tempo, soprattutto se gli esperimenti vengono eseguiti con l'automazione.A dimostrare la procedura sarà Daniel Zamith-Miranda, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Iniziare questa procedura coltivando i ceppi fungini per il test come descritto nel protocollo di testo. Il giorno seguente, raccogliere le cellule centrifugando le provette coniche a 1200 G, per cinque minuti a temperatura ambiente.Scartare il surnatante, aggiungere dieci millilitri di PBS a ciascuna provetta e risospendere le cellule. Centrifugare nuovamente a 1200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio PBS e la centrifugazione altre due volte.Dopo il terzo lavaggio, risospendere le celle in cinque millilitri di terreno RPMI 1640 a doppia forza. A seconda della torbidità della sospensione cellulare, preparare un millilitro di una diluizione da uno a 100, o da uno a 1000, di ciascun ceppo, in una provetta da microcentrifuga. Aliquat dieci microlitri di questa diluizione, metterla in una camera emocitometrica e contare al microscopio il numero totale di cellule nei quattro quadranti angolari.Dopo aver calcolato la densità di ciascuna sospensione cellulare, preparare le sospensioni semilavorate in terreno RPMI 1640 a doppia resistenza. Preparare 4.000 cellule per millilitro per i ceppi di C.albicans e 20.000 cellule per millilitro per i ceppi di C.neoformans. I peptidi lifolizzati vengono conservati in aliquat per un uso unico a meno 20 gradi Celsius e disciolti in acqua deionizzata solo prima di ogni esperimento.La concentrazione del peptide deve essere il doppio della concentrazione finale più alta testata nel saggio. Vengono preparati anche antimicotici di riferimento. Il test antimicotico viene eseguito in micropiastre di polistirene triplicato e 96 pozzetti.Utilizzando una diluizione seriale doppia di ciascun peptide e un antimicotico di controllo e un volume finale di 50 microlitri per pozzetto. Il passaggio più cruciale del protocollo sono le diluizioni seriali, quindi fai molta attenzione durante i passaggi successivi per evitare qualsiasi errore che comprometterà l'intera analisi. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 microlitri di peptide antimicotico alla concentrazione doppia della concentrazione finale più alta desiderata nelle colonne da uno a tre della riga A.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di acqua sterile agli altri pozzetti nelle file da B a H.Rimuovere 50 microlitri dei pozzetti con la concentrazione più alta.Trasferire nei pozzetti corrispondenti della concentrazione successiva e omogeneizzare pipettando su e giù più volte. Ripetere la diluizione seriale fino a raggiungere i pozzetti con la concentrazione più bassa e scartare 50 microlitri da questi pozzetti. Lasciare le colonne 11 e 12 delle righe A, B e C con solo acqua per i controlli in bianco o per i controlli di crescita negativi.Aggiungere 50 microlitri di inoculo aggiustato a doppia forza in terreno RPMI 1640 a ciascun pozzetto delle colonne da uno a tre, più la colonna 11. La concentrazione finale per C.albicans sarà di 2.000 cellule per millilitro. La concentrazione finale per C. neoformans sarà di 10.000 cellule per millilitro.Preparare controlli di crescita negativi mescolando 50 microlitri di acqua e 50 microlitri di inoculo aggiustato senza l'antimicotico. Preparare i controlli in bianco combinando 50 microlitri di acqua e 50 microlitri di terreno senza celle. Caricare i comandi negli appositi pozzetti.Osservare tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico invertito, quindi incubare le piastre a 37 gradi con agitazione a 200 giri/min. Dopo il periodo di incubazione, osservare nuovamente tutti i pozzetti per verificare i cambiamenti nella morfologia e per verificare la presenza di segni di contaminazione. Acquisisci un'immagine di ogni lastra utilizzando una fotocamera digitale.In questo test rappresentativo, tre peptidi antimicrobici, o AMP, con concentrazioni comprese tra 100 micromolari e punti sette otto micromolari, sono stati valutati per l'attività antifungina contro C. neoformans. Sono stati inclusi un controllo della crescita e un bianco. Qualsiasi pozzetto con mezzi chiari simili ai pozzetti bianchi è considerato un risultato positivo, mentre qualsiasi pozzetto con torbidità analoga ai pozzetti di controllo della crescita negativi è considerato negativo.Poiché la concentrazione inibitoria minima, o MIC, è definita come la più bassa concentrazione di composti antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo di incubazione, 25 micromolari è considerata la MIC per AMP1. E, 12 virgola cinque micromolari, il MIC per AMP2. L'AMP3 dovrà essere rivalutato, poiché il fungo è cresciuto a tutte le concentrazioni testate.Allo stesso modo, tre peptidi distinti testati contro C.albicans, hanno indicato 50 micromolari è il MIC per AMP1. Sei micromolari sono la MIC per AMP2 e 25 micromolari sono le MIC per AMP3. Un esempio di risultato scarso, probabilmente dovuto a un pipettaggio improprio durante la fase di diluizione, è illustrato dalle colonne da cinque a sette della riga C di questa piastra, dove sono presenti differenze nella crescita di C. neoformans tra le repliche.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore, più il tempo di crescita del fungo, se eseguita correttamente. Ricorda di essere consapevole delle caratteristiche fisico-chimiche di queste molecole testate. Utilizzare quindi solventi appropriati come controllo nel caso in cui siano necessari, e utilizzare sempre le cellule nella stessa fase di crescita.Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguiti altri metodi come il test di uccisione temporale, l'uso di coloranti vitali e i test ST60 per rispondere a ulteriori domande, come se il composto ha un effetto fungicida o fungistatico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della micrologia medica per esplorare diverse fonti di composti naturali o sintetici nella ricerca di composti antifungini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare una coltura fungina, preparare le cellule per il test, eseguire le diluizioni seriali e leggere i risultati dopo aver incubato i ceppi fungini con i nostri composti testati.Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni fungini può essere estremamente pericoloso. E durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prepararsi come indossare dispositivi di protezione individuale, lavorare all'interno di un cappuccio di sicurezza biologico e utilizzare pratiche di sicurezza appropriate.

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Un metodo di microdiluizione in brodo per i test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri Gram-positivi

Questo video mostra un test in vitro per lo screening di composti antifungini utilizzando un test di microdiluizione del brodo. I composti in esame vengono diluiti in serie in una piastra per microtitolazione e incubati con un inoculo fungino. Dopo l'incubazione, la piastra viene esaminata alla ricerca di pozzetti senza crescita fungina visibile per valutare il potenziale antimicotico dei composti in esame e la loro concentrazione minima inibitoria (MIC).

Un saggio di microdiluizione in vitro del brodo per lo screening di composti antifungini

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Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione della suscettibilità alla dalbavancina di batteri Gram-positivi clinicamente rilevanti utilizzando una metodologia di riferimento per la microdiluizione del brodo.

Un riferimento brodo di microdiluizione per Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Test della Sensibilità di batteri che crescono aerobico

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

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Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

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