Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare l'attività di potenziali composti antifungini, utilizzando una modifica del test di suscettibilità alla microdiluizione del brodo, utilizzato nei laboratori clinici. Questo metodo viene utilizzato per valutare l'attività fungina di composti naturali o sintetici, uno dei primi test nello sviluppo di terapie antifungine. Forniamo istruzioni per uno screening iniziale di nuovi antimicotici utilizzando piccoli volumi in breve tempo, soprattutto se gli esperimenti vengono eseguiti con l'automazione.

A dimostrare la procedura sarà Daniel Zamith-Miranda, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Iniziare questa procedura coltivando i ceppi fungini per il test come descritto nel protocollo di testo. Il giorno seguente, raccogliere le cellule centrifugando le provette coniche a 1200 G, per cinque minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante, aggiungere dieci millilitri di PBS a ciascuna provetta e risospendere le cellule. Centrifugare nuovamente a 1200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio PBS e la centrifugazione altre due volte.

Dopo il terzo lavaggio, risospendere le celle in cinque millilitri di terreno RPMI 1640 a doppia forza. A seconda della torbidità della sospensione cellulare, preparare un millilitro di una diluizione da uno a 100, o da uno a 1000, di ciascun ceppo, in una provetta da microcentrifuga. Aliquat dieci microlitri di questa diluizione, metterla in una camera emocitometrica e contare al microscopio il numero totale di cellule nei quattro quadranti angolari.

Dopo aver calcolato la densità di ciascuna sospensione cellulare, preparare le sospensioni semilavorate in terreno RPMI 1640 a doppia resistenza. Preparare 4.000 cellule per millilitro per i ceppi di C.albicans e 20.000 cellule per millilitro per i ceppi di C.neoformans. I peptidi lifolizzati vengono conservati in aliquat per un uso unico a meno 20 gradi Celsius e disciolti in acqua deionizzata solo prima di ogni esperimento.

La concentrazione del peptide deve essere il doppio della concentrazione finale più alta testata nel saggio. Vengono preparati anche antimicotici di riferimento. Il test antimicotico viene eseguito in micropiastre di polistirene triplicato e 96 pozzetti.

Utilizzando una diluizione seriale doppia di ciascun peptide e un antimicotico di controllo e un volume finale di 50 microlitri per pozzetto. Il passaggio più cruciale del protocollo sono le diluizioni seriali, quindi fai molta attenzione durante i passaggi successivi per evitare qualsiasi errore che comprometterà l'intera analisi. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 microlitri di peptide antimicotico alla concentrazione doppia della concentrazione finale più alta desiderata nelle colonne da uno a tre della riga A.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di acqua sterile agli altri pozzetti nelle file da B a H.Rimuovere 50 microlitri dei pozzetti con la concentrazione più alta.

Trasferire nei pozzetti corrispondenti della concentrazione successiva e omogeneizzare pipettando su e giù più volte. Ripetere la diluizione seriale fino a raggiungere i pozzetti con la concentrazione più bassa e scartare 50 microlitri da questi pozzetti. Lasciare le colonne 11 e 12 delle righe A, B e C con solo acqua per i controlli in bianco o per i controlli di crescita negativi.

Aggiungere 50 microlitri di inoculo aggiustato a doppia forza in terreno RPMI 1640 a ciascun pozzetto delle colonne da uno a tre, più la colonna 11. La concentrazione finale per C.albicans sarà di 2.000 cellule per millilitro. La concentrazione finale per C. neoformans sarà di 10.000 cellule per millilitro.

Preparare controlli di crescita negativi mescolando 50 microlitri di acqua e 50 microlitri di inoculo aggiustato senza l'antimicotico. Preparare i controlli in bianco combinando 50 microlitri di acqua e 50 microlitri di terreno senza celle. Caricare i comandi negli appositi pozzetti.

Osservare tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico invertito, quindi incubare le piastre a 37 gradi con agitazione a 200 giri/min. Dopo il periodo di incubazione, osservare nuovamente tutti i pozzetti per verificare i cambiamenti nella morfologia e per verificare la presenza di segni di contaminazione. Acquisisci un'immagine di ogni lastra utilizzando una fotocamera digitale.

In questo test rappresentativo, tre peptidi antimicrobici, o AMP, con concentrazioni comprese tra 100 micromolari e punti sette otto micromolari, sono stati valutati per l'attività antifungina contro C. neoformans. Sono stati inclusi un controllo della crescita e un bianco. Qualsiasi pozzetto con mezzi chiari simili ai pozzetti bianchi è considerato un risultato positivo, mentre qualsiasi pozzetto con torbidità analoga ai pozzetti di controllo della crescita negativi è considerato negativo.

Poiché la concentrazione inibitoria minima, o MIC, è definita come la più bassa concentrazione di composti antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo di incubazione, 25 micromolari è considerata la MIC per AMP1. E, 12 virgola cinque micromolari, il MIC per AMP2. L'AMP3 dovrà essere rivalutato, poiché il fungo è cresciuto a tutte le concentrazioni testate.

Allo stesso modo, tre peptidi distinti testati contro C.albicans, hanno indicato 50 micromolari è il MIC per AMP1. Sei micromolari sono la MIC per AMP2 e 25 micromolari sono le MIC per AMP3. Un esempio di risultato scarso, probabilmente dovuto a un pipettaggio improprio durante la fase di diluizione, è illustrato dalle colonne da cinque a sette della riga C di questa piastra, dove sono presenti differenze nella crescita di C. neoformans tra le repliche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore, più il tempo di crescita del fungo, se eseguita correttamente. Ricorda di essere consapevole delle caratteristiche fisico-chimiche di queste molecole testate. Utilizzare quindi solventi appropriati come controllo nel caso in cui siano necessari, e utilizzare sempre le cellule nella stessa fase di crescita.

Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguiti altri metodi come il test di uccisione temporale, l'uso di coloranti vitali e i test ST60 per rispondere a ulteriori domande, come se il composto ha un effetto fungicida o fungistatico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della micrologia medica per esplorare diverse fonti di composti naturali o sintetici nella ricerca di composti antifungini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare una coltura fungina, preparare le cellule per il test, eseguire le diluizioni seriali e leggere i risultati dopo aver incubato i ceppi fungini con i nostri composti testati.

Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni fungini può essere estremamente pericoloso. E durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prepararsi come indossare dispositivi di protezione individuale, lavorare all'interno di un cappuccio di sicurezza biologico e utilizzare pratiche di sicurezza appropriate.