Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare e gestire un dispositivo microfluidico per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X di cristallizzazione di proteine a temperatura ambiente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la cristallizzazione all'interno del chip riduce al minimo il disturbo meccanico dei cristalli proteici. Questi chip trasparenti ai raggi X sono facili da produrre, possono essere montati direttamente sui goniometri della maggior parte delle linee di luce di sincrotrone e fanno un uso efficiente dei cristalli disponibili durante la raccolta dei dati di diffrazione dei raggi X.

Per prima cosa, posiziona uno stampo master del design del chip a raggi X in una capsula di Petri da 10 centimetri rivestita con un foglio di alluminio. Mescolare insieme circa 30 grammi in totale di base PDMS e agente indurente in un rapporto di 10 a uno, e versare il PDMS sul master ad un'altezza di quattro millimetri. Degassare il PDMS in un essiccatore sottovuoto per cinque minuti e soffiare aria per rimuovere le bolle d'aria rimanenti sulla superficie del PDMS.

Polimerizzare il PDMS in forno a 70 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sbucciare delicatamente lo stampo PDMS polimerizzato dal master. Utilizzare un bisturi per tagliare via il PDMS in eccesso.

Prima della fabbricazione di chip a raggi X, assicurarsi che l'area di lavoro sia organizzata in modo da consentire un facile accesso a tutte le attrezzature e i componenti necessari durante la colata in stampo epossidico. Per iniziare la fabbricazione del chip, diluire i precursori di una resina epossidica bicomponente con etanolo fino a una concentrazione di massa finale di etanolo del 40% in peso. Utilizzando un miscelatore a vortice, mescolare insieme la resina epossidica e l'etanolo.

Degasare lo stampo PDMS in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti per garantire che il PDMS possa successivamente assorbire piccole bolle d'aria dalla resina epossidica. Taglia un pezzo di 70 millimetri per 70 millimetri di foglio di poliimmide spesso 7,5 micron e avvolgi la pellicola attorno a un vetrino di 75 millimetri per 50 millimetri. Fissare i bordi della pellicola sul retro del vetrino per formare una superficie di poliimmide piatta e rigida.

Trattare la lamina di poliimmide con retro a vetrino con plasma di ossigeno per 20 secondi. Quindi, incubare la pellicola in una soluzione acquosa all'1% in volume di APTS o GPTS per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Durante la silanizzazione, mescolare accuratamente le soluzioni precursori della resina epossidica con una piccola spatola.

Trasferire lo stampo PDMS degasato dall'essiccatore sottovuoto su una superficie piana. Asciugare la lamina di poliimmide silanizzata con aria pressurizzata o azoto gassoso. Applicare rapidamente una goccia della miscela di resina su ciascuna microstruttura dello stampo.

Posizionare la pellicola di poliimmide con retro scorrevole a faccia in giù sulla resina epossidica e premere con decisione sul vetrino. Coprire il gruppo con un foglio di plastica e una lamiera. Posizionare i pesi sulla lamiera per applicare una pressione fino a 1,4 newton per centimetro quadrato all'assemblaggio.

Dopo 15 minuti, separare delicatamente il vetrino dalla lamina di poliimmide con motivo epossidico e strofinare la lamina di poliimmide fino a quando non si asciuga. Rimetti sopra la pellicola di plastica, la lamiera e i pesi. Lasciare indurire la resina epossidica a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, rimuovere i pesi, la lamiera e la pellicola di plastica. Staccare delicatamente la pellicola di poliimmide modellata dallo stampo PDMS. Il plasma tratta la lamina modellata per 20 secondi e silanizza la lamina modellata con APTS o GPTS, come descritto in precedenza.

Silanizzare un foglio di poliimmide incontaminato con l'altra soluzione silana nelle stesse condizioni. Asciugare entrambe le lamine con aria pressurizzata. Quindi, applicare una goccia di acqua deionizzata su una superficie pulita, asciutta e piana.

Tagliare le singole strutture di chip su un foglio di poliimmide e posizionare il foglio di poliimmide modellato con il lato epossidico rivolto verso l'alto sulla goccia d'acqua e lisciare accuratamente il foglio fino a quando non è completamente piatto. Posizionare la seconda lamina di poliimmide sulla lamina modellata con la silanizzata rivolta verso il basso. Lisciare delicatamente a mano la seconda lamina da un angolo all'altro per espellere le bolle d'aria e legare insieme i fogli di poliimmide.

Per iniziare a fabbricare le porte di accesso, tagliare da una lastra PDMS polimerizzata di quattro millimetri un blocco di dimensioni sufficienti a coprire tutte le porte nel chip a raggi X in poliimmide senza coprire il compartimento di cristallizzazione. Il plasma tratta, silanizza e asciuga il chip di poliimmide e il blocco PDMS. Premere il blocco trattato sul chip sopra le porte.

Copri il chip con un foglio di plastica, un vetrino pulito e una lamina di metallo. Applicare 1,4 newton per centimetro quadrato di pressione per un'ora. Quindi, utilizzare un punzone per biopsia da 0,75 millimetri per perforare i fori di ingresso e uscita dove contrassegnati nel design del chip.

Sigillare la parte posteriore del chip con nastro isolante elettrico in film di poliimmide. Quindi, diluire una soluzione madre al 9% in peso di materiale di rivestimento in fluoropolimero trasparente allo 0,45% in peso con un solvente fluorurato. Collegare un ago calibro 27 da 5/8 di pollice alla siringa.

Montare il tubo in politetrafluoroetilene sull'estremità dell'ago. Caricare la soluzione di fluoropolimero in una siringa Luer lock da un millilitro. Collegare l'altra estremità del tubo all'uscita del chip radiogeno.

Iniettare la soluzione di fluoropolimero nel chip fino a riempire tutti i canali e rimuovere la soluzione di fluoropolimero in eccesso utilizzando una siringa piena d'aria. Posizionare il chip riempito con il lato piatto rivolto verso il basso su una piastra riscaldante a 190 gradi Celsius. Riscaldare il chip per cinque minuti per far evaporare il solvente, rivestendo così i canali con il fluoropolimero.

Prima della procedura di cristallizzazione, filtrare la soluzione proteica scelta con un filtro da 0,2 micron. Centrifugare la soluzione per 15 minuti a 16, 100 volte g e 20 gradi Celsius e recuperare il surnatante per gli esperimenti di cristallizzazione. Per iniziare la procedura di cristallizzazione, combinare volumi uguali di una soluzione proteica e del suo precipitante.

Aspirare circa 20 microlitri di questa miscela in una siringa. Utilizzare un ago calibro 27 da 5/8 di pollice e un tubo in PTFE per collegare la siringa all'ingresso del chip radiogeno. Collegare allo stesso modo una siringa di olio fluorurato all'uscita.

Durante il monitoraggio del chip al microscopio, riempire la soluzione di cristallizzazione attraverso l'ingresso nel chip con il layout parallelo. Iniettare una quantità sufficiente di olio fluorurato per separare gli scomparti di cristallizzazione nel chip. Quindi, bloccare entrambe le porte di ingresso e di uscita con graffette o altri tappi stretti.

Conservare il chip nelle condizioni di cristallizzazione appropriate. La formazione dei cristalli può ora essere osservata al microscopio o mediante misurazioni dinamiche della diffusione della luce. Quando è pronto per la raccolta dei dati, utilizzare del nastro biadesivo per fissare il chip a raggi X a un adattatore stampato in 3D per il goniometro a piastre.

Montare l'adattatore del chip sul goniometro a piastre sulla linea di luce del sincrotrone. Raccogli e analizza i dati di diffrazione. La microscopia a campo chiaro è stata utilizzata per quantificare il tasso di evaporazione dell'acqua dalle camere di cristallizzazione del chip di lamina di poliimmide.

La diffusione dinamica della luce potrebbe rilevare la nucleazione iniziale dei cristalli di taumatina in un chip PDMS su un vetrino con geometria equivalente, consentendo di ottimizzare le condizioni di cristallizzazione. Sono stati raccolti 10 modelli di diffrazione da ciascuno degli 83 cristalli di taumatina cresciuti in un chip di poliimmide con una rotazione di un grado durante ogni fotogramma. Il set di dati è stato suddiviso in cinque sotto-set di dati per fotogramma ed è stato quindi valutato il decadimento dell'intensità del potere di diffrazione normalizzato nel tempo.

Al quarto set di dati, il potere di diffrazione era diminuito al di sotto del 50%I valori del fattore R di misurazione dei sottoset di dati sono aumentati nel tempo, indicando che i cristalli hanno subito danni da radiazioni durante la raccolta dei dati. Ciò è stato attribuito ai radicali liberi generati durante l'esposizione ai raggi X che degradano i cristalli vicini nello stesso compartimento. I cristalli di taumatina bipiramidali avevano un'ampia distribuzione di orientamenti nel chip a raggi X.

Allo stesso modo, i cristalli ortorombici di glucosio isomerasi hanno mostrato un'ampia distribuzione di orientamenti quando sono cresciuti in un chip di poliimmide. Tuttavia, i cristalli di tioredossina avevano prevalentemente orientamenti nei piani xy, xz e yz, potenzialmente a causa della loro forma allungata. In generale, questi chip sono molto robusti e hanno un basso fondo di raggi X.

Ciò rende questo metodo di fabbricazione adatto ad altre tecniche di imaging a raggi X, come la diffusione di raggi X a piccolo angolo. Questa procedura può essere facilmente adattata alle vostre esigenze sperimentali. Ad esempio, il design del chip può essere modificato regolando le dimensioni dei singoli scomparti o il numero totale di scomparti per chip.

Un obiettivo particolare per noi è stato quello di progettare un flusso di lavoro che non richiedesse attrezzature costose, come strumenti specializzati o pompe microfluidiche. Dopo aver visto questo video e letto il manoscritto, dovresti avere una buona comprensione di come cristallizzare in chip, monitorare il processo di cristallizzazione e registrare e analizzare i dati di diffrazione utilizzando l'approccio chip. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente la fabbricazione in batch di chip microfluidici da un master PDMS in circa tre ore senza la necessità di una camera bianca dedicata.