Name: Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Scopri la fabbricazione di dispositivi microfluidici per la cristallografia proteica e la raccolta di dati di diffrazione a raggi X a temperatura ambiente. Questo metodo riduce i disturbi meccanici sui cristalli proteici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di seme PIER PIF-2015-46, BMBF concede a 05K16GUA, 05K12GU3 e il cluster di eccellenza 'Il centro di Amburgo per Imaging ultraveloce – struttura, dinamica e controllo della materia su scala atomica' della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Il lavoro degli autori affiliato con il centro per Free Electron Laser Science è stato finanziato dall'Associazione Helmholtz attraverso fondi del programma orientato. Il sincrotrone MX sono stati raccolti presso beamline P14 operati da EMBL Hamburg presso l'anello PETRA III (DESY, Amburgo, Germania).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Noi fabbricare dispositivi microfluidici per in situ diffrazione dei raggi x di patterning resina epossidica come pellicola di polyimide e materiale come materiale della finestra di riempimento. La nostra procedura ottimizzato vari passaggi del processo di fabbricazione sul precedente raggi x chip disegni16,21. Abbiamo ridotto lo spessore della finestra e quindi lo sfondo dispersione mentre anche fabbricazione di interpolazione come meno passaggi di processo sono necessari. cristallizzazione in situ utilizzando il protocollo descritto ha notevoli benefici. Esso consente la raccolta dei dati di diffrazione a temperatura ambiente ed esclude pertanto la necessità della protezione di cryo, che in alcuni casi contiene il rischio di introdurre artefatti nella struttura della proteina. Inoltre, i cristalli non sono soggette a stress fisico, perché il trasferimento dei cristalli dal loro ambiente nativo può essere evitato. Attraverso questa procedura, i cristalli di mantengono la loro qualità più alta e non soffrono di alcun trattamento.
Nella nostra esperienza, le fasi più critiche all'interno del protocollo ruotano intorno a controllare il processo di cristallizzazione. I parametri per ottenere cristalli adatti ai raggi x con dimensioni appropriate devono essere identificati empiricamente e non possono essere preso direttamente da esperimenti di diffusione del vapore. Utilizzando identiche concentrazioni di proteina e precipitante non ha sempre provocato in cristalli in diversi chip, o a volte in diversi pozzi all'interno del chip stesso. Ciò indica che tutti i fattori che influenzano la crescita e la nucleazione del cristallo dovrebbero essere considerati con attenzione, come la cinetica di composizione o cristallizzazione dei liquori di madre (attraverso la traiettoria di evaporazione). Come più grandi cristalli diffrangono a risoluzione più alta, opportunamente grandi cristalli idealmente sono coltivate. Il processo di nucleazione del cristallo e crescita può essere seguito con misurazioni di liste di distribuzione. Regolare il fuoco del laser all'interno del µm ~ 50 scomparti sottile cristallizzazione del chip possono essere impegnativi e possono richiedere attento allineamento manuale. Utilizzando pozzi più profondi rispetto a 100 µm, auto-allineamento laser era fattibile e affidabile, tale che pozzi multipli possono essere monitorati attraverso sistemi di acquisizione automatica.
I chip di raggi x di polyimide basato producono solo un basso fondo e dimostriamo l'idoneità di questi dispositivi per la raccolta dei dati di diffrazione di raggi x di routine risolvendo strutture per tre proteine modello. La migliore risoluzione ottenuta nel chip ha differito, confrontato con risoluzioni precedentemente raggiunti, dalla raccolta di dati di raggi x convenzionale e significativamente più grandi cristalli della proteina. Questo potrebbe essere dovuto a diversi fattori e ulteriore ottimizzazione di condizione di cristallizzazione può migliorare ulteriormente la diffrazione. È stato possibile raccogliere dati di diffrazione in situ fino a 1,8 risoluzione Å applicando cristallo con dimensioni inferiori a 30 µm. L'analisi dettagliata dei dati di diffrazione taumatina fornito le comprensioni circa danno da radiazione. Per limitare il danno da radiazione di estendere, solo un singolo cristallo deve essere esposto per vano nel dispositivo microfluidico, come la diffusione dei radicali e in cristalli vicini può verificarsi. Per migliorare la velocità di raccolta dei dati, questo deve essere automatizzato in futuro.
A causa della morfologia del cristallo, in alcuni casi può verificarsi un orientamento preferito. Questo era per esempio il caso con il dataset di thioredoxin, dove i cristalli hanno avuto un orientamento decisamente da preferire rispetto le finestre di chip. Anche qui, abbiamo potuto raccogliere un set di dati di diffrazione completa. Se cristalli presentano un orientamento preferito nel chip e in particolare se il corrispondente gruppo di spazio ha anche una simmetria bassa, quindi la completezza del dataset deve essere monitorata durante la raccolta tale da essere sufficiente canna di reticoli di diffrazione raccolti.
Studi di tempo-risolta utilizzando questi chip sono direttamente possibili quando usando la luce indotto reazioni con un approccio di pompa-sonda. La trasmissione della luce pellicola di polyimide per il laser di pompa deve essere chiarita e in alternativa, otticamente chiaro polyimide o COC potrebbero essere utilizzati. Le geometrie di microfluidica corrente non consentono per miscelazione esperimenti dopo i cristalli sono cresciuti del substrato. Tuttavia, ci aspettiamo che il protocollo di fabbricazione dei chip di raggi x descritto anche essere adatto per tali disegni per entrambi diffrazione di raggi x risolta in tempo di miscelazione, nonché approcci19di scattering.

Conoscere la struttura 3D di una proteina è essenziale per capire la sua funzionalità. Strutture di risoluzione vicino-atomica finora sono più comunemente ottenuti dalla cristallografia a raggi x. Questa tecnica espone cristalli della proteina di radiazione a raggi x e i modelli di diffrazione risultanti vengono poi analizzati per raffinatezza e determinazione della struttura. In cristallografia a raggi x tradizionali, un set di dati di diffrazione completa è registrata da un cristallo singolo, idealmente grande, alle temperature criogeniche. Tali cristalli, tuttavia, per lo più non sono banali a crescere, e per identificare condizioni di crioconservazione adatto può diventare impegnativo in sé e a volte anche causare deviazioni dalla struttura della proteina nativa5.
I recenti progressi tecnologici in laser a elettroni liberi a raggi x (FEL) e sincrotrone beamlines hanno permesso di risolvere strutture da cristalli più piccoli, come nuovo beamlines micro-messa a fuoco, brillantezza del fascio di raggi x aumentato e migliorati rivelatori di raggi x è diventato disponibili6,7. In genere, piccoli cristalli sono più facili a crescere più grande e gratuito cristalli8,9il difetto. Tuttavia, piccoli cristalli soffrono di danni di radiazione di raggi x molto più veloci di cristalli di grandi dimensioni. Questo perché rispetto ad un grande cristallo, una dose elevata di raggi x deve essere proiettata in un più piccolo volume di cristallo a diffrangono risoluzione paragonabile. Di conseguenza, anche criogenico protezione spesso non è sufficiente per registrare un set di dati di diffrazione completa da un singolo microcrystal.
Per superare questo ostacolo, cristallografia seriale è diventato il metodo di scelta per raccogliere e unire i pattern di diffrazione da molti microcristalli orientati casualmente per ottenere un set di dati completo. Radiazione sono ridotta a icona di cristallo indotto danni diffondendo la dose totale di raggi x utilizzati per risolvere una struttura proteica sopra un alto numero di cristalli5,10. In un ' diffrangono prima distruggere ' esperimento di FEL, ogni cristallo viene utilizzato solo per un'esposizione usando gli impulsi di raggi x di femto secondi. A sua volta, micro-focus beamlines presso sincrotroni di terza generazione in grado di eseguire seriale cristallografia con qualche millisecondo breve raggi x CVE11,12,13,14. Senza un cristallo oscillazione o rotazione durante la raccolta dati, tuttavia, possono essere registrati solo parziale riflessioni di Bragg e quindi decine di migliaia o più modelli di diffrazione sono in genere necessari per la determinazione di struttura15. Ad oggi, un insieme diversificato di metodi di consegna del campione è stato sviluppato per la cristallografia di seriale, come recentemente rivisto14,16,17,18,19. Tra quelli, diversi bersaglio fisso basato su strategie con successo sono state combinate con rotazione di cristallo durante le esposizioni ai raggi x tale che significativamente meno motivi di diffrazione possono fornire ugualmente completa di set di dati, anche consumando meno di consegna del campione campione rispetto alla classica seriale cristallografia esperimenti cui sono ancora le immagini registrate7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi presentiamo un protocollo per fabbricare dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa dei raggi x. I dispositivi vengono campiti da colla a resina epossidica 5 min mediante litografia soft e sono adatti per gli esperimenti di diffrazione di raggi x in situ a temperatura ambiente che beneficiano di integrare la preparazione dei campioni direttamente in set-up di raggi x, come nel caso di risolta in tempo gli studi che seguono cinetica indotta da miscelazione18,19. Canali microfluidici sono con coperchio su entrambi i lati con un foglio di poliimmide polimerici, conseguente windows di raggi x con uno spessore combinato di circa 16 µm che consentono il basso imaging a raggi x sfondo. Tutti i materiali utilizzati offrono buona resistenza ai solvente. Questo metodo di fabbricazione è relativamente semplice e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico.
In un esempio di applicazione, descriviamo chip per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. In primo luogo, le considerazioni di progettazione e fabbricazione per l'utilizzo di valvole capillare a microfluidically dividere una reazione acquosa in un numero selezionato di nanolitro dimensioni goccioline sono discusse. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione dal canale morto-volume e spaccare facilmente può essere eseguita manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Tale isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica sono monitorati in situ mediante diffusione dinamica della luce (DLS) di controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Precedentemente è stato dimostrato che misure di liste di distribuzione possono essere eseguite in dispositivi microfluidici che consiste di una struttura di polidimetilsilossano (PDMS) legata a un vetro diapositiva25,26. Perché lo strato di polyimide ha un alta trasmissione per lunghezze d'onda più di 550 nm, l'approccio può essere esteso alle misurazioni in fiches trasparente ai raggi x, quando si utilizza un laser appropriato lunghezza d'onda27,28. Base ai risultati DLS, nucleazione iniziale può essere osservato, e ulteriore evaporazione goccia può essere fermato per ottenere cristalli della proteina di meno ma più grandi.
Dopo sufficiente cristalli vengono coltivati, set di dati completo diffrazione di raggi x può essere raccolto quindi utilizzando goniometro basato in situ fissata destinazione seriale cristallografia a raggi x a temperatura ambiente. I set di dati di diffrazione sono trattati con una suite di strumenti software e script personalizzati per risolvere la struttura di cristallo della proteina. Questa tecnica evita manufatti spesso indotti durante la crio-conservazione usati negli esperimenti di cristallografia convenzionale.
Mettiamo a confronto tre strutture di destinazione di proteine che sono stati risolti utilizzando circa 10-20 µm piccoli cristalli cresciuti nel chip migliore poi 2 risoluzione Å. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Questo protocollo può essere applicato per cristalli proteici che diffrangono ad alta risoluzione, nonché a bassa risoluzione (1.7 Å a 3.0 Å). Come quasi ogni cristallo può essere usato per la diffrazione, piccolo campione è sprecato, rendendo questo un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata su come preparare chip microfluidici trasparente ai raggi x in situ proteina cristallizzazione e diffrazione di raccolta dei dati. La procedura è stato attentamente progettata di beneficiare di microfluidica precisione senza richiedere sofisticate apparecchiature in laboratorio. Inoltre, raccolta di dati presso la beamline di sincrotrone può essere eseguita senza la necessità di un goniometro specializzato o un umidificatore per facilitare che riproducono i risultati da non esperti. La tecnica presentata può essere applicata per millisecondo seriale cristallografia raccolta di dati a temperatura ambiente mantenendo il danno da radiazione minima e senza introdurre lo stress ai cristalli dopo crescita gestendo cryo-protezione o cristallo. Quindi, il metodo descritto è adatto per qualsiasi progetto di cristallizzazione di proteine.

<table><tbody><tr><td>SU-8 Serie 3000</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Alcool</td><td></td><td></td> isopropilico <td>Solvente</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Colla epossidica</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Colla epossidica</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Foglio di silicone</td></tr><tr><td>Kapton</td><td>Dupont / Grado americano Durafilm</td><td>HN, calibro 30 (7,5 &mu; m)</td><td>foglio di poliimmide</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop rivestimento in fluoropolimero</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvente</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Olio fluorurato</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>Software CAD AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0,75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Maschera fotografica</td><td>JD Dati</td><td></td><td></td>fotografici</tr><tr><td>Wafer da 3 pollici</td><td>Wafer universitario Wafer</td><td></td> in <td>silicone</td></tr><tr><td>Allineatore per maschera</td><td>S&Uuml; SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Maschera allineatore</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Macchina al plasma</td><td>Diener elettronico</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Taumatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Proteina</td></tr><tr><td>Glucosio Isomerasi</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Proteina</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chimica</td></tr><tr><td>Tartrato di sodio</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td></td></tr><tr><td>Chimico Cloruro di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Chimico Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>Chimico SPG tampone</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrofotometro</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Stampante 3D</td><td>Ultimaker Form2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stampante 3D</td><td>Formlabs</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Amicon</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &micro; m filtro</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>Tubo in PTFE 0,3 mm Diametro interno x 0,76 mm Diametro esterno</td></tr><tr><td>Siringhe&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Ago con punta Luer-Lock</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Terumo Agani Ago</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

chip microfluidici per dispersione della luce dinamica in situ diffrazione di raggi x di cristallo ed in situ per la cristallografia seriale

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Questo protocollo descrive la fabbricazione di dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa di raggi x ottimizzato per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. I dispositivi vengono campiti da colla epossidica mediante litografia soft e sono adatti per in situ esperimenti di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. I pozzetti sono con coperchio su entrambi i lati con finestre di lamina polimerica polyimide che consentono la raccolta di dati di diffrazione con bassa priorità bassa dei raggi x. Questo metodo di fabbricazione è poco impegnativo e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico. Il protocollo di progettazione e fabbricazione di chip utilizzano valvole capillare per dividere una reazione acquosa in goccioline nanolitro definite dimensioni microfluidically. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguito manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Descriviamo come isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica può essere monitorati in situ di luce dinamica scattering controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Dopo cristalli adatti sono sviluppati, diffrazione di raggi x completo set di dati possono essere raccolti tramite goniometro basato in situ fissata destinazione cristallografia a raggi x seriale a temperatura ambiente. Il protocollo fornisce script personalizzati per elaborare diffrazione DataSet utilizzando una suite di strumenti software per risolvere e perfezionare la struttura di cristallo della proteina. Questo approccio evita i manufatti possibilmente indotti durante la crioconservazione o cristallo manuale gestione in esperimenti di cristallografia convenzionale. Presentiamo e confrontare tre strutture di proteine che sono stati risolti utilizzando piccoli cristalli con dimensioni di circa 10-20 µm cresciuti nel chip. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Il protocollo dettaglia come fabbricare un chip microfluidico trasparente raggi x custom adatto per in situ seriale cristallografia. Come quasi ogni cristallo può essere utilizzato per la raccolta di dati di diffrazione, questi chip microfluidici sono un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare e gestire un dispositivo microfluidico per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X di cristallizzazione di proteine a temperatura ambiente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la cristallizzazione all'interno del chip riduce al minimo il disturbo meccanico dei cristalli proteici. Questi chip trasparenti ai raggi X sono facili da produrre, possono essere montati direttamente sui goniometri della maggior parte delle linee di luce di sincrotrone e fanno un uso efficiente dei cristalli disponibili durante la raccolta dei dati di diffrazione dei raggi X.Per prima cosa, posiziona uno stampo master del design del chip a raggi X in una capsula di Petri da 10 centimetri rivestita con un foglio di alluminio. Mescolare insieme circa 30 grammi in totale di base PDMS e agente indurente in un rapporto di 10 a uno, e versare il PDMS sul master ad un'altezza di quattro millimetri. Degassare il PDMS in un essiccatore sottovuoto per cinque minuti e soffiare aria per rimuovere le bolle d'aria rimanenti sulla superficie del PDMS.Polimerizzare il PDMS in forno a 70 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sbucciare delicatamente lo stampo PDMS polimerizzato dal master. Utilizzare un bisturi per tagliare via il PDMS in eccesso.Prima della fabbricazione di chip a raggi X, assicurarsi che l'area di lavoro sia organizzata in modo da consentire un facile accesso a tutte le attrezzature e i componenti necessari durante la colata in stampo epossidico. Per iniziare la fabbricazione del chip, diluire i precursori di una resina epossidica bicomponente con etanolo fino a una concentrazione di massa finale di etanolo del 40% in peso. Utilizzando un miscelatore a vortice, mescolare insieme la resina epossidica e l'etanolo.Degasare lo stampo PDMS in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti per garantire che il PDMS possa successivamente assorbire piccole bolle d'aria dalla resina epossidica. Taglia un pezzo di 70 millimetri per 70 millimetri di foglio di poliimmide spesso 7,5 micron e avvolgi la pellicola attorno a un vetrino di 75 millimetri per 50 millimetri. Fissare i bordi della pellicola sul retro del vetrino per formare una superficie di poliimmide piatta e rigida.Trattare la lamina di poliimmide con retro a vetrino con plasma di ossigeno per 20 secondi. Quindi, incubare la pellicola in una soluzione acquosa all'1% in volume di APTS o GPTS per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Durante la silanizzazione, mescolare accuratamente le soluzioni precursori della resina epossidica con una piccola spatola.Trasferire lo stampo PDMS degasato dall'essiccatore sottovuoto su una superficie piana. Asciugare la lamina di poliimmide silanizzata con aria pressurizzata o azoto gassoso. Applicare rapidamente una goccia della miscela di resina su ciascuna microstruttura dello stampo.Posizionare la pellicola di poliimmide con retro scorrevole a faccia in giù sulla resina epossidica e premere con decisione sul vetrino. Coprire il gruppo con un foglio di plastica e una lamiera. Posizionare i pesi sulla lamiera per applicare una pressione fino a 1,4 newton per centimetro quadrato all'assemblaggio.Dopo 15 minuti, separare delicatamente il vetrino dalla lamina di poliimmide con motivo epossidico e strofinare la lamina di poliimmide fino a quando non si asciuga. Rimetti sopra la pellicola di plastica, la lamiera e i pesi. Lasciare indurire la resina epossidica a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, rimuovere i pesi, la lamiera e la pellicola di plastica. Staccare delicatamente la pellicola di poliimmide modellata dallo stampo PDMS. Il plasma tratta la lamina modellata per 20 secondi e silanizza la lamina modellata con APTS o GPTS, come descritto in precedenza.Silanizzare un foglio di poliimmide incontaminato con l'altra soluzione silana nelle stesse condizioni. Asciugare entrambe le lamine con aria pressurizzata. Quindi, applicare una goccia di acqua deionizzata su una superficie pulita, asciutta e piana.Tagliare le singole strutture di chip su un foglio di poliimmide e posizionare il foglio di poliimmide modellato con il lato epossidico rivolto verso l'alto sulla goccia d'acqua e lisciare accuratamente il foglio fino a quando non è completamente piatto. Posizionare la seconda lamina di poliimmide sulla lamina modellata con la silanizzata rivolta verso il basso. Lisciare delicatamente a mano la seconda lamina da un angolo all'altro per espellere le bolle d'aria e legare insieme i fogli di poliimmide.Per iniziare a fabbricare le porte di accesso, tagliare da una lastra PDMS polimerizzata di quattro millimetri un blocco di dimensioni sufficienti a coprire tutte le porte nel chip a raggi X in poliimmide senza coprire il compartimento di cristallizzazione. Il plasma tratta, silanizza e asciuga il chip di poliimmide e il blocco PDMS. Premere il blocco trattato sul chip sopra le porte.Copri il chip con un foglio di plastica, un vetrino pulito e una lamina di metallo. Applicare 1,4 newton per centimetro quadrato di pressione per un'ora. Quindi, utilizzare un punzone per biopsia da 0,75 millimetri per perforare i fori di ingresso e uscita dove contrassegnati nel design del chip.Sigillare la parte posteriore del chip con nastro isolante elettrico in film di poliimmide. Quindi, diluire una soluzione madre al 9% in peso di materiale di rivestimento in fluoropolimero trasparente allo 0,45% in peso con un solvente fluorurato. Collegare un ago calibro 27 da 5/8 di pollice alla siringa.Montare il tubo in politetrafluoroetilene sull'estremità dell'ago. Caricare la soluzione di fluoropolimero in una siringa Luer lock da un millilitro. Collegare l'altra estremità del tubo all'uscita del chip radiogeno.Iniettare la soluzione di fluoropolimero nel chip fino a riempire tutti i canali e rimuovere la soluzione di fluoropolimero in eccesso utilizzando una siringa piena d'aria. Posizionare il chip riempito con il lato piatto rivolto verso il basso su una piastra riscaldante a 190 gradi Celsius. Riscaldare il chip per cinque minuti per far evaporare il solvente, rivestendo così i canali con il fluoropolimero.Prima della procedura di cristallizzazione, filtrare la soluzione proteica scelta con un filtro da 0,2 micron. Centrifugare la soluzione per 15 minuti a 16, 100 volte g e 20 gradi Celsius e recuperare il surnatante per gli esperimenti di cristallizzazione. Per iniziare la procedura di cristallizzazione, combinare volumi uguali di una soluzione proteica e del suo precipitante.Aspirare circa 20 microlitri di questa miscela in una siringa. Utilizzare un ago calibro 27 da 5/8 di pollice e un tubo in PTFE per collegare la siringa all'ingresso del chip radiogeno. Collegare allo stesso modo una siringa di olio fluorurato all'uscita.Durante il monitoraggio del chip al microscopio, riempire la soluzione di cristallizzazione attraverso l'ingresso nel chip con il layout parallelo. Iniettare una quantità sufficiente di olio fluorurato per separare gli scomparti di cristallizzazione nel chip. Quindi, bloccare entrambe le porte di ingresso e di uscita con graffette o altri tappi stretti.Conservare il chip nelle condizioni di cristallizzazione appropriate. La formazione dei cristalli può ora essere osservata al microscopio o mediante misurazioni dinamiche della diffusione della luce. Quando è pronto per la raccolta dei dati, utilizzare del nastro biadesivo per fissare il chip a raggi X a un adattatore stampato in 3D per il goniometro a piastre.Montare l'adattatore del chip sul goniometro a piastre sulla linea di luce del sincrotrone. Raccogli e analizza i dati di diffrazione. La microscopia a campo chiaro è stata utilizzata per quantificare il tasso di evaporazione dell'acqua dalle camere di cristallizzazione del chip di lamina di poliimmide.La diffusione dinamica della luce potrebbe rilevare la nucleazione iniziale dei cristalli di taumatina in un chip PDMS su un vetrino con geometria equivalente, consentendo di ottimizzare le condizioni di cristallizzazione. Sono stati raccolti 10 modelli di diffrazione da ciascuno degli 83 cristalli di taumatina cresciuti in un chip di poliimmide con una rotazione di un grado durante ogni fotogramma. Il set di dati è stato suddiviso in cinque sotto-set di dati per fotogramma ed è stato quindi valutato il decadimento dell'intensità del potere di diffrazione normalizzato nel tempo.Al quarto set di dati, il potere di diffrazione era diminuito al di sotto del 50%I valori del fattore R di misurazione dei sottoset di dati sono aumentati nel tempo, indicando che i cristalli hanno subito danni da radiazioni durante la raccolta dei dati. Ciò è stato attribuito ai radicali liberi generati durante l'esposizione ai raggi X che degradano i cristalli vicini nello stesso compartimento. I cristalli di taumatina bipiramidali avevano un'ampia distribuzione di orientamenti nel chip a raggi X.Allo stesso modo, i cristalli ortorombici di glucosio isomerasi hanno mostrato un'ampia distribuzione di orientamenti quando sono cresciuti in un chip di poliimmide. Tuttavia, i cristalli di tioredossina avevano prevalentemente orientamenti nei piani xy, xz e yz, potenzialmente a causa della loro forma allungata. In generale, questi chip sono molto robusti e hanno un basso fondo di raggi X.Ciò rende questo metodo di fabbricazione adatto ad altre tecniche di imaging a raggi X, come la diffusione di raggi X a piccolo angolo. Questa procedura può essere facilmente adattata alle vostre esigenze sperimentali. Ad esempio, il design del chip può essere modificato regolando le dimensioni dei singoli scomparti o il numero totale di scomparti per chip.Un obiettivo particolare per noi è stato quello di progettare un flusso di lavoro che non richiedesse attrezzature costose, come strumenti specializzati o pompe microfluidiche. Dopo aver visto questo video e letto il manoscritto, dovresti avere una buona comprensione di come cristallizzare in chip, monitorare il processo di cristallizzazione e registrare e analizzare i dati di diffrazione utilizzando l'approccio chip. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente la fabbricazione in batch di chip microfluidici da un master PDMS in circa tre ore senza la necessità di una camera bianca dedicata.

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Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale (Video) | JoVE Journal

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

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