Name: Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Scopri il metodo HyCCAPP per identificare proteine che interagiscono con il DNA in loci specifici utilizzando cellule di mammifero. Questa tecnica non richiede manipolazione genetica né anticorpi per l'analisi proteomica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni P50HG004952 e R01GM109099 a MO.

1. catturare Oligonucleotide Design
<ol><li>
Progettare un riquadro di oligonucleotidi da usarsi durante la cattura di ibridazione della destinazione regione/s.
	<ol>
<li>Lo scopo di progettare oligonucleotidi di 4 – 8 per regione di destinazione, ma come minimo, progettare almeno un oligonucleotide targeting per ciascuna estremità della regione di destinazione.</li>
		<li>Se la sequenza di destinazione è lunga (> 500 paia di basi), progettare gli oligonucleotidi come diffusione fuori come possibile per assicurare l'effettivo arricchimento della cromatina in tutta la regione intera destinazione. Nota: Abbiamo osservato cattura ottimale con oligonucleotidi di 4 – 8. Anche se questo processo può funzionare bene con oligonucleotidi più, non è raro osservare una diminuzione delle rese di arricchimento quando troppi oligonucleotidi sono utilizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Progettare oligonucleotidi con temperature di fusione simile e assicurarsi che essi non formare forcine forte né hanno interazioni forti (tenendo conto che ibridazioni si procederà a 42 ᵒC). Nota: Se un'eluizione di punto d'appoggio è scelto (4.12.3), una sequenza base 8 esterna aggiuntiva deve essere aggiunto il oligonucleotide e richiederà oligonucleotidi complementari 'release' al momento dell' eluizione17. Diversi strumenti software commerciale possono essere utilizzati per selezionare e analizzare gli oligonucleotidi. 25 mers hanno dimostrato buoni risultati, ma a seconda della dimensione del genoma e la sequenza, cattura oligonucleotidi possono contenere da qualche parte tra 20 – 80 basi. In genere, oligonucleotidi di cattura hanno una temperatura di fusione vicino ᵒC 62, ma che può cambiare a seconda della loro lunghezza. Temperature di fusione coerente e/o lunghezza del oligonucleotide in tutto il mix di cattura può contribuire ad evitare distorsioni indesiderate in arricchimento.</li>
	<li>Progettare i oligonucleotides di cattura con una molecola di biotina (preferibilmente separato da un distanziatore dalla sequenza di acquisizione) all'estremità 3'.</li>
</ol>2. coltura cellulare
<ol><li>
Crescere le cellule linfoblastoidi umane (ad esempio GM12878 illustrato di seguito) o altre linee cellulari in RPMI 1640 media completati con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e 5% siero bovino fetale (FBS), a 37 ᵒC e 5% CO2.
	<ol>
<li>Iniziale di seme congelato aliquote (2 – 5 x 105 cellule) in un pallone di T-25 con 6 mL di RPMI 1640 media preparato al punto 2.1.</li>
		<li>Monitorare la densità delle cellule e la vitalità.<ol>
<li>Prendere un rappresentante aliquota delle cellule e li colorano con un colorante appropriato come trypan blu.</li>
			<li>Misurare la densità delle cellule usando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prima che la cella raggiunge densità di 1 x 106 cellule/mL, rallentare le cellule a 100 x g per 5 min e trasferire le cellule in un pallone di T-75 con 25 mL di RPMI 1640 media preparato al punto 2.1. Crescere le cellule fino a quando la densità delle cellule si avvicina a 1 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Trasferire le cellule in un pallone di T-150 in 38 mL di terreno RPMI 1640 (2.1) e far crescere le cellule per altri due giorni. Nota: Le cellule linfoblastoidi crescono in sospensione. Linee guida generali per la coltivazione di cellule linfoblastoidi consigliano di densità delle cellule per essere compresa tra 0,2 – 1 x 106 cellule/mL. A causa della grande quantità di materiale necessaria in questa tecnologia, il presente protocollo è volutamente scritto a crescere le cellule ad una densità di cellule di là di ciò che è comunemente usato. Protocolli di crescita delle cellule possono essere rivisto e adattati dal lettore a seconda dei tipi di cella da utilizzare.</li>
		<li>Rallentare le cellule a 100 x g per 5 min, risospendere le cellule in 10 mL di terreno RPMI 1640 (2.1) e versare la sospensione in un flacone di rullo2 850 cm contenente 500 mL di media. Incubare le cellule stesse condizioni come prima, ma a questo punto iniziare a utilizzare la costante rotazione (giri/min. ~0.5).</li>
		<li>Monitorare la crescita delle cellule e cambiare il supporto quando necessario (in genere ogni 3 – 4 giorni). Lasciate che le cellule crescono ad una densità più vicino possibile a 2 x 106 cellule/mL (1 x 109 celle in totale).</li>
		<li>Una volta raggiunto il numero di celle desiderato, raccogliere le cellule facendo girare le cellule giù a 100 x g per 5 min e risospendere le cellule in 36 mL di RPMI 1640 media (2.1). Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL. Prendere piccole aliquote per conta cellulare e di estrazione del DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crosslink aggiungendo 1 mL di formaldeide al 37% per raggiungere una concentrazione finale dell'1%. Attenzione: La formaldeide è una sostanza cancerogena e deve essere gestita in una cappa aspirante.<ol>
<li>Incubare le cellule con rotazione (~ 30 – 60 giri/min) per 10 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Placare la reazione di reticolazione con l'aggiunta di 2 mL di una soluzione di glicina di 2,5 M, per una concentrazione finale di 125 mM.</li>
		<li>Incubare le cellule con rotazione (~ 30 – 60 giri/min) per 5 min a RT. agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 100 x g per 5 min e lavare le cellule due volte con PBS 1X freddo di ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuare a passo successivo o risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi delle cellule (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inibitori della proteasi (PI)) e snap-congelare la sospensione goccia a goccia in azoto liquido. Conservare i campioni a-80 ᵒC. Nota: Preparare > 25 mL di tampone di lisi delle cellule senza Igepal e PI e aggiungere quelli freschi di reagenti quando pronto all'uso. Evitare la conservazione a lungo termine di tampone di lisi delle cellule una volta Igepal e PI sono stati aggiunti. Conservare il tampone di lisi delle cellule a 4 ᵒC per fino a 3 mesi. Igepal è un detergente non ionico, non-denaturante. NP-40 può essere potenzialmente utilizzato come alternativa alla Igepal ma non abbiamo usato esso in questo contesto come NP-40 non è consigliato quando i campioni sono analizzati alla fine mediante spettrometria di massa per la caratterizzazione di proteine che legano il DNA.</li>
</ol>3. Lisi e tosatura
<ol><li>Preparare > 15 mL di tampone di lisi di Nuclei (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1% SDS, PI). Nota: Aggiungere PI fresco, solo per gli importi da utilizzare. Evitare la conservazione a lungo termine di tampone di lisi di Nuclei una volta PI è stato aggiunto. Buffer di lisi di nuclei possono essere conservati a RT per fino a 1 mese.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 20 mL di tampone di lisi delle cellule (contenente Igepal e PI). Lasciate che i pellet scongelare il ghiaccio e mescolano bene una volta scongelati. Lasciate i campioni riposare per altri 10 min sul ghiaccio. Centrifugare le cellule a 400 x g a 4 ᵒC per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 6 mL di tampone di lisi di Nuclei con PI (volume può essere aumentato se le cellule non formano una sospensione).</li>
	<li>
In preparazione per sonicazione, dividere il campione in modo uniforme in ~ 6 – 8 tubi del microfuge (600-1.000 µ l per ogni tubo).
	<ol>
<li>Posizionare i campioni su ghiaccio o un rack freddo e Sonicare l'esempio utilizzando un sonicatore con un microtip. Utilizzare 65% ampiezza con 5x20 raffica costante di s, permettendo la sospensione raffreddare per almeno 40 s tra gli impulsi. Nota: Se aumentano volumi > 10 mL per campione, un cella frigorifera di vetro può essere utilizzato invece. Scoppia più e più a lungo sarebbe necessaria quindi. Sonicatori differiscono notevolmente. Condizioni potrebbero essere necessario essere ottimizzato dal reader. Altre alternative di sonicazione possono essere usati pure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 12.000 x g per 10 min a 4 ᵒC, trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare i pellet.</li>
	<li>Stima totale recupero utilizzando un metodo fluorimetrico.</li>
	<li>Continuare al passo successivo o snap-congelare e conservare il campione a-80 ᵒC.</li>
	<li>Opzionale: Prendere un'aliquota, invertire le reticolazioni incubando una notte al ᵒC 67 a 0,3 M NaCl. Pulire il DNA ed eseguirlo in Bioanalyzer per determinare la lunghezza di frammento. La maggior parte dei frammenti deve essere compreso tra 500 e 1.000 bp. Nota: È OK per interrompere a questo punto e conservare i campioni a-80 ᵒC.</li>
</ol>4. ibridazione cattura
<ol><li>Preparare 500 mL di tampone di ibridazione (ibridazione): 2x (200mm MES, 2 M di NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) e 500 mL di tampone di lavaggio (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8). Conservare il Hyb e Wash buffer a 4 ᵒC e temperatura ambiente, rispettivamente, fino a 3 mesi. Metà del buffer x Hyb 2 utilizzare per preparare un 1x tampone di ibridazione. Anche conservarlo a 4 ᵒC per fino a 3 mesi. Nota: Il volume totale della cattura l'ibridazione sarà due volte il volume del campione risultante nel passaggio precedente (come descritto finora, il volume del campione sarebbe circa 6 mL e quindi il volume totale ibridazione sarebbe 12ml).</li>
	<li>Mettere da parte perline pari al 5% del volume totale ibridazione cattura (600 µ l in questo caso). Un magnete adatto e appropriato è necessario per lavorare con le perline nei passaggi seguenti.</li>
	<li>Lavare le perle tre volte con tampone di ibridazione utilizzando due volte il volume di perline (1200 µ l) 1x. Risospendere le sfere in 1.200 µ l di Buffer IBRID: 2x. Posizionare i tubi sul magnete fino a quando la soluzione Cancella e rimuovere il buffer.</li>
	<li>Eseguire reazioni pre-schiarimento in provette da 1,5 mL microfuge con un massimo di 700 µ l di campione per tubo. Aggiungere abbastanza perline (5%) e 2 x Hyb Buffer per diluire il tampone di ibridazione a 1 x (10 tubi con 600 µ l di campione, 120 µ l di perline lavati risospesi in 2x Hyb Buffer e 480 µ l di Buffer IBRID: 2x). Li Incubare per 10 min a 31 ᵒC con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min).</li>
	<li>Posizionare i tubi su un magnete fino a perline sono immobilizzati e trasferire i campioni in nuove provette. Scartare le perline. Nota: Da questo punto in avanti, basso-associazione tubi sono raccomandati.</li>
	<li>Risospendere i oligonucleotides di acquisizione a una soluzione di lavoro di 10 pmol / µ l e aggiungere 4 µ l di questa soluzione in ogni provetta. Nota: Diverse regioni possono fungere da controllo per a vicenda, ma si consiglia di includere un oligonucleotide di cattura con la sua sequenza uova strapazzata per servire come un vero controllo negativo.</li>
	<li>Incubare le provette per 40 min a 42 ᵒC con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min).</li>
	<li>Durante l'incubazione, mettere da parte le perle necessarie (0,3 µ l/pmol dell'oligonucleotide di cattura). Lavare le perle tre volte come descritto al punto 4.3, ma risospendere le cellule in 1x tampone di ibridazione.</li>
	<li>Aggiungere le perline lavate al campione e incubare i campioni per 30 min a RT con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min). Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il supernatante, una volta che le perle sono state immobilizzate.</li>
	<li>
Le sfere di lavaggio
	<ol>
<li>Aggiungere 1,2 mL di tampone di lavaggio e incubare il campione per 5 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) a tubi RT. posto sul magnete e attendere un paio di minuti fino alle soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere 1,2 mL di tampone di lavaggio e incubare per 1 h con fine sopra rotazione fine (~ 30-60 giri/min) a RT. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio riducendo il tempo di incubazione a 30 min la seconda volta.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio e incubare per 15 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) al 31 ᵒC. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di PBS e incubare per 5 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) a RT. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eluizione semplice
	<ol>
<li>Aggiungere 40 µ l di acqua di grado molecolare ai talloni e incubare 94 ᵒC per 5 min.</li>
		<li>Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Scartare le perline.</li>
		<li>Procedere con l'analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC. Nota: Questo tipo di eluizione funziona bene per un'analisi successiva di qPCR e alcune misurazioni di proteomica, ma in altri casi due approcci alternativi descritti di seguito resa "pulitore" eluati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eluizione dnasi.
	<ol>
<li>Aggiungere 40 µ l di tampone di dnasi 1x e 2 U di dnasi in ogni provetta.</li>
		<li>Incubare le provette per 15 min a 37 ᵒC.</li>
		<li>Posizionare i tubi su un magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.</li>
		<li>Rimuovere i campioni eluiti dalle perline e i campioni in un nuovo tubo di basso-associazione.</li>
		<li>Incubare la provetta al 94 ᵒC per 7 min inattivare l'enzima e procedere alla analisi proteomica. Nota: Le concentrazioni più basse di dnasi possono essere utilizzate se è osservata con analisi proteomica. Non sarà possibile calcolare l'acquisizione arricchimenti di qPCR se questo metodo di eluizione viene utilizzato dal momento che il trattamento della dnasi distrugge completamente il materiale di DNA nel campione.</li>
		<li>Procedere alla analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Punto d'appoggio eluizione17. Nota: Questo metodo non è consigliato per oligonucleotidi più a lungo (> 40 basi). Questo metodo richiede per gli oligonucleotidi di cattura contenere un 8 basi aggiuntive che non si sovrappongono con la sequenza genomic e oligonucleotidi complementari rilascio al fine di spostare il bersaglio dai oligonucleotides di cattura.<ol>
<li>Diluire 2 nanomoles di oligonucleotidi di rilascio in 40 µ l di tampone SSC.</li>
		<li>Incubare per 20 minuti a TA.</li>
		<li>Posizionare i tubi su un magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione dalle perle.</li>
		<li>Procedere alla analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. valutazione di catturare resa di qPCR con Primers per la regione di interesse di Target Capture
<ol><li>Utilizzare un apposito software o strumento online per progettare primer e sonde per la regione di destinazione. Nota: In questo esperimento, regione del promotore del DUSP3 e DUSP5 sono stati destinati. I primer e sonde utilizzate sono le seguenti. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, sonda marcata con FAM - TCC ATG che CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda marcata con FAM TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.</li>
	<li>Prendere un'aliquota dell'eluato (non più di 10 µ l) e diluire 01:10 con grado molecolare H2O.</li>
	<li>Estrarre il DNA di uno delle aliquote nel passaggio 2.1.7 e utilizzare quel campione di DNA per fare una curva standard facendo cinque seriale 01:10 diluizioni in molecolare grado H2O.</li>
	<li>Preparare un mix master qPCR (grande varietà di alternative commerciali), aggiungere primer e sonde ed erogare quantità appropriata (15 µ l se in esecuzione di una reazione di 20 µ l) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di entrambi: un) diluito il campione, b) la curva standard o grado c) molecolare H2O (per servire come nessun controllo del modello) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Sigillare la piastra ed e centrifugare a 100 x g per 1 min.</li>
	<li>Esecuzione in un sistema qPCR con i seguenti parametri: 5 min a 95 ᵒC seguiti da 40 cicli di 95 ᵒC per 20 s, 59 ᵒC per 20 s e 72 ᵒC per 25 s.</li>
	<li>Utilizzare la curva standard a rendimenti di asini e cattura uova strapazzata per valutare la specificità di cattura.</li>
</ol>

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Sequence-Specific+Capture+of+Chromatin+and+Mass+Spectrometric+Discovery+of+Associated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins.</a> Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyCCAPP+as+a+tool+to+characterize+promoter+DNA-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genomics. 107 (6), (2016).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Chromatin-Associated+Proteins+via+Sequence-Specific+Capture+and+Mass+Spectrometric+Protein+Identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+for+the+analysis+of+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins.</a> Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).</li>
<li>Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+budding+yeast+chromatin-associated+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the budding yeast chromatin-associated interactome.</a> Mol Syst Biol. 6, 448(2010).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proteomic+Investigation+of+Chromatin+Functional+Domains+Reveals+Novel+Synergisms+among+Distinct+Heterochromatin+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).</li>
<li>Wang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+captured+by+ChIP-mass+spectrometry+are+linked+to+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).</li>
<li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAP-MS%3A+A+Method+for+Identification+of+Proteins+and+Histone+Posttranslational+Modifications+at+a+Single+Genomic+Locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23942116">Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Capture+of+Chromatin+Interactions+by+Biotinylated+dCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.</a> Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).</li>
<li>Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/content/early/2017/07/04/159517.abstract">CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatin+Protoc.+Third+Ed%22%5BJournal%5D)">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li>
<li>Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li>
</ol>

Non ci sono nessun conflitti di interesse a divulgare.

Il metodo di HyCCAPP qui descritto ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente approccio per scoprire interazioni DNA che altrimenti rimarrebbero sfuggente. La natura del processo dà HyCCAPP la flessibilità di lavorare in diversi organismi e regioni del genoma. Si tratta di un metodo, tuttavia, che ha diverse limitazioni da considerare.
HyCCAPP è un metodo che evita eventuali modifiche di cella in modo che potenzialmente può essere applicato in cellule primarie, sistemi di coltur...

Durante la decade passata, ha visto un forte progresso nelle tecnologie di sequenziamento, permettendo lo studio di una vasta gamma dei genomi in gran numero di campioni e con sorprendente risoluzione. Il Consorzio di Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE), uno sforzo su larga scala di multi-istituzionale guidato dal National Human Genome Research Institute, del National Institutes of Health, ha fornito le comprensioni nei fattori di trascrizione come singoli e altre proteine regolatorie associare a e interagiscono con il genoma. Lo sforzo iniziale caratterizzato interazioni DNA-proteine specifiche, come valutato da immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per oltre 100 noti DNA-binding proteins1. Metodi alternativi come dnasi footprinting2 e formaldeide assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE)3 sono stati utilizzati anche per individuare specifiche regioni del genoma che interagiscono con le proteine, ma con la limitazione evidente che questi approcci sperimentali non identificano le proteine interagenti. Nonostante i notevoli sforzi negli ultimi anni, nessuna tecnologia è emerso che in modo efficiente permette la completa caratterizzazione delle interazioni proteina-DNA nella cromatina e l'identificazione e la quantificazione delle proteine della cromatina-associate.
Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che abbiamo definiti come Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteine per proteomica (HyCCAPP). Inizialmente sviluppato in lievito4,5,6, l'approccio isola reticolato della cromatina le regioni di interesse (con proteine rilegate) mediante acquisizione di ibridazione di sequenza-specifico. Dopo l'isolamento dei complessi proteina-DNA, approcci come spettrometria di massa possono essere utilizzati per caratterizzare l'insieme delle proteine associato alla sequenza di interesse. Così, HyCCAPP può essere considerato come un approccio imparziale per scoprire romanzo interazioni della DNA-proteina, nel senso che esso non si basa su anticorpi e si è completamente agnostico circa le proteine che potrebbero essere presenti. Ci sono altri approcci in grado di scoprire romanzo d'interazione DNA proteine7, ma più si basano su metodi ChIP8,9,10, plasmide inserimenti11,12, 13,14, o regioni con alta copia numeri15. Al contrario, HyCCAPP può essere applicato alle regioni multi - e unico-copia, e non richiede alcuna informazione preventiva circa le proteine nella regione. In aggiunta, mentre alcuni dei metodi menzionati sopra è di pregio, in particolare evitando la necessità per reazioni di reticolazione della DNA-proteina, la caratteristica unica di HyCCAPP è che può essere applicato alle regioni di singola copia in non modificato cellule e senza alcuna conoscenza pregressa proteine leganti presunti, o anticorpi disponibili.
A questo punto, HyCCAPP principalmente è stato applicato all'analisi delle varie regioni genomiche in lievito4,5,6e recentemente è stato utilizzato per analizzare le interazioni proteina-DNA nel DNA di alfa-satellite, una regione di ripetizione nel genoma umano16. Come parte del nostro lavoro in corso, abbiamo adattato l'approccio di cattura di ibridazione inizialmente sviluppato per cromatina lievito essere applicabile per l'analisi delle cellule umane e qui presenti un protocollo modificato che permette la cattura selettiva di copia singola destinazione regioni del genoma umano con efficienze simili ai nostri studi iniziali in lievito. Ora, questo nuovo protocollo ottimizzato permette l'adattamento e l'utilizzo della tecnologia per interrogare le interazioni proteina-DNA in tutto il genoma umano, utilizzando la spettrometria di massa o altri approcci analitici.
È importante sottolineare che il metodo di HyCCAPP è destinato per l'analisi delle regioni di destinazione specifico e non è ancora adatto per le analisi del genoma. La tecnologia è particolarmente utile quando si tratta di regioni per le quali c'è scarse informazioni sulle proteine interagenti, o quando si desidera un'analisi più completa e approfondita delle proteine d'interazione in un locus specifico genoma. HyCCAPP è destinato a scoprire proteine che legano il DNA ma non caratterizzare accuratamente i siti di legame della proteina specifica in DNA genomic. Nell'implementazione corrente, la metodologia non fornisce informazioni circa il grippaggio del DNA sequenze o motivi per singole proteine. Pertanto, ben integra le tecnologie esistenti quali FAIRE e possono consentire l'identificazione delle proteine leganti in regioni genomiche identificato da una prima analisi FAIRE.

<table><tbody><tr><td>Strumento PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>Analizza cattura oligonucleotidi</td></tr><tr><td>PairFold</td><td>UBC</td><td></td><td>Analizza interazioni</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Countess contatore automatico di cellule</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm2 bottiglia a rullo&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>680058</td><td></td></tr><tr><td>Sistema a rulli</td><td>Wheaton</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37 % formaldeide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Ranson sonificatore digitale SFX 150</td><td>Emerson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 fluorimetro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR kit di test</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 1000 kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Magnete Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Magnete DynaMag-15</td><td>Thermo Fisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 atreptavidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Tubi a basso legame</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore e rotatore per provette</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (senza RNasi)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC tampone 20&volte; concentrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

La cattura di ibridazione delle proteine della cromatina associate per tecnologia proteomica (HyCCAPP) è stato inizialmente sviluppata per scoprire nuove interazioni della DNA-proteina in lievito. Consente di analizzare una regione di destinazione di interesse senza la necessità di conoscenza pregressa probabile proteine legate alla regione di destinazione. Questo, in teoria, consente di HyCCAPP essere utilizzati per analizzare qualsiasi regione genomica di interesse e fornisce una flessibilità sufficiente per lavorare in diversi sistemi cellulari. Questo metodo non è destinato a siti di legame di fattori di trascrizione noti, un compito più adatto per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e ChIP-come metodi di studio. La forza di HyCCAPP sta nella sua capacità di esplorare le regioni di DNA, per cui c'è limitata o nessuna conoscenza circa le proteine legate ad esso. Può anche essere un metodo conveniente per evitare biases (presente nel ChIP-come metodi) introdotto da arricchimento di base di proteine della cromatina usando gli anticorpi. Potenzialmente, HyCCAPP può essere un potente strumento per scoprire veramente nuove interazioni della DNA-proteina. Ad oggi, la tecnologia è stata applicata principalmente di cellule di lievito o di ripetere sequenze di alta copia in cellule di mammifero. Al fine di diventare il potente strumento che noi immaginiamo, HyCCAPP approcci devono essere ottimizzate per catturare in modo efficiente copia singola loci in cellule di mammifero. Qui, presentiamo il nostro adattamento del lievito iniziale HyCCAPP protocollo di linee cellulari umane di catturare e mostrare che regioni singola copia della cromatina possono essere efficacemente isolate con questo protocollo modificato.

A causa della necessità di grandi quantità di input della cromatina per HyCCAPP avere successo, le cellule sono coltivate a livelli relativamente elevati di confluenza. Trypan blu colorazione viene utilizzato per confermare che i tassi di morte delle cellule sono moderati (&lt; 10%). In singola copia esperimenti, contenuto di cromatina prima ibridazione cattura deve essere nella gamma femtomolar, che di solito richiede almeno 109 celle come materiale di partenza. Prima gli espe...

Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella nostra comprensione della regolazione del genoma, ad esempio come le varianti di sequenza associate alla malattia nelle regioni non codificanti influenzano l'espressione genica e la regolazione alterando il legame proteico, e può aiutare a identificare tali proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede alcun tipo di manipolazione genetica di cellule o tessuti, né anticorpi, e nessuna conoscenza preliminare delle proteine leganti il DNA che potrebbero interagire con il DNA in quel locus. A dimostrare questa procedura sarà Danu Perumalla, un tecnico del mio laboratorio.Dopo aver progettato gli oligonucleotidi secondo il protocollo di testo, piastrate da 2 a 5 volte 10 al 5° linfoblastoide, o altre linee cellulari, in un pallone T25 con 6 millilitri di terreno RPMI 1640, integrato con 1% di Pen Strep, 2 mil o più di L-glutammina e 5% di FBS. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Utilizzare un emocitometro o un contatore automatico di cellule per misurare la densità cellulare.Prima che le cellule raggiungano da 1 a 10 a 6 cellule per millilitro, farle girare a 100 volt

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura...

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad...

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Esperimenti di immunoprecipitazione SILAC rappresentano un potente mezzo per scoprire nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo l'accurata quantificazione relativa abbondanza di proteine ​​sia nel controllo e campioni di prova, veri interazione può essere facilmente distinto da contaminanti sperimentali e interazioni bassa affinità conservata attraverso l'uso di condizioni di buffer meno stringenti.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Qui presentiamo un protocollo per automatizzare l'analisi post-traduzionale delle modifiche degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di marcatura isotopica a due plex e la digestione ArgC. Questo flusso di lavoro consente un profiling quantitativo, riproducibile e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina e delle risposte epigenetiche a risoluzione di singola cellula.

Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Scopri il metodo HyCCAPP per identificare proteine che interagiscono con il DNA in loci specifici utilizzando cellule di mammifero. Questa tecnica non richiede manipolazione genetica né anticorpi per l'analisi proteomica.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Esplora altri video