Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella nostra comprensione della regolazione del genoma, ad esempio come le varianti di sequenza associate alla malattia nelle regioni non codificanti influenzano l'espressione genica e la regolazione alterando il legame proteico, e può aiutare a identificare tali proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede alcun tipo di manipolazione genetica di cellule o tessuti, né anticorpi, e nessuna conoscenza preliminare delle proteine leganti il DNA che potrebbero interagire con il DNA in quel locus. A dimostrare questa procedura sarà Danu Perumalla, un tecnico del mio laboratorio.

Dopo aver progettato gli oligonucleotidi secondo il protocollo di testo, piastrate da 2 a 5 volte 10 al 5° linfoblastoide, o altre linee cellulari, in un pallone T25 con 6 millilitri di terreno RPMI 1640, integrato con 1% di Pen Strep, 2 mil o più di L-glutammina e 5% di FBS. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Utilizzare un emocitometro o un contatore automatico di cellule per misurare la densità cellulare.

Prima che le cellule raggiungano da 1 a 10 a 6 cellule per millilitro, farle girare a 100 volte G per cinque minuti e trasferirle in un pallone T75 con 25 millilitri del terreno RPMI 1640 preparato in precedenza in questo video. Far crescere le cellule fino a raggiungere una densità cellulare di 1 volte 10 a 6 cellule per millilitro, quindi trasferire le cellule in un pallone T150 in 38 millilitri dello stesso terreno e farle crescere per altri due giorni. Quindi, far girare le celle a 100 volte G per cinque minuti e risospenderle in 10 millilitri di terreno RPMI 1640.

Quindi versare la sospensione in un flacone a rullo da 1850 centimetri quadrati contenente 500 millilitri di terreno e incubare le cellule nelle stesse condizioni di prima, tranne che con rotazione costante. Una volta raggiunta la conta cellulare desiderata, centrifugare la coltura a 100 volte G per cinque minuti e risospendere le cellule in 36 millilitri di terreno RPMI 1640. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri e rimuovere le piccole aliquote per il conteggio delle cellule e l'estrazione del DNA.

Per reticolare le cellule, aggiungere 1 millilitro di formaldeide al 37% per raggiungere una concentrazione finale dell'1%, quindi incubare le cellule a 10-30 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Estinguere la reazione di reticolazione aggiungendo 2 millilitri di una soluzione di glicina 2,5 molari per una concentrazione finale di 125 millimolari. Quindi incubare le cellule con rotazione per cinque minuti.

Dopo aver pellettato le celle mediante centrifugazione, utilizzare 1X PBS ghiacciato per lavare le celle due volte. Continuare con la lisi e la tosatura delle cellule, oppure risospendere il pellet in 5 millilitri di tampone di lisi cellulare e congelare la sospensione goccia a goccia in azoto liquido. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire la lisi e la tosatura, risospendere il pellet in 20 millilitri di tampone di lisi cellulare. Centrifugare le celle a 400 volte G, a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 6 millilitri di tampone di lisi dei nuclei con inibitori della proteasi.

In preparazione alla sonicazione, dividere il campione in modo uniforme in sei-otto provette Microfuge. Posizionare i campioni su ghiaccio o su una griglia fredda e utilizzare un sonicatore con una micropunta per sonicarli al 65% di ampiezza con cinque raffiche costanti di 20 secondi, consentendo alla sospensione di raffreddarsi per almeno 40 secondi tra un impulso e l'altro. Centrifugare le celle a 12.000 volte G e 4 gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare i pellet.

Dopo aver stimato il recupero totale utilizzando la fluorimetria, congelare i campioni. Dopo la preparazione dei tamponi di ibridazione e lavaggio secondo il protocollo di testo, utilizzare 1.200 microlitri di tampone di ibridazione 1X per lavare tre volte 600 microlitri di perline. Quindi utilizzare 1.200 microlitri di tampone di ibridazione 2X per risospendere le perle.

In provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 600 microlitri di campione, 120 microlitri di perle lavate sospese in un tampone di ibridazione 2X e 480 microlitri di tampone di ibridazione 2X. Incubare le provette a 31 gradi Celsius e da 30 a 60 giri/min per 10 minuti. Quindi posizionare le provette su un magnete, fino a quando le perle non sono immobilizzate, e trasferire i campioni in nuove provette prima di scartare le perline.

Risospendere gli oligonucleotidi di cattura in una soluzione di lavoro di 10 picomoli per microlitro e aggiungere 4 microlitri di questa soluzione a ciascuna provetta. Incubare le provette a 42 gradi Celsius in 30-60 giri/min per 40 minuti. Durante l'incubazione, mettere da parte le perle necessarie, lavare le perle tre volte come prima, ma questa volta utilizzare un tampone di ibridazione 1X per risospenderle.

Aggiungere le perle lavate alle provette e incubare i campioni a 30-60 giri/min a temperatura ambiente per 30 minuti. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante una volta che le perline sono state immobilizzate. Dopo aver lavato le perle, eluire il campione aggiungendo 40 microlitri di acqua di grado molecolare e incubare le provette a 94 gradi Celsius per cinque minuti.

Posiziona i tubi sul magnete e attendi un paio di minuti fino a quando la soluzione non si chiarisce, quindi trasferisci il surnatante in un nuovo tubo e scarta le perline. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius, oppure procedere all'analisi proteomica secondo il protocollo di testo. Per valutare la resa di cattura, utilizzare acqua di grado molecolare per diluire un'aliquota dell'eluato, da uno a dieci.

Dopo aver estratto il DNA da un'aliquota presa in precedenza nel video, utilizzare il campione di DNA e l'acqua di grado molecolare per preparare una curva standard, con cinque diluizioni seriali da una a dieci. Preparare una miscela master qPCR aggiungendo primer e sonde ed erogare la quantità appropriata in ciascun pozzetto della reazione. A ciascun pozzetto, aggiungere 5 microlitri del campione diluito, della curva standard o dell'acqua di grado molecolare per fungere da controllo senza modello.

Sigillare il piatto e centrifugarlo a 100 volte G per un minuto. Quindi eseguire i campioni in un sistema qPCR utilizzando i parametri presenti nel protocollo di testo. Infine, utilizzare la curva standard per valutare le rese e la cattura strapazzata per valutare la specificità della cattura.

Qui sono mostrate le catture di ibridazione utilizzando una titolazione di oligonucleotidi. Il numero di oligonucleotidi viene gradualmente aumentato, mentre la concentrazione totale viene mantenuta costante. Questo esperimento aiuta a determinare quanti diversi oligonucleotidi sono necessari per raggiungere un'efficienza di ibridazione ottimale.

Rivela anche eventuali interazioni di ibridazione dannose tra un particolare insieme di oligonucleotidi e se ci sono oligo con scarsa specificità, con conseguente elevato background. Una grande percentuale di frammenti nella cromatina reticolata non sarà suscettibile di cattura per ibridazione. Se la cattura per ibridazione viene eseguita con successo, un successivo esperimento di cattura dello stesso materiale cromatinico, utilizzando un diverso set di oligonucleotidi di cattura, porterà a rese comparabili a quelle di quando si utilizza la cromatina fresca.

Tuttavia, in un secondo esperimento di cattura utilizzando gli oligo originali e la cromatina rimanente dal primo esperimento, la resa diminuirà di circa il 90% se la maggior parte del materiale suscettibile di ibridazione fosse stato catturato nel primo esperimento. Questa figura mostra la cattura per ibridazione di diverse regioni cromosomiche bersaglio, con ciascuna regione che funge da controllo negativo per l'altra. Una sequenza criptata funge anche da vero controllo negativo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare prima gli oligonucleotidi di cattura, per assicurarsi che la regione desiderata sia suscettibile di cattura per ibridazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoprecipitazione della cromatina, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in quale altro punto del genoma si legano le proteine interagenti del DNA identificate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire HyCCAPP al fine di arricchire le regioni genomiche di interesse con lo scopo di identificare de novo le interazioni proteiche locali.