Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di digerire molecole di DNA marcate in fluorescenza con enzimi di restrizione sensibili alla metilazione e non metilazione e determinare la velocità di digestione dell'esperimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica o della biologia, come la genomica. Il vantaggio di questo metodo è che uno scienziato può digerire il DNA pre-colorato con un enzima per determinare se il DNA è a lunghezza intera dopo il completamento di un altro esperimento.

A dimostrare la procedura sarà Drew Thompson, uno studente universitario del mio laboratorio. Per ottenere un gel di agarosio allo 0,7%, pesare 1,4 grammi di agarosio ad alta temperatura di gelificazione in un pallone di Erlenmeyer. Quindi aggiungere 200 millilitri di tampone TAE 1x e posizionare un becher capovolto sopra il pallone.

Scaldare la soluzione su una piastra calda fino a quando iniziano a formarsi delle bolle sul fondo del pallone e galleggiare verso l'alto. Togliete la soluzione dalla piastra calda e lasciatela raffreddare fino a quando il pallone non può essere toccato a mani nude. Quindi versare il gel in uno stampo in gel da 24,5 centimetri per 21,8 centimetri con un pettine in gel per creare dei pozzetti.

Usa la punta di una pipetta per far scoppiare le bolle vicino al pettine o sulla superficie del gel e lascia che il gel si solidifichi per almeno 15 minuti. Per colorare il DNA lambda a sei diverse concentrazioni di coloranti, inizia usando 1x TE per preparare 300 microlitri da 100 nanogrammi per microlitro di DNA lambda. Conservare la soluzione a quattro gradi Celsius.

Durante la preparazione di un campione per ciascuna delle seguenti concentrazioni di colorante per ciascuna banda prevista in un digest di restrizione, colorare da 75 a 100 nanogrammi di DNA lambda non metilato. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, per determinare se un enzima di restrizione può digerire il DNA colorato, aggiungere 20 unità di enzima di restrizione, tre microlitri del tampone appropriato con la massima efficienza di taglio e acqua distillata autoclavata e filtrata per una reazione di 30 microlitri.

Mettere le reazioni in un bagno d'acqua all'attività enzimatica ottimale e incubarle per due-quattro ore. Quindi interrompere le reazioni aggiungendo due microlitri di EDTA 0,5 molare pH 8,0. Rimuovere i lati dallo stampo in gel precedentemente preparato e posizionare il gel nella scatola per elettroforesi su gel.

Versare 2,5 litri di tampone 1x TAE nella scatola. Quindi rimuovere con cura il pettine in gel dal gel in modo che i pozzetti siano accessibili. Pipettare le reazioni dell'enzima di restrizione su un film plastico e, per ogni soluzione di reazione, aggiungere un microlitro di colorante di caricamento 6x per cinque o sei microlitri di soluzione di DNA.

Quindi pipettare le reazioni nei pozzetti. Mescolare un microlitro di una scala kilobase, nove microlitri di 1x TE e due microlitri di colorante di caricamento 6x. Quindi caricare la soluzione nei pozzetti che fiancheggiano le altre soluzioni.

Copri la scatola del gel con una carta o un tessuto blu scuro o nero, quindi collega la scatola del gel a un alimentatore. Impostare l'alimentazione a 30 volt e farla funzionare durante la notte. Spegni le luci mentre il gel è in funzione per evitare la fotoscissione del DNA marcato.

La mattina successiva, trasferisci il gel nel vassoio in un contenitore con 45 microlitri di bromuro di etidio e un litro di 1x tampone TAE. Conservare il contenitore a temperatura ambiente al buio o coprirlo con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Lasciare agire il gel per almeno 45 minuti a temperatura ambiente.

Per visualizzare il gel, posizionare il gel sopra un transilluminatore a luce blu, che emette un'emissione luminosa massima compresa tra 400 e 500 nanometri. Scatta foto con una fotocamera collegata alla stazione. Determinare la velocità di digestione per l'esperimento in base al protocollo di testo.

L'efficienza enzimatica è determinata dividendo il numero totale di bande attese per il numero di bande visibili. Inoltre, al fine di determinare la dimensione approssimativa delle bande, è necessario un controllo per sapere dove sono attese le molecole di DNA native rispetto al DNA colorato. La mobilità delle bande nelle corsie tre e quattro è diminuita, causando lo spostamento delle bande più vicino ai pozzi.

In queste corsie, la quantità di colorante non influisce notevolmente sulla mobilità, quindi le bande corrispondono al controllo. Le corsie cinque e sei mostrano più bande rispetto al controllo, il che indica una digestione parziale, suggerendo che i coloranti hanno influenzato la scissione nei siti di riconoscimento. In questo esperimento, tutte le bande attese sono state osservate per tutte le concentrazioni di colorante, quindi i dadi non hanno interferito con la digestione del DNA.

Per vedere come la mobilità cambiava all'aumentare della concentrazione del colorante YOYO-1, sono stati inseriti asterischi colorati accanto a ciascuna banda. Ad esempio, le bande di 3,5 kilobasi hanno asterischi rossi accanto a loro in ogni concentrazione di YOYO-1. Le bande inaspettate nelle corsie cinque e sei non hanno un asterisco accanto alle fasce.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di coprire il gel con un pezzo di carta scuro e completare l'esecuzione del gel in una stanza buia. Inoltre, assicurati di utilizzare i tubi scuri per le tue reazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come digerire molecole di DNA colorate in fluorescenza con enzimi di restrizione e determinare la velocità di digestione della reazione.

Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etidio può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere precauzioni come indossare guanti e occhiali di sicurezza durante l'esecuzione della procedura. Inoltre, assicurati di indossare occhiali di sicurezza adeguati quando usi un transilluminatore.