Name: Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri come generare mappe del tempo di replicazione del DNA in embrioni di zebrafish a vari stadi di sviluppo. Questo metodo in vivo rivela come i cambiamenti della cromatina influenzano l'inizio della replicazione.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health attraverso concede 5P20GM103636-02 (tra cui il supporto core citometria a flusso) e 1R01GM121703, come pure premi dal centro di Oklahoma per cellule staminali adulte. Ricerca.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Zebrafish forniscono un sistema di modello nuovo e unico in vivo per studiare tempo di replicazione del DNA. Quando temporizzati accoppiamenti vengono eseguiti come dettagliato in questo protocollo sperimentale, migliaia di embrioni possa essere raccolti in un solo giorno per esperimenti. Questi embrioni si sviluppano in modo sincrono attraverso stadi di sviluppo precisamente cronometrati e distintamente caratterizzati. Zebrafish può essere facilmente ed accuratamente organizzato dalla morfologia utilizzando un ...

Per cellule a dividersi con successo, essi devono essere prima accuratamente e fedelmente replicate loro intero genoma. Duplicazione del genoma si verifica in un modello riproducibile, noto come il DNA replica temporizzazione programma1. Tempo di replicazione del DNA è correlata con l'organizzazione della cromatina, segni epigenetici e gene expression2,3. Cambiamenti nel tempo di replicazione si verificano nel corso dello sviluppo e sono significativamente correlati a trascrizionale programmi e alterazioni della cromatina marchi e organizzazione4,5. Inoltre, tempo di replicazione è correlato con frequenze mutazionale, e cambiamenti nella tempistica sono osservati in vari tipi di cancro6,7,8. Nonostante queste osservazioni, i meccanismi e i fattori determinanti di stabilimento di temporizzazione replica e regolamento sono ancora largamente sconosciuti e il ruolo che essa svolge nello sviluppo e la malattia è indeterminata. Inoltre, fino al recente la replicazione del genoma tempi di cambiamenti che si verificano nel corso dello sviluppo dei vertebrati aveva solo stato esaminato in modelli di coltura cellulare.
Zebrafish, Danio rerio, sono adatti a studiare replica temporizzazione in vivo durante lo sviluppo, come una singola coppia di accoppiamento può produrre centinaia di embrioni che si sviluppano rapidamente con molte somiglianze con lo sviluppo dei mammiferi9, 10. Inoltre, nel corso dello sviluppo di zebrafish, ci sono cambiamenti per il ciclo cellulare, organizzazione della cromatina e programmi trascrizionali che condividono relazioni con DNA replica temporizzazione11. Zebrafish sono anche un eccellente modello genetico, come essi sono particolarmente suscettibili alla manipolazione di transgenesi, mutagenesi e mutazioni mirate e schermi genetici hanno identificato molti geni richiesti per sviluppo vertebrato12. Di conseguenza, zebrafish può essere utilizzato per identificare i geni coinvolti nella manutenzione e creazione di temporizzazione replica e osservare gli effetti di deregolamentare il tempo di replicazione sullo sviluppo dei vertebrati. Linee transgeniche possono anche essere utilizzati per valutare il tempo di replicazione da tipi di cella individuale isolato timepoints inerente allo sviluppo differente o in condizioni di malattia. Importante, ci sono vari modelli di zebrafish della malattia umana che può essere utilizzato per studiare il ruolo del tempo di replicazione in malattia formazione e progressione9,13,14.
Recentemente, i profili di sincronizzazione replica primi sono stati generati dallo zebrafish, stabilendola come sistema modello per lo Studio in vivo15di sincronizzazione di replica. A tal fine, le cellule sono stati raccolti da embrioni di zebrafish in più fasi di sviluppo e in un tipo di cellule isolate da adulto zebrafish. Le cellule sono state quindi filtrate FACS (ordinamento di fluorescenza-attivato delle cellule) basato sul contenuto di DNA per isolare popolazioni di fase G1 e S. Utilizzando l'esempio di G1 come un controllo di numero di copia, variazioni del numeri di copie in popolazioni di fase S erano determinati ed utilizzati per dedurre replica relativa temporizzazione16. Cambiamenti nel tempo di replicazione possono essere direttamente confrontate tra diversi campioni inerente allo sviluppo e tipi di cellule e questo è stato utilizzato per determinare cambiamenti nel tempo di replicazione che si verificano in vivo nel corso dello sviluppo dei vertebrati. Questo metodo offre parecchi vantaggi sopra altri metodi di genomiche, soprattutto che non richiede etichettatura con gli analoghi della timidina o immunoprecipitazione di DNA4,6.
Qui è dettagliato i protocolli a tempo di replicazione del DNA di profilo genoma a ad alta risoluzione in zebrafish. Questi protocolli sono stati utilizzati per determinare le relazioni con le caratteristiche genomiche ed epigenetici nel genoma di zebrafish, nonché a modifiche all'analisi in queste relazioni che si verificano durante lo sviluppo. Questi protocolli sono anche facilmente adattati per studiare i cambiamenti nel tempo di replicazione in ceppi mutanti di zebrafish e nei modelli di malattia. Inoltre, questi metodi forniscono una base che può essere estesa, per studiare il tempo di replicazione in tipi cellulari specifici, dal primo procurandomi i tipi di cellule individuali da zebrafish. Zebrafish può servire come un eccellente in vivo sistema modello per studiare il tempo di replicazione e in ultima analisi rivelano le funzioni biologiche di questo importante tratto epigenetico.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di</td><td>proteasi</td><td>Pronasi Sigma 10165921001</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo: Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Reagenti per la quantificazione del DNA basata sulla fluorescenza</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>provetta specializzata per la sonicazione</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicatore</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>Ultrasuoni focalizzati</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>macchina per elettroforesi automatizzata</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reagenti per macchina per elettroforesi automatizzata</td></tr><tr><td>NEBNext Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>Kit di preparazione della libreria di DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Kit di oligo multiplex per Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>oligo multiplex per kit</td></tr> <tr><td>di preparazione della libreria di DNANEBNext Multiplex Oligos Kit per Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td> ulteriori <td>oligo multiplex per kit di preparazione della libreria</td></tr><tr><td>di DNA NEBNext Library Quant Kit per Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>kit di quantificazione per la preparazione della libreria</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>perline magnetiche</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>Piattaforma di sequenziamento del DNA di nuova generazione</td></tr><tr><td>40 & micro; m Filtro cellulare in nylon Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR Piastra di Petri monouso 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 6,0 ml per Nichiryo Modello 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Provette Posi-Click, 1,7 mL, colore naturale</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Senza Dnase/RNASI</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi di lavaggio</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Polietilene a bassa densità, filtro a bocca larga</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6,9 cm, vasca</td></tr><tr><td>di corpetto</td> a maglia fine <td>Acquariofilia</td><td>ZHCT100</td><td>vasca di riproduzione individuale</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A grande</td><td>vasca di riproduzione</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>selezionatrice cellulare</td></tr><tr><td>Wild M5a steromicroscopio</td><td>Wild Heerbrugg Microscopio</td><td>da dissezione</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorimeter</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>metodo quantitativo basato sulla fluorescenza per determinare la concentrazione di DNA</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versione 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versione 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versione 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

tempo di replicazione del dna utilizzando zebrafish come un sistema di modello in vivo di profilatura

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Tempo di replicazione del DNA è una caratteristica importante di cellulare, che esibiscono le relazioni significative con i tassi di mutazione del DNA, trascrizione e struttura della cromatina. Cambiamenti nel tempo di replicazione si verificano durante lo sviluppo e nel cancro, ma il tempo di replicazione di ruolo svolge nello sviluppo e la malattia non è noto. Zebrafish recentemente sono stati stabiliti come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di zebrafish per determinare il tempo di replicazione del DNA. Dopo l'ordinamento delle cellule da embrioni e zebrafish adulto, ad alta definizione modelli di genoma del DNA replica temporizzazione possono essere costruiti determinando cambiamenti nel numero di copia di DNA attraverso l'analisi dei dati di sequenziamento di generazione successivi. Il sistema di modello di Danio rerio consente per la valutazione dei cambiamenti di temporizzazione di replica che si verificano in vivo durante lo sviluppo e può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nei tipi di cellule individuali, modelli di malattia o linee mutanti. Questi metodi consentirà gli studi che studiano i meccanismi e i fattori determinanti di replica temporizzazione stabilimento e manutenzione durante lo sviluppo, il tempo di replicazione di ruolo gioca a mutazioni e tumorigenesi e gli effetti di perturbazione tempo di replicazione su sviluppo e malattia.

Utilizzando dati di intervallo di replica pubblicati, rappresentante replica temporizzazione profili e misure di controllo di qualità sono disponibili15. I passi iniziali dell'elaborazione coinvolgono allineando i dati di sequenziamento del genoma, calcolo lunghezza lettura e statistiche relative alla copertura del genoma e il filtraggio di bassa qualità, spaiati, e letture duplicate PCR. Statistiche di lettura per un esempio di sequenziamento di zebrafish tipici s...

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare mappe temporali di replicazione del DNA dell'intero genoma da embrioni di zebrafish in diverse fasi di sviluppo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ciclo cellulare e della biologia della cromatina, come ad esempio il modo in cui i cambiamenti della cromatina che si verificano durante lo sviluppo embrionale possono influenzare l'inizio delle forcelle di replicazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mappa i cambiamenti di replicazione che si verificano in vivo in fasi definite dello sviluppo embrionale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come cambia la replicazione del DNA durante lo sviluppo del pesce zebra, può anche essere applicato ad altri sistemi o organismi modello, come tunicati, rane e mosche. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché ci vuole un po' di pratica per generare sospensioni di singole cellule da embrioni di zebrafish. La notte prima che gli embrioni vengano raccolti, posizionare dozzine di adulti riproduttori in vasche di riproduzione, utilizzando un numero approssimativamente uguale di maschi

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