Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

L'obiettivo generale di questa procedura è generare mappe temporali di replicazione del DNA dell'intero genoma da embrioni di zebrafish in diverse fasi di sviluppo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ciclo cellulare e della biologia della cromatina, come ad esempio il modo in cui i cambiamenti della cromatina che si verificano durante lo sviluppo embrionale possono influenzare l'inizio delle forcelle di replicazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mappa i cambiamenti di replicazione che si verificano in vivo in fasi definite dello sviluppo embrionale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come cambia la replicazione del DNA durante lo sviluppo del pesce zebra, può anche essere applicato ad altri sistemi o organismi modello, come tunicati, rane e mosche. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché ci vuole un po' di pratica per generare sospensioni di singole cellule da embrioni di zebrafish. La notte prima che gli embrioni vengano raccolti, posizionare dozzine di adulti riproduttori in vasche di riproduzione, utilizzando un numero approssimativamente uguale di maschi e femmine.

A seconda dell'esperimento, utilizzare una delle seguenti strategie di allevamento. Per la prima strategia di riproduzione, posiziona alcuni pesci zebra maschi e femmine in vasche di riproduzione individuali e usa un divisore per separare i maschi dalle femmine. Se si utilizza questo approccio, allestire molte vasche di riproduzione diverse e mettere in comune gli embrioni di ciascuna per garantire che la variabilità biologica sia rappresentativa della popolazione.

Per la strategia di riproduzione numero due, combina dozzine di pesci zebra maschi e femmine in una grande vasca di riproduzione. Utilizzare questa strategia finché c'è un numero sufficientemente elevato di embrioni. È ragionevole supporre che provengano da una varietà di fondatori e siano quindi geneticamente rappresentativi della popolazione.

Per eseguire accoppiamenti a tempo, iniziare non appena i cicli di luce iniziano al mattino. Lasciare che i pesci si riproducano in acque poco profonde per un periodo di 10 minuti, con un doppio fondo attraverso il quale gli embrioni possano fuoriuscire. Dopo 10 minuti, raccogli gli embrioni versandoli attraverso un colino e usando un flacone di lavaggio per sciacquarli in un piatto di 10 centimetri.

Raggruppa tutti gli embrioni raccolti nello stesso momento, contrassegnali con l'ora di raccolta e mettili immediatamente in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. Per garantire che gli embrioni a sviluppo sincrono vengano raccolti, è fondamentale che i lotti di embrioni vengano raccolti ogni 10 minuti. Ciò è particolarmente importante nelle prime fasi dello sviluppo embrionale.

Ci si può aspettare centinaia di embrioni da una singola coppia di accoppiamento in un giorno. Lasciare che gli adulti si riproducano in cicli di 10 minuti fino a quando il numero di embrioni ottenuti non è inferiore a 20. Da una a 1,5 ore circa dopo la raccolta, per selezionare gli embrioni, rimuoverli dall'incubatrice, osservarli al microscopio da dissezione e selezionarli per rimuovere gli ovuli morti e non fecondati.

Conta gli embrioni e posizionali a una densità di 100 embrioni per piastra da 10 centimetri. Aggiungere un terreno E3 fresco e rimettere gli embrioni nell'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato, verificare lo stadio morfologicamente al microscopio ottico secondo le Fasi di sviluppo embrionale del pesce zebra.

Se gli embrioni sono di 48 hpf o più giovani, trasferire fino a 1500 embrioni stadati in un tubo conico da 15 millilitri e utilizzare E3 per lavarli più volte. Per ogni 100 embrioni, aggiungere un millilitro di E3 e 20 microlitri di soluzione di pronasi e agitare delicatamente. È possibile decaffeinare fino a 1500 embrioni in un'unica provetta con 15 millilitri di E3. Appoggiare la provetta su un lato e disporre gli embrioni in uno strato uniforme per garantire il massimo rapporto superficie/volume.

Agitare delicatamente il tubo ogni due o tre minuti fino a quando tutti i corioni sono caduti dagli embrioni. Il tempo totale di decorionazione varia a seconda dell'attività della pronasi. Rimuovere il surnatante e, con 10 millilitri di E3, sciacquare delicatamente gli embrioni tre volte.

Dopo aver messo gli embrioni sul ghiaccio e aver rimosso l'E3 rimanente, utilizzare un millilitro di tampone deyolking ghiacciato appena preparato ogni 500 embrioni per lavare il campione. Successivamente, utilizzando un P1000, pipettare delicatamente gli embrioni su e giù da cinque a 10 volte per interrompere il sacco vitellino. Quindi, trasferire un millilitro in una provetta microfuge da 1,5 millilitri e centrifugare il campione a quattro gradi Celsius e 500 volte la gravità per cinque minuti.

I campioni devono essere pipettati con una certa forza da creare una sospensione a cellula singola senza lisare le cellule. Questo passaggio richiederà un po' di pratica. Rimuovere il surnatante e utilizzare un millilitro di 1x PBS ghiacciato per lavare il pellet per rimuovere la soluzione del Ringer.

Quindi, centrifugare nuovamente il campione. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di 1x PBS. Quindi, posizionare il tubo sul ghiaccio.

Aggiungi tre millilitri di etanolo ghiacciato a un tubo conico da 15 millilitri e agita delicatamente il tubo di EtOH a bassa temperatura. Utilizzando un P1000, gocciolare lentamente la sospensione di cellule embrionali di zebrafish nell'EtOH continuando a vortice. Aggiungere un totale di un millilitro di sospensione cellulare embrionale, per una soluzione di fissazione finale al 75% di EtOH.

Dopo aver aggiunto un millilitro di sospensione cellulare, agitare delicatamente il tubo per mescolare e posizionarlo su un lato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per almeno un'ora, oppure conservare la sospensione nel congelatore per due o tre settimane. Per colorare il DNA embrionale, dopo aver rimosso le cellule embrionali fissate con EtOH da 20 gradi Celsius negativi, centrifugare la provetta a 1500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare il tubo sul ghiaccio e rimuovere con cautela il surnatante.

Quindi, utilizzando un P1000, risospendere delicatamente le cellule in un millilitro di PBS-BSA freddo appena preparato. Centrifugare le celle a 1500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti e posizionare il campione sul ghiaccio. Quindi, rimuovere il surnatante e, per ogni 1.000 embrioni, aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante di ioduro di propidio e risospendere le cellule.

Lasciare incubare le cellule in soluzione PI per 30 minuti con ghiaccio, mescolando delicatamente ogni cinque minuti. Posizionare un colino cellulare in nylon da 40 micrometri su un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Quindi, pipettare delicatamente le cellule per miscelare e filtrare la soluzione cellulare attraverso la rete.

Utilizzando l'estremità interna piatta di uno stantuffo della siringa, rompere delicatamente eventuali grumi di cellule rimanenti sulla rete. Per ogni 1.000 embrioni, utilizzare 500 microlitri di PBS-BSA freddo per sciacquare le cellule attraverso il filtro. Posizionare una rete di 40 micrometri su un tubo conico da 15 millilitri sul ghiaccio e filtrare la sospensione cellulare dal tubo conico da 50 millilitri una seconda volta nel tubo da 15 millilitri.

Infine, utilizzando un apposito strumento di selezione cellulare, impostare l'eccitazione laser a 561 nanometri e il rilevamento delle emissioni a 610 su 20 per rilevare lo ioduro di propidio. Ordina le celle ed esegui ulteriori analisi secondo il protocollo di testo. Per determinare la qualità della mappatura di lettura, i dati di sequenziamento devono prima essere allineati al genoma, utilizzando le statistiche dei valori mapQ.

Inoltre, le statistiche sulla lunghezza di lettura calcolate vengono tracciate come istogramma della distribuzione delle dimensioni degli inserti per tutte le letture di sequenziamento. Questo particolare esperimento ha portato a una mediana di 170 bp. Questo grafico a barre illustra le statistiche di lettura per il totale delle letture mappate, le letture contenenti un flag di bassa qualità, le letture con coppie mappate su un cromosoma diverso, le letture con una coppia oltre la soglia di distanza e i duplicati PCR.

Di seguito sono elencati i numeri rappresentativi delle letture totali mappate, non mappate e non accoppiate, della copertura e della risoluzione di lettura per una tipica esecuzione di sequenziamento di un campione di zebrafish. Dopo il filtraggio, i conteggi delle letture vengono determinati in finestre di dimensioni variabili e i dati vengono smussati e normalizzati. Qui sono mostrati i tipici profili temporali di replicazione levigati e normalizzati di un cromosoma rappresentativo di zebrafish per le repliche biologiche.

I profili per le repliche biologiche e sperimentali dovrebbero essere molto simili e mostrare anche un'elevata correlazione lungo la lunghezza del cromosoma. I profili dovrebbero anche mostrare un'elevata correlazione tra i valori temporali a livello di genoma. La mappa dei colori rappresenta il coefficiente di correlazione di Pearson.

Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare di assicurarsi che vengano raccolti gli embrioni a sviluppo sincrono. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le iniezioni di morfolino o la mutagenesi CRISPR-Cas9, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono i meccanismi attraverso i quali la replicazione del DNA è coordinata con altri processi di sviluppo? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere cellule in fasi specifiche del ciclo cellulare da embrioni di zebrafish in sviluppo sincrono.

La raccolta di questi campioni è fondamentale per generare mappe temporali di replicazione del DNA dell'intero genoma.