Name: I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Scopri come studiare le forze meccaniche nella morfogenesi cerebrale embrionale del pulcino usando esperimenti ex-ovo e modellazione fisica. Questo metodo consente di caratterizzare i processi morfogenetici a livello tessutale.

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Z.C. riconosce il sostegno dal fondo di avvio di Dartmouth e Branco Weiss - Society for Science fellowship, amministrata dal Politecnico federale di Zurigo. Gli autori ringraziano la d. ssa Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo e Yunfei Shi per utili discussioni, nonché i revisori anonimi per i commenti. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto Grant No. DGE-1313911. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.

1. preparazione di terreni di coltura del tessuto
<ol><li>Utilizzare una bottiglia da 0,5 L dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) con glucosio 4,5 g/L, bicarbonato di sodio e L-glutamina come base per i terreni di coltura.</li>
	<li>In una cappa a flusso laminare sterile, aggiungere 10 mL di antibiotici al 0,5 l di DMEM.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sterile, trasferire 50 mL della soluzione di antibiotici DMEM in una provetta conica sterile 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 50 mL di siero di pulcino per la soluzione di antibiotici DMEM rimanente nella bottiglia 0,5 L nella cappa sterile.</li>
	<li>Conservare la soluzione finale (denominata di seguito come terreni di coltura pulcino [CCM]) in 50 mL tubo conico aliquote a-20 ° C.</li>
</ol>2. l'incubazione delle uova
<ol><li>Uso delicato pulisce con etanolo al 70% per pulire specifici esenti da patogeni White Leghorn pollo uova fecondate. Disporre le uova in un orientamento longitudinale sui titolari.</li>
	<li>Accendere un'incubatrice per impostare una temperatura di 37,5 ° C e mantenere l'umidità al 48-55%. L'umidità è controllata con l'aggiunta di una quantità appropriata di acqua nell'incubatore.</li>
	<li>Incubare le uova HH11-13 e circa 40-44 h.</li>
	<li>Lasciare che le uova raffreddare a temperatura ambiente per circa 15-30 min prima della spruzzatura/pulizia con etanolo al 70%.</li>
</ol>3. tirare tubi capillari in vetro
<ol><li>Montare un 10 tubi capillari di vetro lungo cm con un diametro esterno di 1,0 mm e un diametro interno di 0,5 mm su un estrattore micropipetta.</li>
	<li>Impostare il calore e tirare i parametri a 750 e 400, rispettivamente. Premere il pulsante di tirare per tirare il tubo capillare in aghi sottili.</li>
</ol>4. carta da filtro vettore metodo
<ol><li>Tagliare cerchi di circa 3 cm di diametro da carta da filtro.</li>
	<li>Tagliare un rettangolo di circa 1 cm di 2 cm dal cerchio utilizzando una perforatrice. Assicurarsi di rimuovere qualsiasi sporgenti o spigoli vivi.</li>
</ol>5. embrione raccolta e preparazione
<ol><li>Rompere le uova dalla parte inferiore, separare il guscio delicatamente e accuratamente depositare contenuto in una capsula Petri 150 x 15 mm. Per assicurarsi che il lato di embrione sia alto, mantenere le uova nello stesso orientamento che essi sono stati incubati mentre li di cracking.</li>
	<li>Rimuovere l'albumina sottile utilizzando una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Separare l'albumina spessa dal tuorlo usando il forcipe concluso smussato. Garantire che l'albumina di spessa è stato rimosso da raschiare leggermente la parte superiore del tuorlo con il forcipe smussato si è conclusa.</li>
	<li>Utilizzare pinze a punta fine per centrare e posizionare un anello di carta da filtro sopra l'embrione, corrispondente all'asse lungo dell'anello con l'asse lungo dell'embrione.</li>
	<li>Tagliare il tuorlo che circonda l'anello di carta da filtro con le forbici.</li>
	<li>Tirare l'anello e l'embrione fuori il tuorlo in una direzione obliqua verso il sito dove il tuorlo in primo luogo è stato tagliato.</li>
	<li>Sciacquare gli embrioni in due piatti sequenziale di 100 mm con temperatura ambiente 1 x tamponato fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Inserire un anello di carta da filtro in una capsula Petri 35mm prima. Quindi posizionare il lato dorsale dell'embrione fino sulla carta da filtro già in 35mm di Petri.</li>
	<li>Inserire un anello di acciaio sopra il panino di carta da filtro. Assicurarsi di non danneggiare l'embrione.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di CCM precedentemente preparato per ogni scatola di Petri.</li>
	<li>Rimuovere la macchina virtuale di ogni embrione scremando leggermente l'ago capillare tirato attraverso la parte superiore dell'embrione e peeling la VM di distanza, a partire dall'estremità anteriore (proprio sopra il proencefalo) e procedere alla notocorda (Figura 1A).</li>
	<li>Inserire otto 35mm di Petri in un piatto di 150 mm che è stato rivestito con salviettine delicato compito saturata d'acqua (per mantenere umidità).</li>
	<li>Posto di Petri 150mm in un sacchetto di plastica sigillabile quindi riempire la borsa con una miscela di gas composta da 95% O2 e 5% CO2.</li>
	<li>Sigillare il sacchetto e metterlo in un'incubatrice di 37,5 ° C.</li>
	<li>Incubare gli embrioni per un ulteriore 27 h fino a HH15-HH16 (Figura 1B).</li>
</ol>6. che induce tensione superficiale
<ol><li>Rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e utilizzare un sistema di tomografia a coerenza ottica a loro immagine. Uso OCT per determinare l'angolo di torsione del tubo neurale (NT) (Figura 2).</li>
	<li>Trasferire gli embrioni per un microscopio chiaro e visualizzare a 10 ingrandimenti. Utilizzare una pipetta 200 microlitro per togliere in modo incrementale 0,2 mL di media di Petri.</li>
	<li>Prendere immagini campo chiaro a ogni intervallo per osservare gli effetti dell'interfaccia multimediale-aria sull'embrione.</li>
	<li>Rimuovere il supporto fino a quando la tensione superficiale attraverso l'embrione induce torsione (Figura 1).</li>
	<li>Immagine dell'embrione utilizzando il sistema OCT ancora una volta per stabilire un angolo di torsione finale per il confronto di controllare gli embrioni.  Nota: Le immagini del campo luminoso sono state acquisite utilizzando un microscopio per dissezione. Un sistema di tomografia ottica di coerenza con un microscopio collegato è stato utilizzato per acquisire gli stack di immagine a sezione trasversale degli embrioni dal vivo. Immagini sono stati ottenuti in un dominio di scansione3 3 x 10 x 3 mm, poi trasformati in un software di imaging. Infine, le immagini del modello fisico sono state scattate con una digital single-lens reflex.</li>
</ol>7. physical Modelling delle forze di tensione superficiale/VM
<ol><li>Sviluppare una geometria 3D semplificata che assomiglia ad un embrione tra HH14-17 nel software di modellazione commerciale (Figura 3A).</li>
	<li>La progettazione dello stampo negativo della geometria 3D nel software di grafica computer 3D commerciale.</li>
	<li>Uso una stampante 3D caricata con filamento di 1,75 mm acrilonitrile-butadiene-stirene a 3D stampare lo stampo progettato, in formato stereolithographic (STL).</li>
	<li>Per lanciare lo stampo, mescolare componenti di elastomero di silicone gomma A e B in parti uguali e versare la miscela nello stampo prontamente; impostare lo stampo di colata per curare a temperatura ambiente per 12 h (Figura 3B).</li>
	<li>Contrassegnare il modello fisico dell'embrione lungo il NT dal lato dorsale di visualizzare torsione.</li>
	<li>Utilizzare un vetrino coprioggetto per replicare la forza applicata al modello fisico 3D che imita quella del VM o tensione superficiale (Figura 3D).</li>
	<li>Inserire una serie di fili rigidi di lunghezza uguale al lato del modello fisico. Dopo il coprioggetto esercita una forza esterna sul modello del cervello, i fili diventano inclinati di un angolo che dipende dalla posizione. Determinare l'angolo di rotazione di arctan della lunghezza proiettata sopra la lunghezza originale di ogni filo (Figura 3E).</li>
</ol>8. alterare la direzione del ciclo cuore
<ol><li>Seguire i passaggi in 3.1 e 3.2 per ottenere un tubo capillare tirato.</li>
	<li>Seguire i passaggi in 5.1 attraverso 5.10 per preparare l'embrione.</li>
	<li>Utilizzare un paio di pinze per capovolgere la carta da filtro in modo che l'embrione diventa ventrale-side-up.</li>
	<li>Utilizzare il tubo capillare tirato per tagliare aperto una fessura nella membrana splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>Utilizzare il tubo capillare per esercitare una forza meccanica per spingere il cuore dal lato destro al lato sinistro.</li>
	<li>Seguire i passaggi in 5.12 attraverso 5.15 per osservare il cambiamento in torsione.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Mentre fenomeni fisici giocano un ruolo integrante nella morfogenesi26,27,28,29,30, i meccanismi meccanici specifici, insieme con il coordinamento della meccanica e meccanismi molecolari, rimangono in gran parte inesplorate. È noto che il ventrale flessione e torsione verso destra del cervello primitivo sono due processi centrali che contribuiscono al precoce ...

Ricerca moderna biologia inerente allo sviluppo in gran parte si concentra sullo sviluppo di comprensione dal punto di vista di genetica molecolare1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. è noto che fenomeni fisici svolgono un ruolo centrale nella morfogenesi, oppure la generazione di biologico forma14,15,16,17; Tuttavia, specifici meccanismi meccanici di sviluppo rimangono in gran parte. Ventrale flessione e torsione verso destra del tubo primitivo cervello dopo Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)18 sono i due principali processi che contribuiscono alla forma embrionale cambio19,20. In particolare, il meccanismo fisico alla base dello sviluppo torsionale nel cervello embrionale rimane in modo incompleto capito.
La torsione embrionale in embrione di pollo è tra i primi eventi morfogenetici di sinistra-destra (L-R) asimmetria in sviluppo. Quando il processo di asimmetria L-R viene perturbato, difetti di nascita come situs inversus, isomeriao eterotassia verificherà21. Qui presentiamo un protocollo che unisce ex-ovo esperimenti22,23 con modellazione fisica per caratterizzare le forze meccaniche durante lo sviluppo iniziale del cervello embrionale. L'obiettivo del metodo presentato è quello di identificare le forze meccaniche responsabile torsione cervello e i fattori che influenzano il grado di torsione durante lo sviluppo iniziali12. Basato sull'osservazione sperimentale che la membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione, abbiamo supposto che la VM fornisce la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Pertanto, in questo metodo, abbiamo rimosso la parte di VM che copre l'area del cervello per scoprire gli effetti sulla torsione cervello. Inoltre, il metodo di applicazione fluido tensione superficiale è stato utilizzato per confermare il ruolo meccanico della macchina virtuale e fornire una stima della forza necessaria per torsione del cervello, che non era stato fatto in precedenza. Misurare le forze durante la morfogenesi embrionale è un compito impegnativo. In particolare, in uno studio pionieristico, Campàs e collaboratori24 ha sviluppato un nuovo metodo per quantificare lo stress cellulare utilizzando microgocce iniettato. Tuttavia, questo metodo è stato limitato alla misurazione di forze a livello cellulare, quindi non applicabile per sondare le forze a livello del tessuto o organismo. Il protocollo presentato in questo documento è stato sviluppato per parzialmente colmare questa lacuna.

<table><tbody><tr><td>Fecondato Uova di gallina bianca livornese prive di agenti patogeni</td> specifici <td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tomografia ottica</td><td>coerente Microscopio Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Elastomero siliconico</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento Sutter Modello</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Software di computer grafica 3D Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio collegato con OCT</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo</td><td>EOS&nbsp;</td><td>Ribelle T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

i ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Lo sviluppo embrionale è tradizionalmente studiato dal punto di vista della genetica biomolecolare, ma l'importanza fondamentale della meccanica nella morfogenesi è sempre più riconosciuta. In particolare, il tubo embrionale del pulcino cuore e cervello, che subiscono drastici cambiamenti morfologici come si sviluppano, sono tra i principali candidati per studiare il ruolo delle forze fisiche nella morfogenesi. Progressiva flessione ventrale e torsione verso destra del cervello embrionale tubolare pulcino accadere alle primissime fasi dell'organo-livello sinistra-destra asimmetria nello sviluppo embrionale del pulcino. La membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione ed è stata implicata nel fornire la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Qui presentiamo una combinazione di nuovo ex-ovo esperimenti e modelli per identificare i meccanismi di torsione cervello fisici. In fase di Hamburger-Hamilton 11, gli embrioni vengono raccolte e coltivati ex ovo (Media). La macchina virtuale viene successivamente rimosso utilizzando un tubo capillare tirato. Controllando il livello del fluido e sottoporre l'embrione a un'interfaccia liquido-aria, la tensione superficiale liquido dei media può essere utilizzata per sostituire il ruolo meccanico della macchina virtuale. Microchirurgia esperimenti sono stati eseguiti anche per modificare la posizione del cuore per trovare il conseguente cambiamento nella chiralità di torsione cervello. Risultati da questo protocollo illustrano i ruoli fondamentali della meccanica nella morfogenesi di guida.

In questo studio, la macchina virtuale dell'embrione alle HH11 è stato rimosso dall'estremità anteriore alla flessione toracica. Gli embrioni erano imaged tramite un sistema di OCT. In questa fase, la torsione del tubo del cervello non è avviato (Figura 1A). Dopo essere incubate a HH15-16, embrioni con loro VM rimosso ha esibito riduttrice del cervello tubo torsione, circa 35 gradi (Figura 1B) rispetto per controllare gli embrion...

Qui, presentiamo un protocollo introducendo una serie di nuovi esperimenti di ex-ovo e approcci di modellazione fisica per studiare la meccanica della morfogenesi durante primi torsione cervello embrionale di pulcino.

I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di studiare il ruolo delle forze meccaniche nello sviluppo embrionale precoce del cervello attraverso esperimenti ex ovo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo e nella biomeccanica, come il ruolo dei segnali meccanici nella morfogenesi, che è la generazione della forma biologica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la caratterizzazione del ruolo delle forze meccaniche nella morfogenesi a livello di tessuto e organismo.Per iniziare questa procedura, utilizzare salviette delicate con etanolo al 70% per pulire le uova di gallina White Leghorn fertilizzate prive di agenti patogeni specifici. Quindi, disporre le uova in orientamento longitudinale su un supporto. Successivamente, impostare l'incubatrice per uova a una temperatura target di 37.5 gradi Celsius e mantenere l'umidità dal 48 al 55%L'umidità viene controllata aggiungendo una quantità adeguata di acqua all'incubatrice.Incubare le uova per circa 40-44 ore a HH11-13. Successivamente, lascia raffreddare le uova a temperatura ambiente per circa 15-30 minuti prima di pulirle con etanolo al 70%. In ques

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Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie...

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Vengono descritti protocolli che utilizzano barriere impermeabili per bloccare gli eventi di induzione tra i tessuti dell'asse principale del corpo e il fianco nell'embrione di pollo necessari per la formazione degli arti. Le perle imbevute di segnali induttivi candidati vengono utilizzate per superare l'effetto del posizionamento della barriera e l'analisi dell'espressione genica lo conferma.

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio un foglio leggero e la sua attuazione a sonda meccanica delle cellule senza perline nell'embrione della drosofila .

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l'influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.

Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare

Il test del tallone imbevuto prevede la consegna mirata del reagente di prova in qualsiasi momento dello sviluppo per studiare la regolazione della differenziazione cellulare e della morfogenesi. Viene presentato un protocollo dettagliato, applicabile a qualsiasi modello animale sperimentale, per preparare tre diversi tipi di perline imbevute e impiantarle nell'interdigit di un embrione di pollo.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Scopri come studiare le forze meccaniche nella morfogenesi cerebrale embrionale del pulcino usando esperimenti ex-ovo e modellazione fisica. Questo metodo consente di caratterizzare i processi morfogenetici a livello tessutale.

I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

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