I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di studiare il ruolo delle forze meccaniche nello sviluppo embrionale precoce del cervello attraverso esperimenti ex ovo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo e nella biomeccanica, come il ruolo dei segnali meccanici nella morfogenesi, che è la generazione della forma biologica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la caratterizzazione del ruolo delle forze meccaniche nella morfogenesi a livello di tessuto e organismo.

Per iniziare questa procedura, utilizzare salviette delicate con etanolo al 70% per pulire le uova di gallina White Leghorn fertilizzate prive di agenti patogeni specifici. Quindi, disporre le uova in orientamento longitudinale su un supporto. Successivamente, impostare l'incubatrice per uova a una temperatura target di 37.5 gradi Celsius e mantenere l'umidità dal 48 al 55%L'umidità viene controllata aggiungendo una quantità adeguata di acqua all'incubatrice.

Incubare le uova per circa 40-44 ore a HH11-13. Successivamente, lascia raffreddare le uova a temperatura ambiente per circa 15-30 minuti prima di pulirle con etanolo al 70%. In questa fase, rompi le uova dal fondo, separa delicatamente il guscio e deposita con cura il contenuto in una capsula di Petri da 150 x 15 millimetri.

Per assicurarti che il lato dell'embrione sia rivolto verso l'alto, mantieni le uova con lo stesso orientamento con cui sono state incubate mentre le rompi. Rimuovere l'albumina sottile utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta. Separare l'albumina densa dal tuorlo usando la pinza smussata.

Assicurati che l'albumina densa sia stata rimossa raschiando leggermente la parte superiore del tuorlo. Quindi, utilizzando una pinza a punta fine, posizionare un anello di carta da filtro sull'embrione e centrarlo, facendo corrispondere l'asse lungo dell'anello con l'asse lungo dell'embrione. Successivamente, tagliare il tuorlo che circonda l'anello di carta da filtro con le forbici.

Successivamente, estrarre l'anello e l'embrione dal tuorlo in direzione obliqua verso il sito in cui il tuorlo è stato tagliato per la prima volta. Quindi, sciacquare l'embrione in due piatti sequenziali da 100 millimetri con PBS a temperatura ambiente. Quindi, posiziona un anello di carta da filtro in una capsula di Petri da 35 millimetri.

Posiziona l'embrione con il lato dorsale rivolto verso l'alto sull'altra carta da filtro nella capsula di Petri da 35 millimetri. Successivamente, posiziona un anello in acciaio inossidabile sopra il sandwich di carta da filtro. Fare attenzione a non danneggiare l'embrione.

Ora, aggiungi tre millilitri del CCM precedentemente preparato a ciascuna capsula di Petri. Rimuovere la membrana vitellina di ciascun embrione sfiorando leggermente l'ago capillare tirato sulla parte superiore dell'embrione. Quindi, staccare la membrana vitellina, partendo dall'estremità anteriore e procedendo fino alla notocorda.

Successivamente, metti otto piastre di Petri da 35 millimetri in una pirofila da 150 millimetri rivestita con salviettine sature d'acqua per mantenere l'umidità. Quindi, metti la capsula di Petri da 150 millimetri in un sacchetto di plastica sigillabile e riempi il sacchetto con una miscela di gas composta dal 95% di ossigeno e dal 5% di CO2. Sigilla il sacchetto e mettilo in un'incubatrice a 37,5 gradi Celsius.

Ora, rimuovi l'embrione dall'incubatrice e usa un sistema OCT per visualizzarlo e determinare l'angolo di torsione del tubo neurale. Trasferisci gli embrioni al microscopio ottico e visualizza con un ingrandimento 10X. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rimuovere in modo incrementale 0,2 millilitri di terreno dalla piastra di Petri.

Scatta immagini in campo chiaro dopo ogni ciclo di rimozione del terreno per osservare l'effetto dell'interfaccia media-aria sull'embrione. Continuare a rimuovere il terreno fino a quando la tensione superficiale attraverso l'embrione induce la torsione. Visualizzare nuovamente l'embrione utilizzando il sistema OCT per stabilire un angolo di torsione finale per il confronto con gli embrioni di controllo.

Per modificare la direzione dell'ansa cardiaca, usa un paio di pinze per capovolgere la carta da filtro in modo che l'embrione diventi con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzare il tubo capillare tirato per aprire una fessura nella membrana splanchnopleure ed esercitare una forza meccanica per spingere il cuore dal lato destro al lato sinistro. Applicare la tensione superficiale del fluido per mantenere il cuore sul lato sinistrorso.

Quindi, incubare l'embrione per altre 20 ore per vedere il cambiamento nella chiralità della torsione. Qui è mostrato un embrione raccolto con VM rimosso a HH11. Lo stesso embrione è stato incubato per 27 ore dopo la rimozione del VM mostrando una torsione ridotta.

Ecco lo stesso embrione che ha subito la torsione cerebrale dopo l'applicazione della tensione superficiale del fluido, e qui c'è l'embrione di controllo con torsione cerebrale normale in uno stadio comparabile. Durante il tentativo di questa procedura, è importante fare attenzione a non danneggiare l'embrione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi degli elementi finiti per modellare computazionalmente il modo in cui le forze fisiche possono influenzare la morfologia.

Pertanto, questa tecnica qui sviluppata ha aperto la strada a futuri studi sulla meccanica della morfogenesi negli embrioni di pollo. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come raccogliere embrioni di pollo per la coltura in vitro, rimuovere microchirurgicamente la membrana vitellina, ricapitolare la forza fornita dalla membrana vitellina e monitorare la morfologia embrionale attraverso l'OCT e l'imaging in campo chiaro.