Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare il carico fungino polmonare nei topi con aspergillosi invasiva mediante analisi istologica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi fungina sui meccanismi di risposta protettiva e dannosa dell'ospite e sui fattori chiave della virulenza fungina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i campioni istologici esistenti possono essere utilizzati per ottenere la carica fungina con risultati paragonabili all'applicazione quantitativa della PCR del DNA fungino polmonare.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'aspergillosi invasiva, può essere applicato anche ad altri studi sulla malattia in cui i patogeni possono essere colorati in modo differenziale all'interno dei tessuti dell'ospite. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a pensare a metodi alternativi per quantificare il carico fungino polmonare con una minore variabilità rispetto ai metodi quantitativi del DNA. A dimostrare le procedure di infezione e raccolta sarà Angar Tsoggeral, un tecnico di ricerca.

24 ore prima dell'infezione, esaurire i neutrofili in ciascun topo sperimentale di età compresa tra sette e 10 settimane con 0,5 milligrammi di anticorpo anti-topo-Ly-6G in soluzione salina sterile somministrata per via intraperitoneale con un angolo di 45 gradi nel quadrante laterale inferiore destro di ciascun animale e riportare i topi nelle loro gabbie. La mattina successiva, versare 1,5 grammi di perle di vetro da 0,5 millimetri su una piastra di coltura di condi A. fumigatus e inclinare delicatamente la piastra avanti e indietro fino a quando le perle non sono ricoperte dal fungo. Raccogliere la miscela di perle rivestite di conidi in un tubo conico da 15 millilitri e sospendere le perle in cinque millilitri di DPBS.

Agitare le perle per staccarle dal fungo e contare i conidi in una diluizione 50X del surnatante su un emocitometro. Diluire i conidi a una volta per 10 fino all'8° conidi per millilitro di concentrazione di DPBS e caricare 50 microlitri di soluzione di conidi per topo in singole micropipette. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, posizionare il primo topo anestetizzato su una tavola inclinata in posizione supina e trattenere delicatamente gli incisivi superiori con un elastico e gli incisivi inferiori con un filo metallico.

Quindi, utilizzare una piccola pinza per tenere con cura la lingua alla massima estensione e rilasciare 50 microlitri di soluzione di conidi alla base della lingua. Mantenendo la lingua alla massima estensione, ascolta il respiro rapido e il distinto rumore di clic dell'aspirazione per 20 secondi o fino a quando la sospensione non è completamente aspirata. Quindi, rimetti delicatamente il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino alla completa decubito e infetta l'animale successivo.

Quando tutti i topi sono stati infettati, iniettare un sottogruppo di animali con un agente antimicotico e ripetere la deplezione dei neutrofili in tutti gli animali 24 ore dopo l'infezione. Tre giorni dopo la somministrazione del fungo, posizionare il primo topo in posizione supina su una tavola di schiuma coperta da un tampone assorbente. Assicurati che il topo venga soppresso con un pizzico di dita dei piedi e disinfetta i capelli con etanolo al 70%.

Dopo aver fissato gli arti, usa le forbici per aprire con cautela la cavità toracica superiore tagliando via la gabbia toracica per esporre i polmoni e il cuore. Tagliare la vena cava inferiore che scende dal cuore facendo attenzione a non tagliare altri vasi sanguigni o perforare alcun organo, e utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 25 tenuto ad un angolo di 45 gradi per perfondere lentamente cinque millilitri di DPBS freddo nel ventricolo destro del cuore. Dopo la perfusione con cinque millilitri di formalina al 10% allo stesso modo, esporre accuratamente la trachea e staccare i cuscinetti adiposi circostanti facendo attenzione a non perforare la trachea.

Sollevare la trachea esposta con una pinza e utilizzare un ago calibro 25 per praticare un foro nella trachea superiore. Inserire con cautela una cannula attraverso il foro verso i polmoni e legare un filo chirurgico attorno alla trachea per fissare la cannula. Utilizzare una siringa da un millilitro per gonfiare i polmoni con un millilitro di tampone di formalina al 10% attraverso la cannula e rimuovere rapidamente, ma con attenzione, la cannula.

Stringere il filo chirurgico per sigillare la trachea e tirare delicatamente il filo per scollegare il tessuto connettivo consentendo il prelievo dei polmoni e della trachea. Mettere i fazzoletti in una provetta conica da 15 millilitri contenente 15 millilitri di tampone di formalina al 10% con un'estremità del filo all'esterno della provetta. Quindi, sigillare il tappo e capovolgere la provetta per immergere completamente il campione e il fissativo per almeno 24 ore.

Per visualizzare il tessuto raccolto, aprire prima un programma di quantificazione dell'imaging appropriato e utilizzare un microscopio ottico per ottenere almeno quattro campi distinti di ciascun vetrino di metanammina argentato modificato di Gomori, o colorato con GMS, sotto l'obiettivo 10X. Assicurarsi che le immagini siano rappresentative delle vie aeree infette all'interno del polmone e che mostrino una densità di tessuto simile. Per aggiungere barre di scala alle immagini, nel menu Modifica, selezionare Aggiungi/Modifica segni di calibrazione e selezionare lo spessore della linea, il colore e la dimensione della barra di scala.

Fare clic sull'immagine in cui deve essere posizionata la barra di scala, quindi aprire il menu Modifica e selezionare Unisci e Unisci segni di calibrazione per aggiungere una barra di scala a ciascuna immagine e salvare le immagini nelle cartelle del gruppo sperimentale appropriate. Per calcolare la carica fungina in ogni animale, aprire un programma di elaborazione delle immagini appropriato e aprire la prima cartella di immagini. Nel menu Immagine, seleziona Tipo e Stack RGB per convertire le immagini.

Utilizzando il tasto freccia destra, selezionare la seconda delle tre immagini e premere Ctrl-Maiuscole-T per aprire il regolatore delle impostazioni del menu Soglia. Individua l'immagine tiff o jpg originale come riferimento e apri l'immagine con un programma di visualizzazione delle immagini. Quando si seleziona il valore di soglia, è fondamentale essere in grado di visualizzare l'immagine originale in modo che l'area selezionata sia rappresentativa delle ife fungine e per garantire la coerenza tra i campioni.

Spostare il cursore superiore completamente a sinistra e regolare il cursore inferiore fino a quando l'area rossa selezionata non è rappresentativa dell'immagine al microscopio. Fare clic su Imposta e OK, quindi selezionare Analizza e Imposta misurazioni selezionando Area, Frazione area, Limite alla soglia, Visualizza etichetta e lasciando le impostazioni inferiori come predefinite. Fare clic su OK e selezionare Analizza e misura.

Dovrebbero apparire i risultati. Quindi, esportare i dati in un programma di analisi dei dati per la rappresentazione grafica e l'analisi statistica e inserire la media delle quattro o più percentuali di area per ciascun campione polmonare. Come dimostra questo grafico rappresentativo della sopravvivenza, i topi con deficit di eosinofili con aspergillosi invasiva trattati con un agente antimicotico post-infezione mostrano una maggiore sopravvivenza rispetto agli animali wild-type.

La colorazione rappresentativa del GMS da topi neutropenici wild-type e eosinofili-deficienti con aspergillosi invasiva rivela una clearance fungina quasi totale nei topi knockout trattati con antimicotici che non è ricambiata negli animali wild-type con o senza trattamento antimicotico. Inoltre, la PCR quantitativa e la quantificazione manuale al microscopio ottico GMS, come appena dimostrato, confermano che il trattamento con agenti antifungini determina la più significativa diminuzione del carico fungino tra i topi wild-type e quelli carenti di eosinofili. Tuttavia, nei topi non trattati, solo la quantificazione GMS ha determinato una diminuzione significativa dei topi carenti di eosinofili in questo esperimento.

Quando le aree medie delle sezioni colorate con GMS dell'intero polmone sono calcolate con un ingrandimento quattro X, le differenze sono simili ai risultati ottenuti con quattro campi 10X rappresentativi, anche se con minore significatività statistica. Risultati simili di sopravvivenza, carico fungino e clearance fungina sono stati osservati anche nei topi carenti di cellule T gamma-delta trattati con lo stesso agente antimicotico. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante rimanere coerenti quando si scattano foto delle sezioni istologiche e quando si regola il valore di soglia per ottenere risultati comparabili.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi che prevedono l'analisi istologica di campioni di chiare differenze tra la colorazione target e quella di fondo per rispondere a ulteriori domande relative alla patologia della malattia nei polmoni e in altri tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare i topi con conidi fungini mediante aspirazione involontaria e come misurare la crescita fungina in sezioni di tessuto polmonare con un software di elaborazione delle immagini. Non dimenticare che lavorare con l'Aspergillus fumigatus e la colorazione d'argento metanamina modificata di Gomori può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare sotto una cappa ben ventilata.