Name: Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri una tecnica riproducibile per valutare la rottura della barriera emato-encefalica in modelli di ratto con ictus ischemico, utilizzando l'occlusione intraluminale e il metodo del blu di Evans.

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Gli autori sono grati al Vice Cancelliere per la ricerca della Ardabil University of Medical Sciences (Ardabil, Iran) per il sostegno finanziario (concedere No: 9607).

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida di Ardabil University of Medical Sciences Research Council per lo svolgimento di studi sugli animali (numero ordine etico: IR ARUMS. REC.1394.08). In questo studio visualizzato in quel momento, abbiamo usato ratti Sprague-Dawley maschio adulto (300-350 g) ottenuti da pascolo Institute (Teheran, Iran).
1. anestesia e flussometria
<ol><li>Inducono anestesia utilizzando 4% isoflurane e mantenerla con isoflurano (1-1,5%) in una miscela di protossido di azoto (70% v/v) e ossigeno (30% v/v) per la durata dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Posizionare un animale anestetizzato in postura prona su una coperta di riscaldamento controllo retroazionato e mantenere la temperatura corporea a 37±0.5 ° C per mezzo di una sonda rettale collegata a questa unità di riscaldamento.</li>
	<li>Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.</li>
	<li>Radere la regione chirurgica sul lato sinistro del cranio con i tagliatori elettrici. Utilizzare la soluzione di betadine con un tampone di garza per disinfettare la pelle. Risciacquare questa regione con un tampone sterile contenente etanolo al 70% e ripetere i due passaggi per tre cicli17.</li>
	<li>Per analgesia, iniettare 0,2 mL di bupivacaina 0,5% per via sottocutanea nella regione chirurgia17.</li>
	<li>Fare un'incisione di pelle lunga 1 cm sulla sommità del cranio (che si estende dal canthus laterale dell'occhio di sinistra alla base dell'orecchio sinistro) e sezionare il muscolo di temporalis sinistra per esporre il cranio. Quindi, creare una piccola bava foro 5 mm laterale al e 1 mm posteriore al bregma18 per facilità di posizionamento della punta della sonda Doppler flowmeter matita.</li>
	<li>Girare il ratto dall'incline alla posizione supina e poi mettere la sonda di matita laser nel foro cieco del cranio precedentemente forati per monitorare il flusso sanguigno cerebrale regionale (rCBF).</li>
	<li>Registrare rCBF basale di ogni animale e considerare questo come 100%. In particolare, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) viene avviato ogni volta che una diminuzione nel rCBF di più dell'80% è riconosciuto19,20.</li>
</ol>2. induzione dell'ischemia focale Cerebra
<ol><li>Rasatura della regione del collo e disinfettare la cute con betadine soluzione e 70% di etanolo. Iniettare 0,2 mL di bupivacaina 0,5% per via sottocutanea nel sito di chirurgia per l'analgesia17.</li>
	<li>Fare un'incisione lungo chirurgica di 2 cm nella superficie ventrale del collo per accedere l'arteria carotide comune sinistra (LCCA). Isolare il LCCA dalla fascia confinante e il nervo vago per accedere la biforcazione dell'arteria carotica esterna (ECA) e l'arteria carotica interna (AIC).</li>
	<li>Lega i permanentemente LCCA o ECA che impiegano una sutura seta 5 / 0 e sezionare ICA gratis al livello dell'arteria pterygopalatine.</li>
	<li>Posto senza stringere un legame del 5-0 suturare di seta intorno LCCA, e quindi temporaneamente ICA morsetto con un micro-clip vascolare.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione sulla LCCA prima la cravatta allentata precedentemente posizionata e quindi inserire una sutura in nylon rivestito di silicone 4-0 nello spazio luminal di ICA e serrare la sutura intorno LCCA per proteggere la sutura in nylon e per impedire la fuoriuscita di sangue.</li>
	<li>Rimuovere la micro-clip vascolare dall'ICA. Quindi, è possibile avanzare un filamento di intraluminal rivestito di silicone fino a osservando un profondo declino nel rCBF che indica l'occlusione dell'origine MCA. Alla fine del periodo ischemico (90 min), avviare riperfusione ritirando la sutura intraluminal21.</li>
</ol>3. della vena giugulare ed Evans Blue (EB) iniezione
<ol><li>Fare un'incisione longitudinale di 1 cm nel collo sul lato sinistro della linea mediana e quindi senza mezzi termini sezionare via fascia superficiale per accedere il ramo esterno della vena giugulare di sinistra (LGV). Quindi, definitivamente legare fine cranica del LGV con sutura seta 5-0. Posto senza bloccare due legami intorno alla vena e quindi bloccare temporaneamente fine cardiaca del LGV con un micro-clamp vascolari.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione sulla LGV fra due punti di sutura e quindi inserire catetere eparinizzato siero riempito lo spazio luminal di LGV e avanzare di circa 10 mm. in seguito, stringere le legature intorno alla vena per fissare il catetere e prevenire le emorragie. Iniettare piccole quantità di siero per evitare la compressione della vena.</li>
	<li>All'inizio del periodo di riperfusione, iniettare lentamente tintura EB (1 mL/kg di soluzione EB 2% in soluzione salina) per un periodo di 5 min. Successivamente, lavare la cannula, iniezione di 0,5 mL di salino normale e ritirare la cannula di iniezione da vena12,22.</li>
	<li>Infine, suturare le incisioni del collo e della testa e iniettare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via intraperitoneale (IP) e ripetere l'iniezione ogni 6-8 h durante il periodo di riperfusione per l'analgesia post-operatoria17.</li>
	<li>Iniettare 5 mL di saline(IP) pre-riscaldato per fornire idratazione a gabbia recupero17.</li>
	<li>Posto l'animale in una gabbia speciale recupero equipaggiato con controllo di temperatura e aria condizionata e monitorare il recupero dell'animale dall'anestesia.</li>
</ol>4. valutazione della permeabilità della barriera sangue del cervello
<ol><li>Dopo 24 h di riperfusione, profondamente anestetizzare l'animale con sodio thiopental. Quindi, aprire la cavità toracica praticando un piccolo foro sotto lo sterno.</li>
	<li>Fare una piccola apertura nell'atrio di destra e iniettare 250 mL di soluzione fisiologica 0,9% pre-riscaldata (37 ° c) ad una pressione di 110 mmHg attraverso il ventricolo sinistro per 15 min lavare EB lontano la circolazione fino a quando le uscite di saline normale dall'atrio diventa incolore23.</li>
	<li>Immediatamente rimuovere il cervello dal cranio e posizionarlo nella matrice del cervello. Sezionare il bulbo olfattivo e del cervelletto, e quindi utilizzando una lama di rasoio pulita, separare l'emisfero destro del cervello da sinistra (Lesioned) lungo la linea mediana.</li>
	<li>Pesare ogni emisfero omogeneizzarle separatamente in 2,5 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato e questo mix con 2,5 mL di acido tricloroacetico (60%) per 2 min, utilizzando una macchina di vortice.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di cervello a 1.322 x g per 30 minuti e consentire ai campioni di raffreddare in frigorifero 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Utilizzare i surnatanti di stimare l'assorbanza di EB da uno spettrofotometro a 610 nm23.</li>
	<li>Calcolare le concentrazioni di EB contro una curva standard e risultati rapidi come µ g/g del tessuto cerebrale.</li>
</ol>5. produzione della curva Standard EB
<ol><li>Preparare 10 esempi di soluzioni di EB con concentrazioni di 1-10 µ g di EB in 5 mL di tampone fosfato salino.</li>
	<li>Misurare i valori di assorbanza di ciascun campione a 610 nm utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Fare un grafico a dispersione utilizzando un foglio di calcolo e le concentrazioni di EB presenti sull'asse X e i valori di assorbanza sull'asse Y (Figura 1).</li>
	<li>Definire una linea di tendenza lineare della curva con la sua equazione. Quindi, di utilizzarlo per ottenere la concentrazione di EB di campioni.</li>
	<li>Segnalare i risultati finali di stravaso EB come µ g/g del peso del tessuto cerebrale.</li>
</ol>6. operazione finta
<ol><li>Eseguire lo stesso processo chirurgico con i ratti nel gruppo sham-operated (compresi facendo un'incisione nella regione del collo e iniezione di EB) ma escludere il MCAO.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Finora, vari metodi come l'autoradiografia e rilevamento dei traccianti radioattivi24,25, microscopia di immunofluorescenza26,27ed EB stravaso tecnica20, 23 sono stati usati per valutare il danno della barriera emato - encefalica. Tintura EB è fortemente in grado di legarsi all'albumina del siero e viene utilizzata come tracciante per la rilevazi...

L'edema vasogenic cervello dovuto rottura della barriera emato - encefalica (BBB) rimane una complicazione importante dell'ictus ischemico e un elemento determinante del tasso di sopravvivenza in pazienti ictus1,2. L'emato - encefalica (BBB), che è formata da cellule endoteliali dei capillari del cervello (BCECs) e composto da componenti distinti neurovascular (ad es., giunzioni strette tra BCECs, periciti, astroglial e cellule neuronali3), fornisce un specializzata e dinamica interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione del sangue periferico4,5. Insulti come lesioni di ischemia-riperfusione potrebbero compromettere l'integrità funzionale della BBB e portare alla successiva penetrazione di leucociti circolanti nel parenchima del cervello che attivano in definitiva l'infiammazione cerebrale e lesioni cerebrali primari 6 , 7. modelli animali sono necessari per l'esatta individuazione della disfunzione di BBB seguendo l'occorrenza di un oggetto stroke. Tali modelli sono di grande importanza per lo studio di base dei meccanismi fisiopatologici e introducendo nuove strategie neuroprotettive. In vitro modelli cellulari basati sulla cultura della BBB sono stati altamente sviluppati e utilizzati per lo studio molecolare del BBB fisiopatologia8,9,10. Tuttavia, in vivo modelli animali, che producono un danno ischemico della BBB simili a condizioni cliniche umane, sono anche molto utili a questo proposito. La determinazione quantitativa dello stravaso di blu di Evans (EB) è una tecnica ben accettata e sensibile che è stata utilizzata per la valutazione dell'integrità BBB e funzione nelle malattie neurodegenerative, tra cui ictus ischemico11, 12 , 13 , 14. questo metodo è conveniente, fattibile, riproducibile e completamente applicabile in qualsiasi laboratorio sperimentale. Sua attuazione non richiede attrezzature avanzate, come traccianti radioattivi15 o risonanza magnetica (MRI)16, che sono prerequisiti per altri metodi. In questo articolo, dimostriamo completamente base processi tecnici di valutazione BBB utilizzando lo stravaso EB nei modelli del ratto del colpo ischemico.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>AWN 34041100</td><td>20 - 25 gradi C</td></tr><tr><td>2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro (TTC)</td><td>Molekula</td><td>31216368</td><td>4 anni</td></tr><tr><td>Sprague&ndash; Topi Dawley&nbsp;</td><td>Pasture Institute (Teheran, Iran)</td><td></td><td>300-350g</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>76-03-9</td><td>2 anni</td></tr><tr><td>Bupivacaine HCl (0,5%)</td><td>Delpharm Tours</td><td></td><td>sotto&nbsp; 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Bupernorfina</td><td>Exir (Iran)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Di- Sodio idrogeno fosfato</td><td>EMD Milliporo&nbsp;</td><td>231-448-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>silicone (Xantopren)</td><td>Heraeus</td><td>EN ISO 4823</td><td></td></tr><tr><td>Attivatore universale plus</td><td>Heraeus</td><td>66037445</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per micro-dissezione</td><td>Stoelting</td><td>52100-41</td><td></td></tr><tr><td>Forbice a molla</td><td>Stoelting</td><td>52130-00</td><td></td></tr><tr><td>Operativo&nbsp; Forbici</td><td>Roboz</td><td>52140-70</td><td></td></tr><tr><td>Matrice cerebrale&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51390</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia per piccoli animali |</td><td>&nbsp; Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema da laboratorio di potenza</td><td>AD Instruments</td><td>ML880</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di portata laser Doppler</td><td>AD Instruments</td><td>ML191</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di feedback riscaldante</td><td>Harvard Appratus</td><td>72-7560</td><td></td></tr><tr><td>Micro morsetto vascolare</td><td>FineScience Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Filo di sutura Silk 5-0</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>Filo di sutura Ethilon 4-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>EH6740G</td><td></td></tr></tbody></table>

una valutazione in vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ictus ischemico conduce a edema cerebrale di vasogenic e successive cranico primario, che è mediata attraverso la distruzione della barriera sangue - cervello (BBB). Ratti con il colpo ischemico indotto sono stati stabiliti e usati come modelli in vivo per studiare l'integrità funzionale della BBB. Rilevazione spettrofotometrica di blu di Evans (EB) nei campioni di cervello con lesione ischemica potrebbe fornire giustificazione affidabile per la ricerca e lo sviluppo delle modalità terapeutiche novelle. Questo metodo genera risultati riproducibili ed è applicabile in qualsiasi laboratorio senza necessità di attrezzature speciali. Qui, presentiamo una guida di riferimento tecnico e visualizzato sulla rilevazione di stravaso di EB dopo induzione del colpo ischemico in ratti.

Non c'era differenza significativa nei livelli EB nell'emisfero destro rispetto all'emisfero sinistro dei ratti falsità-azionati (1,06 ± 0.1 µ g/g e 1,1 ± 0.09 µ g/g, rispettivamente). Come mostrato nelle figure 2A-2B, induzione di ischemia transitoria (90 min di ischemia / riperfusione 24 h) ha causato una differenza significativa nei livelli di EB (10,41 ± 0.84 µ g/g, p &lt; 0,001) nell'emisfero sinistro di ratti ischemici, rispetto al rispettivo emisfero nei r...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una tecnica altamente riproducibile per la valutazione in vivo della perturbazione barriera emato - encefalica nei modelli del ratto del colpo ischemico.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare un metodo altamente riproducibile di una valutazione in vivo della rottura della barriera emato-encefalica in un modello di reazione di ictus ischemico. Ciò si ottiene mediante l'induzione dell'ictus ischemico utilizzando il filamento intraluminale per l'occlusione dell'arteria cerebrale media nella parte sinistra del cervello. Il passo successivo della procedura è l'incannulamento del ramo esterno della vena giugulare e l'iniezione del colorante Evans Blue alla fine dell'occlusione dell'arteria cerebrale media e all'inizio del periodo di riperfusione.Ventiquattro ore dopo, in anestesia profonda, il sistema circolatorio dell'animale viene lavato via dal blu di Evans e il cervello viene rimosso. Quindi due emisferi cerebrali vengono separati, omogeneizzati e centrifugati, e infine i surnatanti dei tessuti vengono utilizzati per misurare la concentrazione di blu di Evans con uno spettrofotometro. Anestesia e flussimetria.Indurre l'anestesia con isoflurano al 4% e mantenerla con isoflurano all'1-1,5% in una miscela di protossido di azoto al 70% e ossigeno al 13% per tutta la durata dell'intervento. Posizionare l'animale a

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Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Questo video mostra la valutazione della zona dell'infarto e dell'edema cerebrale in fette di cervello di ratti sottoposti a occlusione dell'arteria cerebrale media. Le aree infartuate vengono identificate utilizzando la colorazione redox, mentre un filtro blu e una funzione di soglia nel software di analisi delle immagini quantificano la zona dell'infarto e l'edema nell'emisfero interessato.

Misurazione della zona dell'infarto e dell'edema cerebrale in un cervello di ratto dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media

Fonte: Kuts, R. et al. Lesione cerebrale indotta dal laser nella corteccia motoria dei ratti. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra la valutazione dell'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) a seguito di una lesione cerebrale indotta dal laser nei ratti. Un colorante tracciante viene iniettato nella vena della coda, permettendogli di circolare nel cervello e di fuoriuscire nel tessuto attraverso la BBB danneggiata. Il cervello viene quindi estratto e lavorato per rilasciare il...

Valutazione dell'integrità della barriera emato-encefalica in un modello di ratto con lesione cerebrale indotta dal laser 

Emato-encefalica perturbazione barriera favorisce l'erogazione di alcuni farmaci al cervello. Mannitolo consegnato intra-arteriosa cellule restringe i vasi sanguigni circostanti, al fine di distruggere fisicamente la barriera.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Questo protocollo descrive il precondizionamento ipossico ripetitivo, o brevi esposizioni all'ipossia sistemica che riducono i volumi di infarto e l'interruzione della barriera emato-encefalica a seguito di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei topi. Descrive inoltre la doppia quantificazione del volume dell'infarto e dell'interruzione della barriera emato-encefalica dopo l'ictus per valutare l'efficacia della protezione neurovascolare.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue - cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.

Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L'uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.

Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori

È stato sviluppato un metodo per visualizzare lo stravaso di colorante dovuto alla rottura della barriera emato-encefalica (BEE) somministrando due coloranti fluorescenti ai topi in momenti diversi. L'uso del glicerolo come crioprotettore ha facilitato l'immunoistochimica sullo stesso campione.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

I modelli in vivo di ratto sono strumenti indispensabili per studiare i meccanismi patologici e i bersagli terapeutici per l'ictus ischemico. Questo lavoro descriverà l'esecuzione della colorazione in immunofluorescenza in fette di cervello infartuate dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei ratti.

Valutazione della segnalazione della morte cellulare mediante immunofluorescenza in un modello di ictus ischemico di ratto

Scopri una tecnica riproducibile per valutare la rottura della barriera emato-encefalica in modelli di ratto con ictus ischemico, utilizzando l'occlusione intraluminale e il metodo del blu di Evans.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

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