Name: Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Impara a ricostruire un modello tridimensionale di gengiva infiammata umana in vitro utilizzando cheratinociti HaCaT, fibroblasti gengivali e macrofagi THP-1. Questo metodo avanzato permette di studiare la guarigione delle ferite, la rigenerazione tissutale e lo screening di potenziali farmaci per le malattie parodontali.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) sovvenzione per la ricerca scientifica (26861689 e 17 K 11813). Gli autori vorrei ringraziare Mr. Nathaniel Green per la correzione di bozze.

Questo protocollo è progettato per creare equivalenti di tessuto gengivale umano, ferita gengivale modelli e modelli di gengivite. Pelle umana cheratinociti (HaCaT) sono state gentilmente concesse da professore Norbert E. Fusenig di Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Germania)7. Fibroblasti gengivali umani (HGFs) sono stati isolati dai tessuti gengivali secondo i protocolli precedentemente pubblicati8. Il consenso informato è stato ottenuto in anticipo, e lo studio è stato approvato secondo le linee guida fissano dal comitato etico, la Nippon Dental University School of Life Dentistry presso Tokyo (numero di autorizzazione: NDU-T2012-35). Procedura di protocollo 1 – 3 deve essere eseguita in una cappa di cultura cellulare.
1. preparazione del tessuto umano 3D equivalenti di gengiva (GTE) (Figura 1A)
<ol><li>Mix del collagene tipo I-A gel con 10% concentrato MEM-alfa e buffer di ricostruzione di 10% (2,2 g di NaHCO3 e 4,47 HEPES in 100 mL di 0.05 N NaOH) in una provetta sterile da 15 mL di pipettaggio. Mantenere la soluzione mista collagene su ghiaccio fino a quando non utilizzato.</li>
	<li>Inserire inserti cultura 24 pozzetti (poro dimensione 3.0 µm) in una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>
Rimuovere HGFs dalla superficie di cultura utilizzando 0,25% soluzione di tripsina-EDTA. Sospendere le cellule in 10 mL di medium di coltura A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contare le celle di un contatore di cellule Bürker-Türk.
	<ol>
<li>Estrarre la quantità desiderata di celle (1-5 x105 cellule/mL), quindi centrifugare per 4 min a 190 x g.</li>
		<li>Sospendere le cellule nella soluzione mista del collagene. Mantenere la miscela su ghiaccio fino al passaggio successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL della miscela delle cellule-collagene (0,5-2,5 x 105 cellule/pozzetto) nell'inserto cultura senza produrre eventuali bolle. Incubare la miscela per 10-30 min in atmosfera umidificata con 5% CO2 a 37 ° C per far coagulare la miscela in un gel. Nota: Aggiungere il composto di collagene al centro dell'inserto cultura per evitare disparità formazione di gel di collagene.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura nel pozzo e 0,5 mL nell'inserto. Incubare la piastra di coltura per 24 ore o durante la notte in atmosfera umidificata con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere le cellule HaCaT dalla superficie di cultura utilizzando 0,25% soluzione di tripsina-EDTA. Sospendere le cellule in 10 mL di medium B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) e contare le celle. Estratto la quantità necessaria di celle (1 – 5 x 105 cellule/mL) con una pipetta, centrifugare per 4 min x 190 g. sospendere le cellule in media B.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dagli inserti di cultura, che contengono la miscela di HGF-collagene, dall'aspirazione. Aggiungere 0,5 mL della sospensione di cellule HaCaT (0,5-2,5 x 105 cellule/pozzetto) nella parte superiore la miscela di HGF-collagene. Incubare le colture per 24 ore o durante la notte. Nota: A questo punto del tempo, il mezzo nella cultura ben dovrebbe essere A medio, mentre il mezzo nell'inserto cultura dovrebbe essere medio B.</li>
	<li>Sostituire il terreno di coltura con il mezzo di KSR (co-coltura) (MEM-alfa + 15% sostituzione di KnockOut del siero + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura nella cultura ben e 0,5 mL nell'inserto cultura. Incubare le colture per 24 – 48 h.</li>
	<li>Sostituire il terreno di coltura con KSR medium + 1% FBS. Aggiungere 1 mL nella cultura ben e 0,5 mL nell'inserto cultura. Incubare le colture per 24 ore o durante la notte.</li>
	<li>Sostituire il terreno di coltura nella cultura bene con 0,7 – 1 mL di terreno di KSR. Rimuovere completamente il mezzo dall'inserto di cultura (la superficie di cultura dovrebbe essere esposto all'aria). Incubare le colture per 1 – 2 settimane. Modificare il mezzo nella cultura ben due volte alla settimana. Nota: Non lasciare che l'innalzamento del livello medio sopra la superficie di cultura (lo strato superiore è composto da cheratinociti). Tenere sempre asciutta la superficie di cultura.</li>
</ol>2. preparazione del GTE feriti (Figura 1B)
<ol><li>Preparare un perforatore di tessuto del diametro 1 – 3 mm. Sterilizzare con autoclave a 121 ° C per 20 min.</li>
	<li>Spingere il puncher tessuto perpendicolarmente in GTE circa 300 µm profonda e fare un buco nel tessuto per simulare una ferita.</li>
	<li>A questo punto, è possibile utilizzare il GTE feriti per indagare la rigenerazione di tessuto e di guarigione della ferita. In alternativa, Difficoltà GTE utilizzando soluzione tampone neutro di formalina al 10% per eseguire l'analisi istologica.</li>
</ol>3. preparazione del GTE infiammatorie (iGTE) (Figura 1B)
<ol><li>Coltivare le cellule THP-1 secondo la precedente relazione9.</li>
	<li>Mix del collagene tipo I-A gel con 10% concentrato RPMI 1640, buffer di ricostruzione del 10% (2,2 g di NaHCO3 e 4,47 HEPES in 100 mL di 0.05 N NaOH) e 10 ng/mL PMA. Mantenere la soluzione mista collagene su ghiaccio fino all'utilizzo.</li>
	<li>Conteggio 1 – 2 x 106 THP-1 cellule e centrifugare per 4 min x 190 g. sospendere le cellule in 1 mL della soluzione mista di collagene. Mantenere la miscela su ghiaccio fino al passaggio successivo.</li>
	<li>Aggiungere 10 – 30 µ l THP-1-collagene miscela nell'area ferito del GTE. Sostituire il terreno di coltura a 0,7 – 1 mL di terreno di KSR contenente 10 ng/mL di PMA.</li>
	<li>Incubare la miscela in atmosfera umidificata con 5% CO2 a 37 ° C per 72 h.</li>
	<li>Utilizzare il modello per lo studio di gengivite o parodontite (ad esempio, aggiungere potenziale farmaco antinfiammatorio a iGTE per vedere i suoi effetti sul rilascio di citochina10). In alternativa, omettere 72h PMA-trattamento, aggiungere 2 µ g/mL di LPS nella cultura e incubare il tessuto in atmosfera umidificata con 5% CO2 a 37 ° C per 48 h11,12.</li>
</ol>4. fissazione e Immunostaining di montare tutta del GTE e iGTE culture
<ol><li>
Fissazione delle culture.
	<ol>
<li>Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 24 pozzetti. Lavare i tessuti 2 volte con tamponato fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di tampone neutro di formalina al 10% per l'inserto e 1 mL alla cultura bene. Lasciare la piastra a 24 pozzetti in frigorifero a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di tampone neutro di formalina 10% il giorno seguente.</li>
		<li>Per l'intero Monte immunocolorazione, lavare i tessuti 3 - 4 volte con PBS dopo la fissazione.</li>
		<li>Per ematossilina ed eosina (H & E) e immunostaining regolari, procedere con disidratazione, inclusione in paraffina e sezionamento. Nota: Per l'intero Monte immunocolorazione, questo passaggio può essere omesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tutta Monte immunostaining Nota: Questo protocollo è stato modificato da quella di riferimento 13.<ol>
<li>Lavare i tessuti 3 x in PBS 0.5 – 1% Triton, 10 – 30 min ogni volta.</li>
		<li>Incubare i tessuti due volte per 30 min in tampone bloccante (PBS 1% Triton + 10% BSA), a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare i tessuti 2 × in tampone bloccante, 5 – 10 minuti ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo primario alla diluizione/concentrazione necessaria agli inserti. Utilizzare una sottile pellicola di plastica per avvolgere gli inserti per evitare disidratazione del tessuto.</li>
		<li>Incubare il tessuto per 1 o 2 giorni a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare i tessuti 3 volte, per 30 min in PBS 1% Triton + 10% BSA. Lavare nuovamente 3 volte, per 5 min in PBS 1% Triton.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di anticorpo secondario in tampone bloccante (PBS 1% Triton + 10% BSA) e 5 µ l di soluzione di Hoechst 33342 (macchia di NucBlue Live Cell) per ogni inserimento. Utilizzare una sottile pellicola di plastica per avvolgere gli inserti per evitare disidratazione del tessuto.</li>
		<li>Incubare per 1-2 giorni a 4 ° C. Avvolgere la piastra a 24 pozzetti in un tovagliolo di carta bagnato e poi metterlo in un pacchetto di plastica da utilizzare durante l'incubazione.</li>
		<li>Lavare i tessuti 3 volte, per 10 min in triton 1% PBS</li>
		<li>Usare un ago affilato per tagliare la membrana dell'inserto cultura per ottenere il tessuto. Posizionare la membrana in una diapositiva. Nota: Il tessuto dovrebbe essere sulla membrana.</li>
		<li>Aggiungere 2 – 3 gocce di mezzo di montaggio di fluorescenza. Coprire il tessuto con una copertura in vetro e conservare a 4 ° C al buio fino all'analisi.</li>
		<li>Mostra tessuti con un laser confocale microscopia (LSM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
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<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Questo protocollo è basato su metodi di creazione di tessuto gengivale equivalenti ed equivalenti di tessuto adiposo sottocutanei descritti da precedenti rapporti8,21,22. Anche se si tratta di un metodo semplice e facile, alcuni passaggi richiedono particolare attenzione. Ad esempio, la miscela di collagene dovrebbe essere tenuta su ghiaccio fino all'utilizzo per evitare la formazione di un gel nella soluzione. Quando si aggiung...

Le malattie parodontali sono la principale causa di perdita dei denti negli adulti. Gengivite e parodontite sono le più comuni malattie parodontali. Entrambi presenti alterazioni infiammatorie acute o croniche biofilm-mediata nella gengiva. Gengivite è caratterizzata da infiammazione acuta, considerando che la parodontite si presenta solitamente come l'infiammazione cronica. A livello istologico, componenti batteriche innescano l'attivazione di cellule immunitarie, come i macrofagi, linfociti, plasmacellule e mastociti1,2. Queste cellule immuni, soprattutto macrofagi, interagiscono con le cellule locali (tra cui cellule epiteliali gingival, fibroblasti, cellule endoteliali e osteoblasti) con conseguente lesioni infiammatorie nel tessuto peridentale3,4. Modelli sperimentali di malattie parodontali sono state stabilite in vari tipi di animali, come ratti, criceti, conigli, furetti, canini e primati. Tuttavia, la fisiopatologia dei modelli animali è diversa da quella degli esseri umani, rendendo difficile per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari e valutare nuovi farmaci di malattie parodontali5. Co-coltura di batteri parodontali e cellule epiteliali orali umane monostrato è stato utilizzato per studiare il meccanismo di infezioni parodontali6. Tuttavia, colture monostrato di cellule orali mancano l'architettura cellulare di tridimensionale (3D) di tessuto intatto; Pertanto, essi non può simulare la situazione in vitro .
Qui, gli equivalenti 3D infiammatoria del tessuto umano della gengiva (iGTE) sono istituiti per rappresentare malattie parodontali in vitro. Questo modello 3D delle malattie parodontali occupa una posizione intermedia tra colture delle cellule dello strato monomolecolare e modelli animali. Tre tipi di cellule umane, incluse HaCaT cheratinociti e fibroblasti gengivali macrofagi THP-1, sono co-coltivati su gel di collagene e stimolati dagli iniziatori infiammatori di costruire iGTE. IGTE simula molto attentamente le condizioni in vivo del differenziamento cellulare, l'interazione cellula-cellula e l'attivazione del macrofago nel gingiva. Questo modello ha molte possibili applicazioni per droga di screening e test di nuovi approcci farmacologici in malattie parodontali, nonché per l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari nella guarigione della ferita, infiammazione e rigenerazione dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>Collagene tipo I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>Per la produzione di derma di GTE</td></tr><tr><td>MEM-alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Inserto per colture cellulari medie</td></tr><tr><td>(per piastra a 24 pozzetti), dimensione dei pori 3,0 &; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Per la coltura dei tessuti</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Perforatore per tessuti</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Per fori di punzonatura in GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (colorazione NucBlue Live Cell)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Per la marcatura di nuclei</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio a fluorescenza</td><td>Dako</td><td></td><td>Per il montaggio di campioni dopo l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-citocheratina 8+18 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Per l'identificazione dell'epitelio</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Per l'osservazione della superficie, della topografia e della composizione dei campioni</td></tr>, <tr><td>Microscopia confocale a scansione laser</td><td>LSM 700; Fornitore verificato - Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Per l'osservazione della colorazione in immunofluorescenza dei campioni Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-citocheratina 19 abcam</td><td>ab52625</td><td>Per l'identificazione dell'epitelio</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Per l'identificazione di fibroblasti e macrofagi attivati</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Per l'identificazione di fibroblasti nel derma</td></tr><tr><td>Anti-CD68 anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Per l'identificazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Anticorpo CD14 umano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Per l'identificazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-coniugato anticorpo secondario di capra anti-coniglio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Per la colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo secondario di capra anti-topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Per la colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Per osservare l'immunofluorescenza del campione, colorare le</td></tr><tr><td>cellule THP-1</td> Banca <td>di cellule Riken BRC</td><td>RCB1189</td><td>Per produrre iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-miristate 13-acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Per differenziare le cellule THP-1</td></tr></tbody></table>

equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del gingiva

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Le malattie parodontali (come gengivite e parodontite) sono le principali cause di perdita dei denti negli adulti. L'infiammazione nella gengiva è fondamentale fisiopatologia delle malattie parodontali. Attuali modelli sperimentali di malattie parodontali sono stati stabiliti in vari tipi di animali. Tuttavia, la fisiopatologia dei modelli animali è diversa da quella degli esseri umani, rendendo difficile per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari e valutare nuovi farmaci per malattie parodontali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostruzione di equivalenti di tessuto infiammatorio umano della gengiva (iGTE) in vitro. Costruiamo prima equivalenti di tessuto umano della gengiva (GTE) utilizzando due tipi di cellule umane, tra cui fibroblasti gengivali umani (HGF) e cheratinociti epidermici della pelle umana (HaCaT), in condizioni tridimensionali. Creiamo un modello di ferita utilizzando un perforatore di tessuto per fare un buco nel GTE. Prossimi, umani monociti THP-1 mescolati con gel di collagene sono iniettati nel foro il GTE. Da adimistration di 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) per 72 h, cellule THP-1 differenziano nei macrofagi di focolai infiammatori forma in GTE (iGTE) (IGTE inoltre può essere stumilated con 2 µ g/mL di lipopolisaccaridi (LPS) per 48 h avviare l'infiammazione ). IGTE è il primo modello in vitro di gengiva infiammatoria utilizzando cellule umane con un'architettura tridimensionale. IGTE riflette le modifiche patologiche principali (activition immunociti, interazioni intracellulari tra fibryoblasts, cellule epiteliali, monociti e macrofagi) a malattie parodontali. GTE, GTE feriti e iGTE utilizzabile come versatile di strumenti per studiare la guarigione della ferita, rigenerazione tissutale, infiammazione, interazione cellula-cellula e potenziali farmaci schermo per malattie parodontali.

Le cellule HaCaT visualizzato morfologia tipica del keratinocyte sotto osservazione al microscopio di contrasto di fase (Figura 2A). Immagini di scanner elettrone microscopiche (SEM) ha mostrato che le superfici delle cellule HaCaT erano coperti da molti microvilli. Intercellulare connessioni tra le cellule HaCaT sono state mediate da processi a membrana (Figura 2B). Le cellule HaCaT espresso epitelio gingival marcatore K8/18<sup...

L'obiettivo del protocollo è quello di costruire un modello di infiammatorio gengiva umana in vitro. Questo modello di tessuto Co-coltiva tre tipi di cellule umane, keratinocytes di HaCaT, fibroblasti gengivali e macrofagi THP-1, in condizioni tridimensionali. Questo modello può essere applicato a indagare le malattie parodontali, quali gengivite e parodontite.

Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di ricostruire un modello 3D di tessuto gengivale infiammatorio utilizzando tre tipi di cellule umane in vitro. Questo metodo può aiutare a studiare la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, l'infiammazione e lo screening di potenziali farmaci per le malattie parodontali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo è il primo metodo per costruire un modello in vitro di gengiva infiammatoria utilizzando cellule umane con un'architettura tridimensionale.In una provetta sterile da 15 millilitri, aggiungere il collagene di tipo I-A, il 10% di MEM-alfa concentrato e il 10% di tampone di ricostruzione. Quindi, lasciare la miscela di collagene in ghiaccio fino al prossimo utilizzo. Quindi, posizionare gli inserti di coltura a 24 pozzetti con pori di tre micrometri in una piastra di coltura a 24 pozzetti.Quindi, utilizzare una soluzione di tripsina-EDTA al 25% per staccare gli HGF dal pallone di coltura. Quindi, sospendere le cellule staccate in 10 millilitri di terreno di coltura. Quindi, contare il numero di celle utilizzando un contatore di celle Burker-Turk.Dopo aver isolato il numero di cellule desiderato, centrifugare le cellule a 190 volte g per quattro minuti. Quindi, sospendere il pellet cellulare con la soluzione di collagene e lasciare il tubo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 5 millilitri di miscela di cellule e collagene nell'inserto di coltura senza produrre bolle d'aria.Quindi, incubare l'inserto di coltura con la miscela di cellule e collagene a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 10-30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di terreno di coltura nel pozzetto e 5 millilitri di terreno nell'inserto. Quindi, incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un giorno.Quindi, utilizzare il 25% della soluzione di tripsina-EDTA per staccare le cellule HaCaT dalla piastra di coltura. Una volta staccate le cellule, aggiungere 10 millilitri di terreno B alle cellule. Quindi, conta il numero di cella.Dopo aver isolato il numero di cellule desiderato, centrifugare le cellule a 190 volte g per quattro minuti. Dopo la centrifugazione, sciogliere il pellet cellulare nel terreno B.Quindi, aspirare il terreno dall'inserto di coltura. Quindi, aggiungere 5 millilitri di sospensione cellulare HaCaT sulla miscela di HGF e collagene.Lasciare l'inserto di coltura nell'incubatrice per un giorno. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura. Aggiungere un millilitro di terreno KSR di co-coltura integrato con il 5% di siero fetale bovino nel pozzetto di coltura e 5 millilitri nel foglietto illustrativo.Quindi, incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con un terreno KSR di co-coltura integrato con siero bovino fetale all'1%. Rimuovere l'intero terreno di coltura sia dall'inserto di coltura che dal pozzetto di coltura dopo 24 ore.Quindi, aggiungere da 7 a un millilitro fresco di terreno KSR solo nel pozzetto di coltura e continuare la coltura per due settimane. Ricordati di cambiare bene il mezzo nella coltura due volte alla settimana. Preparare un perforatore per tessuti da uno a tre millimetri di diametro e sterilizzare il perforatore nell'autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti.Dopo la sterilizzazione, spingere il perforatore di tessuti perpendicolarmente in GTE per circa 30 micrometri di profondità per creare una ferita nel tessuto. Quindi, mescolare 10 nanogrammi per millilitro di PMA, il 10% di tampone di ricostruzione e il 10% di terreno RPMI concentrato con il gel di collagene di tipo I-A. Quindi, lasciare la miscela di collagene in ghiaccio fino al prossimo utilizzo.Quindi, centrifugare le celle THP-1 a 190 volte g per quattro minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet cellulare in un millilitro di soluzione di collagene e lasciarlo in ghiaccio. Quindi, aggiungere da 10 a 30 microlitri della miscela di cellule e collagene THP-1 nell'area ferita del GTE.Successivamente, sostituire il terreno di coltura con un terreno KSR da 7 a un millilitro contenente 10 nanogrammi per millilitro di PMA. Quindi, incubare la miscela a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Per caratterizzare il GTE ricostruito, vengono eseguite la colorazione H ed E e la microscopia elettronica a scansione.Le immagini mostrano la GTE che mostra una struttura tissutale simile alla gengiva con più strati di epitelio e lamina propria. Le immagini mostrano anche che le cellule HGF nei GTE ricostruiti presentano caratteristiche morfologiche distinte dei fibroblasti circondati da fibre di collagene. Quindi, viene eseguita la colorazione in immunofluorescenza per studiare l'espressione dei marcatori dermici ed epiteliali.Questo per convalidare se GTE e iGTE hanno le caratteristiche molecolari della gengiva umana realmente infiammatoria. Le immagini mostrano che la vimentina e il TE-7 sono fortemente presenti nella lamina propria del GTE. K19, un marcatore specifico dell'epitelio giunzionale nella parodontite, sebbene debolmente espresso nell'epitelio GTE, è abbastanza forte nell'epitelio iGTE.Infine, al fine di generare i focolai infiammatori in iGTE, i monociti THP-1 trattati con PMA vengono iniettati nell'area ferita del tessuto. A 72 ore dal trattamento con PMA, le cellule THP-1 si differenziano in cellule simili ai macrofagi. L'immunocolorazione a montatura intera ha confermato che queste cellule esprimono due importanti marcatori macrofagici, CD14 e vimentina, e hanno formato i focolai infiammatori.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro settimane se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare la contaminazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'uso di LPS per stimolare le risposte infiammatorie, al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come indurre l'infiammazione attraverso le interazioni ospite-biofilm.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'infiammazione, della rigenerazione dei tessuti e della guarigione delle ferite per esplorare il meccanismo cellulare e molecolare e selezionare potenziali farmaci per le malattie parodontali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un modello 3D di tessuto gengivale infiammatorio in vitro.

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JoVE Journal

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Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva

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