L'assorbimento del metallo essenziale nei batteri gram-negativi: fluorescenza, radioisotopi, a raggi x e delle cellule di frazionamento

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di estrarre il contenuto periplasmatico batterico mediante frazionamento cellulare per la caratterizzazione biofisica, compresa la fluorescenza a raggi X, la cristallografia a raggi X e l'assorbimento radio-metallico. Questo metodo può aiutarci a comprendere le relazioni biologiche chiave, comprese le relazioni struttura-funzione dei sistemi di trasporto ABC e il modo in cui riconoscono i loro substrati, in particolare, e li trasportano nella cellula attraverso il doppio strato lipidico. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di valutare separatamente il contenuto cellulare e di estrarre la proteina dal suo ambiente nativo con una contaminazione incrociata minima.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo mentre cercavamo di rimuovere il substrato di YfeA, rendendoci conto, invece di utilizzare un approccio artificiale, che potevamo usare la cellula per produrre la proteina apo. Oltre a fornire informazioni sul legame e il trasporto del substrato attraverso i compartimenti cellulari batterici, metodi come questo test del radiotracciante si applicano ai sistemi eucariotici, che dispongono anche di robuste tecniche di frazionamento. In primo luogo, scongelare una ri-sospensione di sottocoltura batterica precedentemente preparata a quattro gradi Celsius.

Quindi, pellettare le celle scongelate a 4.000 volte la gravità per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Successivamente, risospendere le cellule in 50 millilitri di tampone ghiacciato ad alto contenuto di sale aspirando con una pipetta automatizzata e un puntale da 25 millilitri. Incubare la sospensione su ghiaccio per 20 minuti con inversione occasionale per la miscelazione.

Dopo l'incubazione, pellettare le cellule a 4.500 volte la gravità per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere le cellule in 15 millilitri di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato aspirando con una pipetta automatizzata e un puntale da 25 millilitri. Quindi, incubare la sospensione su ghiaccio per 20 minuti con inversione occasionale per la miscelazione.

Lo shock osmotico rompe la membrana esterna gram-negativa, a seguito di un improvviso calo della concentrazione di sale ambientale. Maneggiare delicatamente le cellule è fondamentale per evitare di provocare un'ulteriore rottura indesiderata della membrana interna, la contaminazione incrociata del citoplasma del periplasma e la destabilizzazione o l'aggregazione delle proteine del periplasma liberate. Successivamente, pellettare gli sferoplasti a 4.500 volte la gravità per 20 minuti a 4 gradi Celsius.

Quindi, recuperare il surnatante contenente il periplasma. Risospendere gli sferoplasti pellettati in soluzione salina tamponata con fosfato aspirandoli con una pipetta automatizzata e un puntale da 25 millilitri. Quindi, lisare le cellule con tre cicli di una pressa a pressione francese a 1.500 psi.

Ora, pellettare i detriti cellulari a 50.000 volte la gravità per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Recuperare il surnatante contenente il citoplasma. Dopo il frazionamento e la purificazione della frazione periplasmatica, mescolare 1,5 microlitri della proteina purificata con PEG 4000, cloruro di sodio, tampone Bis-Tris e sodio azide in una configurazione a goccia seduta o a goccia sospesa aspirando con una pipetta e un puntale da 10 microlitri.

Incubare le gocce di cristallizzazione a 293 Kelvin per due-quattro settimane. Dopo l'incubazione, raccogliere i cristalli e congelarli in una piscina di azoto liquido per la spedizione nel sincrotrone. Per l'analisi della fluorescenza a raggi X, spostare il campione fuori dal raggio e accedere alla scheda Hutch nel software.

Utilizzare il sottotitolo Energia per impostare l'energia a 10 kiloelettronvolt. Quindi, spostare nuovamente il campione nel raggio e accedere alla scheda Scansione. Vai alla scheda Interattivo.

Selezionare Ottimizza segnale di fluorescenza. Inserire quattro secondi sotto il sottotitolo Tempo e selezionare Prendi spettro di fluorescenza. Lo spettro viene tracciato automaticamente per la visualizzazione nella scheda Stampa.

Gli elementi di interesse possono essere selezionati per guidare l'analisi delle regioni energetiche corrispondenti ai loro picchi di emissione. Per l'analisi dell'assorbimento di energia del metallo, spostare il campione fuori dal fascio. Passare alla scheda Scansione, quindi alla scheda Tavola periodica e selezionare il bordo K degli elementi di interesse.

Quindi, vai alla scheda Hutch. Usa il sottotitolo Energia per impostare l'energia sul valore del passaggio precedente in kiloelettronvolt. Spostare il campione nel raggio.

Passare alla scheda Scansione. Passare alla scheda Auto e inserire due secondi sotto il sottotitolo Tempo. A questo punto, selezionare Avvia scansione e visualizzare la scansione MAD utilizzando la scheda Traccia, quindi selezionare la scansione dei bordi per determinare il fronte di assorbimento dell'energia.

Quindi, seleziona Fine con la fluorescenza. Dopo aver preparato la sottocoltura con il tracciante radioattivo, aliquotare un millilitro in singole provette da centrifuga da 1,5 millilitri aspirando con una pipetta e una punta da un millilitro. Metti da parte i tre standard di replica.

Non ne avrai più bisogno fino alla fine dell'esperimento. Posizionare i tubi rimanenti in un ThermoMixer a 37 gradi Celsius e vorticare a una volta la gravità. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 15.000 volte la gravità per 30 secondi utilizzando una centrifuga da banco, preferibilmente raffreddata a 4 gradi Celsius.

Dopo aver scartato i surnatanti, risospendere le cellule in un millilitro di tampone ghiacciato ad alto contenuto di sale aspirando con una pipetta e una punta da un millilitro e porre immediatamente sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in un tampone a basso contenuto di sale ghiacciato aspirando con una pipetta e una punta da un millilitro e incubare su ghiaccio per 20 minuti. Dopo aver pellettato le celle a 15.000 volte la gravità per 30 secondi, raccogliere ciascuno dei surnatanti in nuove provette da centrifuga da 1,5 millilitri.

Misurare la radioattività in ogni frazione e standard. Utilizzare la quantità di radioattività negli standard per determinare la quantità totale di radioattività originariamente aggiunta a ciascun campione. Sono stati raccolti cromatogrammi su gel e gel filtrazione SDS-PAGE per valutare la qualità della purificazione delle proteine dal frazionamento del periplasma preparativo.

Un gradiente di eluizione del liner per la cromatografia a scambio anionico migliora significativamente l'arricchimento di YfeA dall'8% della frazione periplasmatica al 49% del prodotto a scambio anionico. Questa composizione è migliorata al 61% dalla filtrazione su gel e i volumi di eluizione della proteina Apo e della proteina olografica sono identici. L'Apo purificato e l'oloYfeA cristallizzano nelle stesse condizioni di cristallizzazione, sebbene le immagini delle morfologie dei cristalli di Apo e olo-YfeA mostrino differenze nella crescita dei cristalli tra gli stati di Apo e olo-YfeA.

Dato che lo zinco è il substrato primario legato all'YfeA ricombinante, gli spettri di fluorescenza a raggi X possono distinguere tra un campione contenente un forte segnale di zinco commisurato all'oloYfeA che è indicativo di contaminazione incrociata o un segnale di zinco più debole indicativo di apo YfeA e una contaminazione crociata minima. Un'istantanea di 60 minuti del frazionamento dell'assorbimento di metalli radioattivi che confronta le frazioni periplasmatiche e citoplasmatiche di cellule di E.coli che esprimono solo YfeA, l'intero trasportatore YfeABCDE e nessuno dei componenti di YfeABCDE rivela le conseguenze dell'espressione di una singola proteina ricombinante o di un complesso proteico sull'assorbimento dei metalli. Una volta padroneggiato, il compartimento periplasmatico può essere estratto da cellule intere mediante frazionamento.

La proteina ulteriormente purificata mediante cromatografia e la proteina di interesse nella cristallizzazione scende in circa quattro ore e 30 minuti quando le procedure vengono eseguite correttamente. Durante il tentativo di frazionamento e purificazione, è importante mantenere il campione su ghiaccio durante il frazionamento e a 4 gradi Celsius durante la purificazione. Queste condizioni miglioreranno la qualità del frazionamento e la stabilità della proteina purificata.

Seguendo questa procedura possono essere introdotti altri metalli, come il rame o il gallio, per misurare l'inibizione competitiva o i tassi di trasporto di substrati non canonici e per rispondere a ulteriori domande sulla specificità del substrato e sugli amminoacidi funzionali chiave. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come frazionare le cellule di E.coli ed eseguire analisi biofisiche del contenuto di un compartimento cellulare, come il periplasma, senza contaminazione del citoplasma. Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese in considerazione precauzioni, come un'adeguata gestione dei rifiuti e l'uso di una quantità minima di reagenti radioattivi.