Un metodo per definire gli effetti dell'arricchimento ambientale sul Colon Microbiome biodiversità in un modello di tumore del Colon del topo

L'obiettivo principale di questa pubblicazione è quello di presentare un metodo per normalizzare il microbioma dei roditori. In questa dimostrazione, l'effetto dell'arricchimento ambientale sul microbioma viene analizzato durante la genesi del tumore del colon. Questo protocollo mostra come la normalizzazione del microbioma prima di un intervento di arricchimento ambientale migliori la riproducibilità sperimentale.

Mostriamo anche come ridurre lo stress degli animali e migliorare le interazioni utilizzando un ambiente arricchito. Sebbene ci siamo concentrati sull'effetto dell'arricchimento ambientale in un modello di tumore del colon, il metodo può essere facilmente applicato per comprendere meglio il ruolo del microbioma nell'eziologia della malattia. Allestire le gabbie in condizioni sterili lavorando sotto una cappa ventilata.

I controlli per questo esperimento consistono in gabbie convenzionali con lettiera e tessuto di laboratorio per la nidificazione, ma per il resto mancano di dispositivi di arricchimento. Per allestire le gabbie per l'allevamento dei cuccioli o le gabbie arricchite dal punto di vista ambientale, collegare due grandi gabbie autoclavate con un tunnel sterilizzato fissato da occhielli e includere una piattaforma sterilizzata in ciascuna gabbia per aumentare lo spazio sul pavimento. Per EE, fornire anche ruote da corsa sterilizzate, tunnel, igloo, capanne, palle da gattonare e materiale di nidificazione.

Posizionare sia la gabbia arricchita che quella di controllo nello stesso rack per garantire una ventilazione uniforme. Per l'allevamento, combina un toro e due potenziali madri in gabbie normali. Ogni mattina, controlla la presenza di tappi vaginali che indicano che l'animale si è accoppiato durante la notte.

Se non si vede un tappo, la resistenza al sondaggio vaginale può rilevare un tappo internalizzato. Se una femmina ha un tappo vaginale, trasferiscila in una grande gabbia per l'allevamento dei cuccioli. Fino a 12 madri gravide possono essere alloggiate nelle gabbie ecologiche con piattaforme, a condizione che tutte prevedano il parto durante la stessa settimana.

Quando i cuccioli hanno dai 21 ai 28 giorni, distribuire i maschi e le femmine per genotipo in ambienti di controllo o ambienti arricchiti. Assicurati di mantenere una proporzione di ogni genotipo in ogni gabbia. Le gabbie non modificate possono supportare fino a cinque topi, mentre le gabbie arricchite richiedono almeno 20 topi per la stimolazione sociale e possono supportare fino a 41 topi.

Inizia a raccogliere le feci uno o due giorni prima dell'eutanasia dei topi. Raccogli sempre alla stessa ora del giorno. Per raccogliere le feci dagli animali vivi, strofinare con cura l'animale su una gabbia pulita.

Quindi raccogliere le feci defecate utilizzando una pinza sterile e trasferirle in una provetta sterile per microfuge. Se un animale non defeca immediatamente, mettilo in una gabbia pulita e attendi che l'animale defechi, il che può richiedere fino a un'ora. Per raccogliere le feci da un animale soppresso, sezionarle per accedere al colon.

Quindi taglia il colon appena sotto il cieco e stendilo su un pezzo di carta da filtro. Quindi usa una pinza per sollevare la parte superiore del tubo del colon e apri il lume usando le forbici. Tagliare longitudinalmente da distale a prossimale per aprire il colon nel senso della lunghezza.

Quindi raccogliere le feci dal colon distale in un tubo sterile per microfuge utilizzando una pinza sterile. Conservare i campioni di feci a meno 80 gradi Celsius. Oltre alle feci, raccogli altri campioni di tessuto dal colon e dall'intestino tenue, microsomi, tessuto adiposo e così via.

Utilizza un kit commerciale per isolare il DNA microbico dalle feci seguendo un protocollo di rilevamento dei patogeni delle feci. In questo caso, trasferire i campioni dal congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco e pesarli. Successivamente, imposta una PCR che amplifica il DNA microbico come descritto nel protocollo di testo.

Quindi pulire i prodotti di reazione utilizzando perline magnetiche. Per la pulizia, centrifugare prima brevemente la piastra PCR dell'amplicone per raggruppare i prodotti di reazione. Quindi, agitare le perle magnetiche per disperderle uniformemente e trasferire aliquote da 20 microlitri a ciascun pozzetto di reazione.

Mescolare accuratamente le perle con la soluzione pipettando lentamente l'intero volume 10 volte. Quindi lasciare riposare le perline per cinque minuti. Quindi, posizionare la piastra PCR su un supporto magnetico e attendere due minuti affinché i surnatanti si liberino dopo la raccolta magnetica delle perline.

Quindi rimuovere e scartare i surnatanti. Successivamente, con la piastra ancora sul magnete, riempi ogni pozzetto di perline con 200 microlitri di etanolo fresco all'80% e attendi 30 secondi. Quindi rimuovere con cura il surnatante.

Ripeti questa fase di lavaggio una volta e lascia asciugare le perline all'aria per 10 minuti. Ora eluire i prodotti di reazione dalle perle rimuovendo la piastra dal supporto magnetico e aggiungendo 52,5 microlitri di Tris a ciascun pozzetto. Mescolare completamente le perle in soluzione pipettando lentamente l'intero volume 10 volte.

Quindi raccogliere le perle sul supporto magnetico come prima e trasferire 50 microlitri di surnatante su una piastra PCR pulita. Copri la piastra con un adesivo trasparente e conservala a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Utilizzare il surnatante raccolto per eseguire una PCR indice per allegare i codici a barre alla sequenza dell'adattatore.

Quindi purificare i prodotti e preparare la libreria indicizzata per il sequenziamento. Nei topi, l'arricchimento ambientale è noto per migliorare la durata della vita e la riparazione delle ferite tumorali. Per definire il ruolo del microbiota in questo fenotipo, gli animali riproduttori sono stati integrati nella colonia di topi per almeno un mese per normalizzare il microbiota.

Poi sono stati allevati e la loro progenie è stata allevata in un ambiente arricchito o in un ambiente normale. La progenie era anche portatrice di tumore o wild type. Dopo 16 settimane, gli animali sono stati soppressi e sono stati raccolti campioni di feci per isolare il DNA microbico.

Successivamente, la PCR è stata utilizzata per amplificare la subunità ribosomiale 16S nei campioni per esaminare i componenti del microbioma. I prodotti di reazione sono stati quindi identificati utilizzando l'indicizzazione dei codici a barre. È interessante notare che gli ambienti migliorati non migliorano la biodiversità negli animali di tipo selvatico, ma aumentano notevolmente la biodiversità negli animali portatori di tumore.

Ciò dimostra la sensibilità del metodo. Questo aumento della biodiversità è stato attribuito a una maggiore presenza del phylum Proteobacteria, con aumenti significativi nelle classi alphaproteobacteria e betaproteobacteria e una diminuzione dei gammaproteobacteria patogeni. Il maggiore aumento nella classe dei betaproteobatteri è stato nel genere Sutterella, un probabile commensale coinvolto nella degradazione delle immunoglobuline A secrete.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modificare le pratiche di allevamento per normalizzare il microbioma tra gli animali da esperimento prima di iniziare con i tuoi interventi di interesse. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricorda che gli animali hanno stabilito il loro territorio all'interno dell'ambiente. Per questo motivo, i cambiamenti nell'ambiente possono causare stress che influenzerà il microbioma dell'animale.

Un improvviso cambiamento nel comportamento dell'animale è un segno fisico di stress. Seguendo questa procedura, microbi specifici possono essere isolati e ulteriormente caratterizzati per testare la sufficienza del microbo identificato sulla progressione della malattia.