Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la morfologia e la funzionalità dei leucociti all'interno del fegato durante lo shock settico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere video diretti dei leucociti all'interno del fegato. Prima dell'intervento chirurgico, utilizzare etanolo al 70% per disinfettare il tavolo operatorio e tutti gli strumenti.

Quindi impostare gli strumenti per la chirurgia epatica e regolare la piastra riscaldante a 37 gradi Celsius. Dopo aver anestetizzato i topi iniettati con LPS o PBS secondo il protocollo di testo, applicare una piccola quantità di unguento per gli occhi per evitare che la retina si secchi. Usa un rasoio e una crema depilatoria per rimuovere i peli intorno all'addome.

Quindi usa una garza bagnata per pulire l'addome. Durante l'esecuzione di un'iniezione retro-orbitale utilizzando una siringa da insulina, iniettare 200 microlitri di soluzione di destrano rosso del Texas. Utilizzare un pennarello per contrassegnare l'area sottocostale destra dal processo xifoideo alla fine della costola.

Quindi applicare lo iodio povidone sull'addome del topo per prevenire l'infezione secondaria. Usa pinze e forbici per tagliare l'epidermide. Successivamente, utilizzando micro forbici e pinze, apri la cavità addominale ed esponi con cura il fegato.

Usa dei tamponi di cotone per stendere il lobo laterale sinistro. Quindi versare 500 microlitri di PBS sterile sulla cavità addominale per evitare che il fegato si secchi. Posiziona il mouse nella giusta posizione di decubito in una camera progettata su misura e applica una piccola quantità di colla tissutale sul letto di silicone.

Quindi utilizzare tamponi di cotone per attaccare con cura il fegato. Il tessuto epatico è estremamente friabile. Non utilizzare mai strumenti affilati o pesanti durante l'esposizione e l'impugnazione del fegato.

Pochi secondi dopo, bagnare nuovamente il fegato con 500 microlitri di PBS sterile per evitare che si secchi. Quindi posiziona la struttura metallica sul fegato e usa i dadi per fissarla saldamente. Posizionare sempre i dadi di supporto prima di posizionare il telaio metallico.

Ciò contribuirà a ridurre la pressione del telaio metallico. Per eseguire l'imaging intravitale del fegato, eseguire il software Zen per accendere il laser. Impostare la lunghezza d'onda a 880 nanometri e impostare i canali verde e rosso.

Quindi regolare la potenza del laser in base all'intensità della fluorescenza. Posizionare la camera sul tavolino di imaging e posizionare l'obiettivo a immersione in acqua da 20 potenze vicino al vetro di copertura. Fissare il riscaldatore in gomma siliconica sotto il corpo del mouse per mantenerne la temperatura corporea.

Quindi aspirare 500 microlitri di acqua distillata sul telaio metallico. E poi posizionare la lente dell'obiettivo vicino al fegato. Regolare la messa a fuoco e determinare la profondità e il tempo dell'area di imaging.

Per l'imaging a lungo termine, iniettare mezza dose della miscela di anestetico Zoletil e Rompun preparata in precedenza per ogni ora durante l'imaging per motivi etici. Mantieni la temperatura corporea a 37 gradi Celsius e tieni sempre d'occhio il topo poiché i tempi di anestesia differiscono per ogni topo. Per analizzare i dati, apri Velocity e importa i dati grezzi dalla libreria.

Quindi rimuovi il rumore dall'immagine e scatta un'istantanea. Infine adatta gli elementi modificati al 100% ed esporta i file come file JPEG o TIF per immagini istantanee e file AVI per filmati. L'analisi di imaging intravitale dei topi di controllo ha mostrato che un piccolo numero di neutrofili circolava nel vaso sanguigno.

Mentre il numero di neutrofili era significativamente aumentato nei topi trattati con LPS. In condizioni di LPS molti neutrofili circolavano all'interno del flusso sanguigno ma non migravano all'esterno del vaso. Come si vede in questi filmati, rispetto ai topi di controllo, i neutrofili nei topi trattati con LPS erano più saldamente aderiti alla superficie luminale del vaso, il che rendeva i neutrofili più frequentemente rilevati nel vaso.

Oltre alla motilità dei neutrofili, i macrofagi capsulari epatici, o LCM, nei topi CX3CR1-GFP sono stati osservati sulla superficie del tessuto epatico piuttosto che in profondità all'interno del tessuto. Inoltre, gli LCM hanno mostrato poco movimento o attivazione nel fegato anche nei topi trattati con LPS. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di impostare la linea di incisione dal processo xifoideo alla fine dell'addome sottocostale destro. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'iniezione di trattamento per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui il fegato si riprende da danni e infezioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina per esplorare la reazione dei leucociti durante la sepsi e testare potenziali farmaci.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come esporre un fegato con un'incisione minima dell'addome. Non dimenticare che lavorare con il lipopolisaccaride può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la sterilizzazione e il lavaggio delle mani.